专利名称：：pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及药物释放系统，具体涉及一种pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束及其制备方法。
背景技术：
：肿瘤细胞多药耐药性(multidrugresistance,MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的其他抗肿瘤药物产生交叉耐药性的现象。MDR的形成机制很复杂，既与细胞膜上的多药耐药性相关蛋白(multidrugresistanceassociatedprotein,MRP)、P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、月市多药耐药性相关蛋白(LRP)、乳癌耐药性相关蛋白(BCRP)等膜蛋白有关，同时也与细胞质内的DNA拓扑异构酶II(topoisomerase，TopoII)、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和谷胱甘肽-s-转移酶(glutathione-s-transferase，GST)等酶有关(AmbudkarSV，DeyS，HrycynaCA，RamachandraM，PastanI，Gottesman匪.An皿.Rev.Pharmacol.Toxicol.1999，39，361398;HunterJ，HirstBH.Adv.DrugDeliv.Rev.1997，25，129157;MeschiniS，MarraM，CalcabriniA.Toxicol.InVitro2002，16，389398)。MDR的产生是导致肿瘤化疗失败的主要原因之一，特别是近年来新发现的在肿瘤分化和增殖过程中起到核心作用的肿瘤干细胞(tumorstemcells,TSC)更是普遍具有多药耐药性，因此逆转肿瘤细胞的多药耐药性就成为当前癌症研究和治疗领域亟待解决的重要课题。尽管人们也已发现多种化学药物能够抑制与多药耐药性有关的膜蛋白的活性，然而由于这些药物普遍具有很强的毒副作用从而限制了其临床应用；另一方面，利用基因治疗逆转肿瘤细胞多药耐药性的理论与实践都还远未成熟。因此，目前针对MDR最为可行的对策就是尽可能的增加肿瘤细胞治疗靶点处的药物浓度从而抵消MDR对药物的外排和解毒作用。理想的、能够有效对抗肿瘤细胞多药耐药性的载药体系应当能够定向的富集于肿瘤组织处并随即迅速地释放出所携带的药物从而克服MDR。脂质体和胶束等纳米给药系统可以通过被动、主动或物理化学的作用机制实现肿瘤靶向给药，然而普通的纳米给药系统在释药行为上不具有特异性，药物载体虽然能够聚集在肿瘤部位，但包裹在载体内部的药物却往往不能及时释放出来，这使得治疗效果大打折扣。近年来剌激响应型(Stimuli-responsive)聚合物材料正在吸引研究人员越来越多的目光(JeongB，GutowskaA.Biotechnol.2002，20，305311)，这类聚合物材料能够识别剌激信号，根据信号的强弱做出响应改变自身构象。其中，在肿瘤治疗研究领域最受关注的是能够响应环境PH值变化而改变溶解度的聚合物材料，这主要是基于以下原因绝大部分肿瘤组织周围的环境pH值(6.157.4)都比正常组织周围的生理pH值(7.07.4)低(VaupelP，KallinowskiF，0kunieffP.CANCERRESEARCH1989，49，64496465)，而且细胞中的内涵体与溶酶体中pH值更低(5.06.5)。利用这些特征，如果能够设计合适的pH敏感聚合物作为抗癌药物载体，就有可能实现在肿瘤部位定点释放药物。目前国际上在药物控释和生物材料领域，一些比较知名的研究组在pH响应型聚合物研究中注意力都集中在聚弱碱类聚合物上。Gast，AP等人报导了以聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯(PDEAEMA)为疏水链段的嵌段共聚物的合成及其胶束结构的pH依赖性(LeeAS，ButunV，VamvakakiM，ArmesSP，PopleJA，GastAP.Macromolecules2002，35，85408551);Langer，R小组发展了以P_氨基酯为pH敏感链段的新型聚合物作为药物载体(Ly皿DM，LangerR.J.Am.Chem.Soc.2000，122，1076110768);Bae领导的课题组则在聚组氨酸嵌段共聚物及其给药胶束方面开展了广泛的研究工作(LeeES，NaK，BaeYH.NanoLett.，2005，5，325329)。这些作为药物载体的pH敏感聚合物几乎均为嵌段共聚物，其合成主要采取活性聚合反应，条件苛刻而且往往需要使用相当剂量的重金属作为催化剂看，这些问题使得它们的医疗应用受到很大的限制。
发明内容本发明提供了一种以pH敏感型两亲接枝聚膦腈为载体构建核的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，该给药胶束具有很好的靶向性和药物的释放效果。—种pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，含有pH响应型两亲接枝聚膦腈和至少一种疏水性药物；以药物和pH响应型两亲接枝聚膦腈的总重量计，药物的重量百分含量为0.001%30%，pH响应型两亲接枝聚膦腈的重量百分含量为70%99.999%;所述的疏水性药物为疏水性抗肿瘤药物或者疏水性化疗药物，所述的疏水性抗肿瘤药物优选紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、柔红霉素、甲氨喋呤、丝裂霉素C中的一种或多种，最优选紫杉醇、阿霉素中的一种或两种。所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈以具有生物降解性的聚膦腈链段为骨架，通过向聚膦腈主链上接枝亲水性聚合物链段、pH敏感基团和能够增强聚合物材料与药物亲和力的疏水基团最终构成完整的PH敏感型两亲接枝聚膦腈。所述的亲水性聚合物一般可选用生物相容性好的端氨基聚乙二醇(NH2_PEG)，其结构式如下所述的pH敏感疏水性基团可选用具有叔胺结构的分子团，这类分子在pH值低于一定值时会发生质子化从而实现由疏水到亲水的转变。所述的用来增强材料与药物亲和力的疏水基团可选用可生物降解的氨基酸酯，如N-(乙酸乙酯基)氨基、N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基、N-[3-(l3-吲哚)丙酸乙酯基]-2-氨所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈，具有式(1)所示的结构通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，R1、R2、R3和R4是接枝基团，Rl为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中，n＝20200;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>R2选自pH敏感基团<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>中的一种；R3、R4相同或者不同，选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>以pH响应型两亲接枝聚膦腈的质量计，Rl的质量百分含量为2%94.5%，R2的质量百分含量为5%97%，R3的质量百分含量为090%，R4的质量百分含量为090%。为保证药物胶束具有良好的载药量、控制释放、稳定性、冻干粉的再分散性及聚合物的及时降解性能，所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈的数均分子量为4000100000，优选500050000。pH响应型两亲接枝聚膦腈中Rl的含量越高聚合物水溶性越高，R2含量越高聚合物pH敏感性能越强，其它基团的加入主要是提高胶束与药物的亲和力。作为优选所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈，以pH响应型两亲接枝聚膦腈的质量计，Rl的质量百分含量为60%70%，R2的质量百分含量为5%39%，R3的质量百分含量为034.5%，R4的质量百分含量为034.5%。所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈的分子量分布为1.54.0。所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈，具有式(2)、式(3)或者式(4)所示的结构通式HNOR3V/s^-fsj:=:pt/V^fsj=PR4-O-0CH，ONH匕C——NH，式(2)中，n20(2)200，R3、R4相同或者不同，选自9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式(4)中，n=20200。所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈的合成方法，包括如下步骤(1)主链聚合将氯代膦腈环状三聚体((PNC12)3)在245°C255t:开环聚合反应3小时5小时，制得聚(二氯代膦腈)；(2)接枝反应将上述聚(二氯代膦腈)溶于四氢呋喃中，滴加含有接枝用化合物和三乙胺(TEA)的四氢呋喃(THF)溶液，反应至少8h后，过滤除去不溶物，滤液浓縮后用乙醚沉淀，真空干燥得到白色粉末状的聚合物，即pH响应型两亲接枝聚膦腈；其中，所述的接枝用化合物选用N，N-二异丙基乙二胺(DPA)、l-丁基-4-(甲基氨基)哌啶(PPMA)、2-氨基苯并咪唑(ABI)、l-(3-氨基丙基)咪唑(API)、a-氨基-p-咪唑基丙酸乙酯(即组氨酸乙酯，HiSE)中的一种或多种以及端氨基聚乙二醇(NH2-PEG);或者，所述的接枝用化合物选用N，N-二异丙基乙二胺、l-丁基-4-(甲基氨基)哌啶、2_氨基苯并咪唑、1_(3-氨基丙基)咪唑、a-氨基-13-咪唑基丙酸乙酯中的一种或多种、4-氨基苯甲酸乙酯(EAB)、氨基乙酸乙酯(即甘氨酸乙酯，EtGly)、!3-羟基丙氨酸乙酯(即丝氨酸乙酯，SEE)中的一种或多种以及端氨基聚乙二醇。所述的端氨基聚乙二醇中聚乙二醇的数均分子量优选为3505000，进一步优选11002000，特别优选2000。由于三乙胺量过少会造成反应不完全，过多则导致聚合物沉淀，因此，接枝用化合物与三乙胺的摩尔比优选为1:1。四氢呋喃是溶解范围很大的有机溶剂，可溶解聚(二氯代膦腈)和各种接枝用化合物，作为反应体系的溶剂，其用量对接枝反应没有太大影响，因而不做具体限定。本发明的接枝反应过程须在高度无水的环境中进行，反应温度没有特别的限定，例如常温或者室温均可，对于合成取代基位阻较大的聚合物，在合成反应过程中一般需要进行加热回流反应，更利于反应的进行。根据预先设计的pH响应型两亲接枝聚膦腈上的取代基，所述的接枝化合物优选按照预定的顺序滴加。一般为了在聚(二氯代膦腈)上更加方便地接枝各种预先设计的取代基，可按照预加入取代基的位阻大小，先滴加位阻较大的取代基，再滴加位阻较小的取代基。所述的白色粉末状的聚合物进行纯化处理，其纯化处理包括将白色粉末状的聚合物在水中透析，以除去未反应的2_(聚乙二醇氨基)乙基氨基，可采用透析袋进行透析，11再经冷冻干燥收集产物。以N，N-二异丙基乙二胺为例，N，N-二异丙基乙二胺的结构式如式a所示，其伯胺上脱去一个氢后，接枝到聚膦腈主链的P原子上，成为pH敏感基团(即接枝基团)N-[2-(N'，N'-二异丙氨基)乙基]氨基，其结构式如式b，该基团仅是在N，N-二异丙基乙二胺的伯胺上脱去一个氢。式a式b。其余pH敏感基团也仅是在l-丁基-4-(甲基氨基)哌啶、2-氨基苯并咪唑、1-(3-氨基丙基)咪唑、a-氨基-13-咪唑基丙酸乙酯的伯胺上脱去一个氢形成的，其结构式依次为CH2NH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(N-[3-(l3-吲哚)丙酸乙酯基]-2-氨基)。其它接枝用化合物的基团也仅是在对氨基苯甲酸乙酯、甘氨酸乙酯、丝氨酸乙酯的伯胺上脱去一个氢形成的N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基、N-(乙酸乙酯基)氨基、N-[!3-羟基丙酸乙酯基]氨基，其结构式依次为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束的粒径为10纳米300纳米。所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束可通过薄膜水化法或透析法制备，胶束可以是以水分散液或冻干粉状态存在，其水分散液的制备方法，包括以下步骤将疏水性药物和pH响应型两亲接枝聚膦腈共同溶解在有机溶剂中，形成混合物的溶液，以加热或减压的方式除去有机溶剂后，形成聚合物与药物的均匀薄膜，加入纯水或pH值7.07.4的缓冲盐溶液水化溶解薄膜，得到pH响应型聚膦腈给药胶束溶液。所述的有机溶剂优选甲醇、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷中的一种或多种。所述的缓冲盐溶液选用本领域常用的缓冲盐溶液即可。所述的混合物的溶液中pH响应型两亲接枝聚膦腈的浓度为lmg/ml2g/ml。所述的pH响应型聚膦腈给药胶束溶液的重量百分浓度为1%50%。所述的pH响应型聚膦腈给药胶束溶液经冷冻干燥，可制得pH响应型聚膦腈给药胶束冻干粉。该冻干粉可自分散于水中，形成聚合物药物胶束的水分散液，胶束尺寸一般在10纳米300纳米。以阿霉素为例，所述的含有阿霉素的pH响应型聚膦腈给药胶束，优选，阿霉素重量为阿霉素和PH响应型两亲接枝聚膦腈的总重量的2%30%，pH响应型两亲接枝聚膦腈中聚乙二醇质量占聚合物总质量的40%以上。本发明具有如下优点1)两亲性接枝共聚物中疏水基团通过疏水作用能够有效包载难溶于水的抗癌药物；2)上述制备的载药聚合物胶束冻干粉适用注射给药，而且具有易于储存、运输、应用方便的优点，可根据病人的需要，采用含有不同成分的水进行分散。3)该给药体系最重要的特征是当药物载体到达肿瘤组织周围或被肿瘤细胞吞噬进入内涵体和溶酶体时，由于环境pH值降低，原本处于胶束疏水内核处的pH响应性基团发生质子化，破坏了原有给药胶束的稳定性从而导致胶束解体并将包载的药物在短时间内大量释放出来。通过选取合适的pH敏感基团以及控制其在接枝聚合物中的取代度理论上可以调节聚合物所响应的PH值，这使得该给药体系可以具有十分灵活的释药特征当体系包载的是针对肿瘤细胞表面的抗体或膜蛋白抑制剂时，可以选择能响应肿瘤组织外围环境pH值的聚合物作为载体，而当包载的是需要进入细胞浆或细胞核起作用的药物时则选择响应较低pH值的聚合物作载体。此外，如果在亲水链外端连接肿瘤靶向分子则能进一步提高载体的药物转运效果。基于以上特点，该给药胶束体系有望大幅度提高抗肿瘤药物的治疗效果、逆转肿瘤细胞多药耐药性并能够有效降低毒副作用。4)由于pH响应型两亲接枝聚膦腈的降解特性和与药物的亲和力主要取决于其疏水取代基，因此，通过添加适当的疏水取代基就可以调节胶束的降解特征和载药性能。同时，通过改变载药过程中的方法和参数可以比较容易的控制胶束的载药量和粒径大小，从而可以较容易地满足不同药物和制剂的要求。5)本发明给药胶束的药物释放具有pH响应性，能定点地在肿瘤组织附近或肿瘤细胞内快速释放药物具有逆转肿瘤细胞多药耐药性的功能，同时该两亲性聚膦腈接枝共聚物的生物相容性好毒性极小，适合作为抗肿瘤药物靶向载体。图1、图2均为不同聚合物制备的pH响应型聚膦腈载阿霉素胶束的体外药物释放曲线；其中图1-1代表实施例6制备的Pl载药胶束于在pH=7.4条件下的释放曲线；131-2代表实施例7制备的P2载药胶束于在pH=7.4条件下的释放曲线1-3代表实施例8制备的P3载药胶束于在pH=7.4条件下的释放曲线1-4代表实施例6制备的PI载药胶束于在pH=5.5条件下的释放曲线1-5代表实施例7制备的P2载药胶束于在pH=5.5条件下的释放曲线1-6代表实施例8制备的P3载药胶束于在pH=5.5条件下的释放曲线2-7代表实施例9制备的P4载药胶束于在pH=7.4条件下的释放曲线2-8代表实施例10制备的P5载药胶束于在pH=7.4条件下的释放曲线；2-9代表实施例9制备的P4载药胶束于在pH=5.5条件下的释放曲线；2-10代表实施例10制备的P5载药胶束于在pH=5.5条件下的释放曲线。3为本发明几种具有典型化学结构的pH响应型两亲接枝聚膦腈的核磁共振氢^並l曰；It图位滴定法)。^並l曰^並l曰^並l曰^並l曰It中，谱图3-1为实施例1制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈的核磁共振氢谱；图3-2为实施例2制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈的核磁共振氢谱；图3-3为实施例3制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈的核磁共振氢谱；图3-4为实施例4制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈的核磁共振氢谱；图3-5为实施例5制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈的核磁共振氢谱；4为pH响应型两亲接枝聚膦腈的pH滴定曲线；中，图4-1为实施例1制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈的pH滴定曲线；4-2为实施例2制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈的pH滴定曲线(采用酸式电具体实施例方式实施例1pH响应型两亲接枝聚膦腈合成方法(1)以三氯化铝为催化剂制备聚(二氯代膦腈)称取4g经升华纯化的氯代膦腈环状三聚体和0.2g无水三氯化铝到预先严格清洗干燥的聚合管中，抽真空并封管，聚合反应在25(TC进行5h，待反应物的粘度几乎不变时，停止聚合并取出聚合管冷却。开封聚合管，加入适量干燥甲苯溶液溶解反应物。溶解后用石油醚沉淀，真空干燥得到白色弹性体，即聚(二氯代膦腈)。(2)通过逐步亲核取代反应合成pH响应型两亲接枝聚膦腈共聚物将0.5g上述制得的线形聚(二氯代膦腈)溶于20mlTHF中作为反应体系，向其中缓慢滴加含有2.2gNH厂PEG(分子量为2000)和0.2mlTEA的THF溶液50ml，滴加完后常温反应8h。然后再向其中滴加含有1.lgN，N-二异丙基乙二胺(DPA)和1.0mlTEA的THF溶液lOml。磁力搅拌下室温反应12h后过滤除去不溶物，滤液浓縮后用乙醚沉淀，真空干燥，得到微黄色粉末状的聚合物。利用透析袋(其截留分子量(丽CO)=14000)将所得聚合物在水中透析两天，以除去未反应的NH2-PEG2。。。，并经冷冻干燥收集产物，得到pH响应型两亲接枝聚膦腈共聚物Pl，该共聚物中亲水段端氨基聚乙二醇的质量百分含量为65X，N-[2-(N'，N'-二异丙氨基)乙基]氨基的质量百分含量为31%，其数均分子量为5000，分子量分布2.8，pKa值为6.30。该共聚物的核磁谱图如图3所示，其结构式如下HN其中，n=20200，R3、R4相同或者不同，选自中的一种'实施例2pH响应型两亲接枝聚膦腈合成方法[OO98](1)聚(二氯代膦腈)的制备同实施例1。(2)除了依次向反应体系中缓慢滴加含有2.2gNH厂PEG(分子量为2000)和0.2mlTEA的THF溶液50ml、含有0.5gN，N-二异丙基乙二胺(DPA)和0.5mlTEA的THF溶液10ml以及含有0.7g4-氨基苯甲酸乙酯(EAB)和0.5mlTEA的THF溶液10毫升之外，其余操作均同实施例1中的步骤(2)，得到pH响应型两亲接枝聚膦腈共聚物P2，该共聚物中亲水段端氨基聚乙二醇的质量百分含量为60%，N-[2-(N'，N'-二异丙氨基)乙基]氨基的质量百分含量为15%，N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基的质量百分含量为20%，其数均分子量为5000，分子量分布2.8，pKa值为6.34。该共聚物的核磁谱图如图3所示，其结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式中，n=20200，R3选自/O<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>实施例3pH响应型两亲接枝聚膦腈合成方法(1)聚(二氯代膦腈)的制备同实施例1。(2)除了依次向反应体系中缓慢滴加含有6gNH2-PEG(分子量为2000)和0.6mlTEA的THF溶液50ml、含有0.8gN，N-二异丙基乙二胺(DPA)和O.8mlTEA的THF溶液10ml、含有0.8g4-氨基苯甲酸乙酯(EAB)和0.7mlTEA的THF溶液10毫升以及2.OgP-羟基丙氨酸乙酯(SEE)和1.5mlTEA的THF溶液10毫升，并且每次滴加完一类原料后常温反应8h之外，其余操作均同实施例1中的步骤(2)，得到pH响应型两亲接枝聚膦腈共聚物P3，该共聚物中亲水段端氨基聚乙二醇的质量百分含量为70%，N-[2-(N'，N'-二异丙氨基)乙基]氨基的质量百分含量为10%，N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基的质量百分含量为6X，N-[13-羟基丙酸乙酯基]氨基的质量百分含量为4%，其数均分子量为6600，分子量分布3.0，pKa值为6.50。该共聚物的核磁谱图如图3所示，其结构式如下<vv<w-n=pn==p""^^式中，n二20200。实施例4pH响应型两亲接枝聚膦腈合成方法[O109](1)聚(二氯代膦腈)的制备同实施例1。(2)除了依次向反应体系中缓慢滴加含有4gNH2-PEG(分子量为2000)和0.4mlTEA的THF溶液50ml以及含有1.OgN，N_二异丙基乙二胺(DPA)和1.OmlTEA的THF溶液lOml，并且每次滴加完一类原料后常温反应12h之外，其余操作均同实施例1中的步骤(2)，得到pH响应型两亲接枝聚膦腈共聚物P4，该共聚物中亲水段端氨基聚乙二醇的质量百分含量为80X，N-[2-(N'，N'-二异丙氨基)乙基]氨基的质量百分含量为15%，其数均分子量为IIOOO，分子量分布2.O，pKa值为6.32。该共聚物的核磁谱图如图3所示，其结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中，n=20200，R3、R4相同或者不同，选自中的一种。实施例5pH响应型两亲接枝聚膦腈合成方法(1)聚(二氯代膦腈)的制备同实施例1。(2)除了依次向反应体系中缓慢滴加含有2.2gNH2-PEG(分子量为2000)和0.2mlTEA的THF溶液50ml、含有0.2gN，N-二异丙基乙二胺(DPA)和0.2mlTEA的THF溶液10ml以及含有l.lg4-氨基苯甲酸乙酯(EAB)和0.9mlTEA的THF溶液10ml，并且每次滴加完一类原料后常温反应10h之外，其余操作均同实施例1中的步骤(2)，得到pH响应型两亲接枝聚膦腈共聚物P5，该共聚物中亲水段端氨基聚乙二醇的质量百分含量为64X，N-[2-(N'，N'-二异丙氨基)乙基]氨基的质量百分含量为5X，N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基的质量百分含量为30%，其数均分子量为10000，分子量分布3.0，pKa值为6.40。该共聚物的核磁谱图如图3所示，其结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式中，n=20200，R3选自实施例6给药胶束的制备(l)Pl聚合物载药胶束的制备和表征将30mg实施例l制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈Pl与6mg阿霉素一起溶于20mL二氯甲烷，装入茄形瓶中用旋转蒸发仪于40摄氏度减压条件挥干有机溶剂，得到药物与共聚物的均匀薄膜，加入10ml纯水将薄膜溶解并用0.45Pm滤膜过滤，得到清液即为pH响应型两亲接枝聚膦腈P1阿霉素给药胶束(P1-D0X)的水分散液，该水分散液冷冻干燥得pH响应型聚膦腈载阿霉素胶束冻干粉。用动态光散射法测定胶束的粒径，所得到的药物胶束的性质见表2。(2)聚合物载药胶束(P1-D0X)体外释放实验称取上述制备的pH响应型聚膦腈载阿霉素胶束冻干粉5mg，在透析袋中用10mlpH=7.4或pH=5.5的磷酸盐缓冲液溶解，然后置于20mlpH=7.4或pH=5.5磷酸盐缓冲液中进行体外释放实验，搅拌。隔一定时间取透析袋外的磷酸盐缓冲液，用紫外吸收光谱法分析其中药物含量，同时补充等量的新鲜磷酸盐缓冲液，结果如图1所示，可以看到在低pH值环境(pH=6.04.0)中载药胶束的释药速度大大提高。(3)聚合物载药胶束(P1-D0X)的细胞毒性本发明以乳腺癌耐药细胞(MCF7/ADR)为模型细胞，评价未载药的pH响应型两亲接枝聚膦腈PI胶束(PI聚合物胶束)及P1-D0X的细胞毒性。具体方法为以乳腺癌耐药细胞(MCF7/ADR细胞)为模型细胞，在96孔细胞培养板中，每孔加入100iil含1X1QS个MCF7/ADR细胞的培养液，置于5X(体积百分比)。02，37t:培养箱中培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞中加入不同浓度的P1聚合物胶束溶液、P1-D0X溶液及游离阿霉素水溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设4复孔。正常RMPI16401640培养液继续培养24小时，每孔加入5mg/mL的3_(4，5_二甲基噻唑_2)_2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)31.5iU，置5XC02，37"培养箱中培养4小时弃去上清液，每孔加入200iU二甲基亚砜溶液，用酶标仪测定吸光值，计算细胞抑制率。细胞抑制率计算公式如下细胞抑制率(％)=(空白对照组吸光值-实验组吸光值)/空白对照组吸光值X100%经测定，P1聚合物胶束对二种细胞的细胞毒性非常小，在P1聚合物浓度为lmg/ml的条件下经48小时的作用后细胞的存活率依然在85%以上，细胞毒性为0级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束(P1-D0X)溶液及游离阿霉素对MCF7/ADR细胞的IC5。见表3，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。表2不同聚合物制备的载药聚合物胶束的性质聚合物编号平均粒径(nm)载药量(%)包封率(%)PlPI-D0X19210.263P2P2-D0X28012.676P3P3-D0X29012.777P4P4-D0X27116.197P5P5-D0X11316.096表3处方IC50(iig/ml)MCF7/ADR游离阿霉素水溶液8.45P1-D0X0.63实施例7给药胶束的制备(1)P2聚合物载药胶束的制备和表征，除了采用实施例2制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈P2之外，其余操作同实施例6中的步骤(1)，所得到的药物胶束的性质见表2。(2)P2聚合物载药胶束(P2-D0X)体外释放实验，操作同实施例6中的步骤(2)，结果如图1所示，可以看到在低PH值环境(pH=6.04.0)中载药胶束的释药速度大大提高。19(3)聚合物载药胶束(P2-D0X)的细胞毒性方法同实施例6中的步骤(3)。经测定，P2聚合物胶束对二种细胞的细胞毒性非常小，在P2聚合物浓度为lmg/ml的条件下经48小时的作用后细胞的存活率依然在100%以上，细胞毒性为0级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(P2-D0X)及游离阿霉素对MCF7/ADR细胞的IC5。见表4，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。表4处方IC50(iig/ml)MCF7/ADR游离阿霉素溶液8.45P2-D0X0.13实施例8给药胶束的制备(1)P3聚合物载药胶束的制备和表征，除了采用实施例3制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈P3之外，其余操作同实施例6中的步骤(1)，所得到的药物胶束的性质见表2。(2)P3聚合物载药胶束(P3-D0X)体外释放实验，操作同实施例6中的步骤(2)，结果如图1所示，可以看到在低PH值环境(pH=6.04.0)中载药胶束的释药速度大大提高。(3)聚合物载药胶束(P3-D0X)的细胞毒性方法同实施例6中的步骤(3)。经测定，P3聚合物胶束对二种细胞的细胞毒性非常小，在P3聚合物浓度为lmg/ml的条件下经48小时的作用后细胞的存活率依然在90%以上，细胞毒性为0级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(P3-D0X)及游离阿霉素对MCF7/ADR细胞的IC5。见表5，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。表5处方IC50(iig/ml)MCF7/ADR游离阿霉素溶液8.45P3-D0X0.85实施例9给药胶束的制备(1)P4聚合物载药胶束的制备和表征，除了采用实施例4制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈P4之外，其余操作同实施例6中的步骤(1)，所得到的药物胶束的性质见表2。(2)P4聚合物载药胶束(P4-D0X)体外释放实验，操作同实施例6中的步骤(2)，结果如图2所示，可以看到在低pH值环境(pH=6.04.0)中载药胶束的释药速度大大提高。(3)聚合物载药胶束(P4-D0X)的细胞毒性方法同实施例6中的步骤(3)。经测定，P4聚合物胶束对二种细胞的细胞毒性非常小，在P4聚合物浓度为lmg/ml的条件下经48小时的作用后细胞的存活率依然在95%以上，细胞毒性为0级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(P4-D0X)及游离阿霉素对MCF7/ADR细胞的IC5。见表5，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例10给药胶束的制备(1)P5聚合物载药胶束的制备和表征，除了采用实施例5制备的pH响应型两亲接枝聚膦腈P5之外，其余操作同实施例6中的步骤(1)，所得到的药物胶束的性质见表2。(2)P5聚合物载药胶束(P3-D0X)体外释放实验，操作同实施例6中的步骤(2)，结果如图2所示，可以看到在低pH值环境(pH=6.04.0)中载药胶束的释药速度大大提高。(3)聚合物载药胶束(P5-D0X)的细胞毒性方法同实施例6中的步骤(3)。经测定，P5聚合物胶束对二种细胞的细胞毒性非常小，在P5聚合物浓度为lmg/ml的条件下经48小时的作用后细胞的存活率依然在88%以上，细胞毒性为0级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(P5-D0X)及游离阿霉素对MCF7/ADR细胞的IC5。见表5，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。此外，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。权利要求一种pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，其特征在于，所述的给药胶束中含有pH响应型两亲接枝聚膦腈和至少一种疏水性药物；以药物和pH响应型两亲接枝聚膦腈的总重量计，药物的重量百分含量为0.001％～30％，pH响应型两亲接枝聚膦腈的重量百分含量为70％～99.999％；所述的疏水性药物为疏水性抗肿瘤药物或者疏水性化疗药物；所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈具有式(1)所示的结构通式其中，R1、R2、R3和R4是接枝基团，R1选自式中，n＝20～200；R2选自中的一种；R3、R4相同或者不同，选自中的一种。FSA00000045136300011.tif,FSA00000045136300012.tif,FSA00000045136300013.tif,FSA00000045136300021.tif,FSA00000045136300022.tif,FSA00000045136300023.tif2.如权利要求1所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，其特征在于，以pH响应型两亲接枝聚膦腈的质量计，Rl的质量百分含量为2%94.5%，R2的质量百分含量为5%97%，R3的质量百分含量为090%，R4的质量百分含量为090%。3.如权利要求2所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，其特征在于，以pH响应型两亲接枝聚膦腈的质量计，所述的PH响应型两亲接枝聚膦腈中Rl的质量百分含量为60%70%，R2的质量百分含量为5%39%，R3的质量百分含量为034.5%，R4的质量百分含量为034.5%。4.如权利要求1所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，其特征在于，所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈的数均分子量为4000100000;或者，所述的PH响应型两亲接枝聚膦腈的分子量分布为1.54.0。5.如权利要求1所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，其特征在于，所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈具有式(2)、式(3)或者式(4)所示的结构通式"，R4NHLo.0oN-0CH，(2)式(2)中，n=20200，R3、R4相同或者不同，选自丽NH(3)式(3)中，n=20200，R3选自Ho-0、、CH，o3p——NHR——p-N<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(4)式(4)中，n=20200。6.如权利要求1所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，其特征在于，所述的疏水性抗肿瘤药物选用紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、柔红霉素、甲氨喋呤、丝裂霉素C中的一种或多种。7.如权利要求1所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，其特征在于，所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束的粒径为10纳米300纳米。8.如权利要求1所述的pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束的制备方法，包括以下步骤将疏水性药物和PH响应型两亲接枝聚膦腈共同溶解在有机溶剂中，形成混合物的溶液，以加热或减压的方式除去有机溶剂后，形成聚合物与药物的均匀薄膜，加入纯水或pH值为7.07.4的缓冲盐溶液水化溶解薄膜，得到pH响应型聚膦腈给药胶束溶液。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选用甲醇、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷中的一种或多种；或者，所述的混合物的溶液中pH响应型两亲接枝聚膦腈的浓度为lmg/ml2g/ml;或者，所述的PH响应型聚膦腈给药胶束溶液的重量百分浓度为1%50%。10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的pH响应型聚膦腈给药胶束溶液经冷冻干燥，制得pH响应型聚膦腈给药胶束冻干粉。全文摘要本发明公开了一种pH响应型两亲接枝聚膦腈给药胶束，所述的给药胶束中含有pH响应型两亲接枝聚膦腈和至少一种疏水性药物；以药物和pH响应型两亲接枝聚膦腈的总重量计，药物的重量百分含量为0.001％～30％，pH响应型两亲接枝聚膦腈的重量百分含量为70％～99.999％；所述的疏水性药物为疏水性抗肿瘤药物或者疏水性化疗药物。该胶束可通过薄膜水化法或透析法制备，胶束可以是以水分散液或冻干粉状态存在。该胶束的药物释放具有pH响应性，能定点地在肿瘤组织附近或肿瘤细胞内快速释放药物具有逆转肿瘤细胞多药耐药性的功能，同时该两亲性聚膦腈接枝共聚物的生物相容性好毒性极小，适合作为抗肿瘤药物靶向载体。文档编号A61K45/00GK101785865SQ20101011803公开日2010年7月28日申请日期2010年3月4日优先权日2010年3月4日发明者邱利焱,郑程申请人:浙江大学