核重新编程因子的制作方法

专利名称：核重新编程因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有使分化的体细胞重新编程来诱导诱导式多能性干细胞的作用的 核重新编禾呈因子(nuclear reprogramming factor)。
背景技术：
胚胎干细胞(ES细胞)是由人和小鼠的初期胚建立的干细胞，具有能长期进行培 养并维持可以分化成存在于生物体中的所有类型细胞的多能性的特征。人们期待利用该性 质将人ES细胞作为针对帕金森病、青少年糖尿病、白血病等多种疾病的细胞移植疗法的来 源。但是，存在着ES细胞的移植与脏器移植同样会引起排斥反应这样的问题。而且，对于 通过破坏人胚胎建立的ES细胞的利用，出于伦理的观点的反对意见也很多。如果能够诱导 患者自身的分化体细胞脱分化，建立具有接近于ES细胞的多能性和增殖能力的细胞(该细 胞在本说明书中被称为“诱导式多能性干细胞”(iPS细胞)，但也存在被称为“胚胎干细胞 样细胞”或“ES样细胞”的情况)的话，则预期能够利用它们作为没有排斥反应和伦理性问 题的理想的多能性细胞。作为使体细胞核重新编程的方法，已报道了，例如，从将体细胞的核移植到卵细胞 中制备的克隆胚中建立ES细胞的技术(W. S. Hwang等，Science，303，pp. 1669-74，2004 ； W. S. Hwang等，Science, 308, pp. 1777-83，2005 但是，现已清楚了这些论文都是捏造的，而 且已于日后撤下这些论文)。然而，这些技术只是为了建立ES细胞的目的而制备克隆胚，因 此与使用不孕治疗中产生的剩余胚的常规ES细胞相比，伦理的问题反而大。而且，现已报 道了通过使体细胞与ES细胞相融合使体细胞核重新编程的技术(M. Tada等，Curr. Biol.， 11，pp. 1553-1558，2001 ；C. A. Cowan 等，Science, 309, pp. 1369-73，2005)。但是，即使在该 方法中也存在以下问题无法解决由于导致最终使用人ES细胞而产生的伦理性问题。而 且，现已报道了使生长于人中的生殖细胞肿瘤来源的细胞株的提取物和分化细胞反应而使 细胞核重新编程的技术(C. K. Taranger 等，Mol. Biol. Cell, 16, pp. 5719-35，2005)。该方 法，提取物中何种成分诱导重新编程完全不清楚，因此在技术的可靠性和安全性上存在问 题。另一方面，提出了筛选具有使分化的体细胞重新编程来诱导诱导式多能性干细胞 的作用的核重新编程因子的方法(国际公开W02005/80598)。该方法包括以下步骤使含有 在受ECAT(ES cellassociated transcript)基因(ES细胞中特异性表达的基因群ES细 胞相关转录物)的表达调节区域的表达调节位置上存在标记基因的基因的体细胞与被检 物质相接触、研究标记基因表达细胞的出现的有无，选择使该细胞出现的被检物质作为体 细胞的核重新编程因子的候选物。而且，该出版物的实施例6等中公开了使体细胞重新编 程的方法。但是，上述出版物中没有公开实际上鉴定核重新编程因子的报告。
专利文献1国际公开WO 2005/80598

发明内容
本发明的课题在于提供核重新编程因子。更具体的是，本发明的课题在于提供用 于不利用卵细胞、胚和ES细胞而诱导分化细胞的重新编程，简便且再现性强地建立具有与 ES细胞同样的多能性和增殖能力的诱导式多能性干细胞的方法。本发明者为了解决上述的课题进行了积极的研究，使用国际公开WO 2005/80598 中记载的核重新编程因子的筛选方法尝试鉴定核重新编程因子。其结果是，发现了 24种候 选作为与核重新编程相关的基因，确认了它们中的3种基因是核重新编程所必需的基因。 本发明是基于上述发现而完成的。
也就是，根据本发明，提供了一种体细胞的核重新编程因子，其含有下述3种基 因0ct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的产物。根据本发明的优选方式， 提供了含有下述3种基因0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的产物的上述因子。而且，根据其它的优选方式还提供了还含有下述基因S0X家族基因的基因产物 的上述因子，作为更优选的方式，提供了含有SOX2的基因产物的上述因子。而且，如果根据其它的优选方式，提供了含有细胞因子，该细胞因子和Myc家族基 因的基因产物共同存在、或代替Myc家族基因的基因产物。作为更优选方式，提供了细胞因 子为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或干细胞因子(SCF)的上述因子。如果根据特别优选的方式，提供了除Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、 和Sox家族基因的各基因的产物之外，还含有TERT基因的基因产物的体细胞的核重新编程 因子；以及除了 Oct家族基因、Klf家族基因、Myc家族基因、Sox家族基因，和TERT基因的 各基因的产物之外，还含有从由下述的基因SV40大T抗原、HPV16 E6、HPV16E7和Bmil构 成的组中选出的一种以上的基因产物的因子。除了这些因子，还提供了进一步含有选自于下组中的1种以上的基因的基因产物 的上述的因子Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll 禾口 β -连环素(catenin)。而且，如果根据上述发明的其它优选方式，还提供了进一步含有选自于下组中的 1种以上的基因的基因产物的上述的因子，所述组为ECAT1、EsgU Dnmt3L、ECAT8、Gdf3, Soxl5、ECAT15-l、Fthll7、Sall4、Rexl、UTFl、Stella、Stat3和 Grb2。从其它的观点出发，本发明提供了通过体细胞的核重新编程制备诱导式多能性干 细胞的方法，该方法包括使上述的核重新编程因子与体细胞接触的步骤。如果根据本发明的优选方式，提供了包括在体细胞的培养物中添加上述的核重新 编程因子的步骤的上述方法；包括在体细胞中导入编码上述的核重新编程因子的基因的步 骤的上述方法；包括使用含有至少1种以上的编码上述核重新编程因子的基因的重组载体 将该基因导入体细胞中的步骤的上述方法；和使用从患者中采集的体细胞作为体细胞的上 述方法。再从其它的观点出发，本发明提供了由上述方法获得的诱导式多能性干细胞。而 且，本发明还提供了诱导上述的诱导式多能性干细胞分化而得到的体细胞。而且，根据本发明，还提供了一种干细胞疗法，该方法包括将对诱导式多能性干细 胞进行分化诱导而获得的体细胞移植到该患者中的步骤，所述诱导式多能性干细胞是通过使用从患者中分离和采集的体细胞用上述方法获得的。而且，本发明 还提供了使用对由上述方法获得的诱导式多能性干细胞进行分化诱 导而获得的各种细胞来评价化合物、药物、毒物等的生理作用和毒性的方法。而且，本发明提供了一种改善细胞的分化能力和/或增殖能力的方法，该方法包 括使上述的核重新编程因子与细胞接触的步骤，以及提供了由上述方法获得的细胞和对由 上述方法获得的细胞进行分化诱导而得到的体细胞。通过使用由本发明提供的核重新编程因子，不利用胚和ES细胞就可以简便且再 现性强地诱导分化细胞核的重新编程，可以建立与ES细胞具有同样的分化和多能性和增 殖能力的未分化细胞-诱导式多能性干细胞。例如、使用本发明的核重新编程因子能够由 患者自身的体细胞制备具有高增殖能力和分化多能性的诱导式多能性干细胞，通过使该细 胞分化而获得的细胞(例如心肌细胞、胰岛素产生细胞、或神经细胞等)可以应用于针对心 力衰竭、胰岛素依赖性糖尿病、帕金森病和脊髓损伤等多种疾病的干细胞移植疗法中，由此 可以回避使用人胚的伦理问题以及移植后的排斥反应，因此极为有用。而且，可以使诱导式 多能性干细胞分化的各种细胞(例如心肌细胞、肝细胞等)，作为用于评价化合物、药物、毒 物等的药效和毒性的系统极为有用。附图简述

图1是表示使用在Fbxl5基因中敲入了 β geo的小鼠的胎儿成纤维细胞(MEF)的 重新编程因子的筛选方法的图。图2是表示通过导入表4中所示的24个基因而获得的iPS细胞的形态的照片。还 显示了分化细胞(MEF)和正常的胚胎干细胞(ES)的形态作为对照。图3是表示iPS细胞中标记基因的表达的图。显示了以从iPS细胞、ES细胞和MEF 细胞中提取的总RNA作为模板进行RT-PCR获得的结果。图4是表示iPS细胞中DNA甲基化状态的图。对从iPS细胞、ES细胞、和MEF细 胞提取的基因组DNA进行亚硫酸盐处理，对目的DNA进行PCR扩增后，插入于质粒。每个基 因分离出10个克隆的质粒，测定序列。甲基化CpG用黑点表示，非甲基化CpG用白点表示。图5是表示通过24个基因的群、和从24个基因的群中每次除去1个基因后的23 个基因的群的导入获得的G418抗性细胞的克隆数的图。图下侧表示G418选择后一周内获 得的集落数，图上侧表示3周内获得的集落数。当除去用四方形围起来的基因(基因的编 号与表1所示的相同)时，完全没有获得集落，或是在3周后只发现少数集落。图6是表示通过10个基因的群、和从10个基因的群中每次除去1个基因后的9 个基因的群的导入而获得的G418抗性细胞的集落数的图。除了 #14、#15、或#20的各基因 时一个集落都没有获得。当除去#22的基因时，获得了少数的G418抗性集落，但是细胞呈 现出分化的形态，其明显与iPS细胞不同。图7是表示由10个基因的群、4个基因的群、3个基因的群、或2个基因的群产生 的G418抗性集落(重新编程集落)的出现数的图。显示了各集落的代表性形态及大小。图8是表示对将MEF来源的iPS细胞移植到裸鼠皮下形成的肿瘤进行苏木精-曙 红(H&E)染色的结果的照片。发现了三胚层系向各种组织的分化。图9是表示通过将成体皮肤成纤维细胞来源的iPS细胞移植到小鼠胚泡中，移植 到假孕小鼠的子宫中制备的胎儿的照片。由上图可知在左侧的胎儿中来源于iPS细胞的细胞(发出绿色荧光)分布于全身。在下图中清楚了同一胎儿的心脏、肝脏、脊髓的几乎全部 细胞为GFP阳性，其源于iPS细胞。图10是表示通过RT-PCR确认ES细胞标记基因的表达的结果的照片。图中，Sox2 minus表示在MEF中导入3个基因而建立的iPS细胞，4ECAT表示在MEF中导入4个基因而 建立的iPS细胞，10ECAT表示在MEF中导入10个基因而建立的iPS细胞，10ECAT皮肤成纤 维细胞表示在皮肤成纤维细胞中导入10个基因而建立的iPS细胞，ES细胞表示小鼠ES细 胞，MEF表示没有进行基因导入的MEF细胞。其下的编号表示克隆编号。图11是表示在由MEF建立iPS细胞中bFGF的效果的图。在常规的饲养细胞(ST0 细胞)(左)和导入了 bFGF表达载体的STO细胞(右)上培养的FbX150gWege。小鼠来源的 MEF中通过逆转录病毒导入4个因子(上部分)或c-Myc以外的3个因子(下部分)。2周 内通过G418进行选择，经晶体蓝染色后，拍照。数字表示集落数。图12是对采用Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的实验进行说明的图。A.分离在中心 含有小鼠Nanog基因的大肠杆菌人工染色体(BAC)，在Nanog的编码环形区域的上游通过重 组插入EGFP-IRES-Pur0盒。B.用改良的BAC制备转基因小鼠。发现GFP的表达局限于胚 泡的内细胞团块和生殖腺中。图13是表示对使用Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的实验进行说明的图。从 Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠的胎儿(受精后13. 5日)中除去头部、内脏和生殖腺，建 立MEF。用细胞分选器进行分析的结果是，即使在Nanog-EGFP-IRES-Puro小鼠来源的 MEF(Nanog)中，与Fbxl50gWfige°小鼠来源的MEF(Fbxl5)和野生型小鼠来源的MEF(Wild) 同样，几乎不存在GFP阳性细胞。图 14 是由 Nanog-EGFP-IRES-Puro 小鼠 MEF(左)禾口 Fbxl50ge。/ege。小鼠 MEF(右) 建立的iPS细胞的照片。分别用嘌呤霉素和G418进行选择。图15是表示iPS细胞的增殖的结果的图。表示将ES细胞、Nanog-EGFP-IRES-Puro 小鼠MEF (左)来源的iPS细胞(Nanog iPS)和Fbxl50geo/figeo小鼠MEF来源的i PS细胞 (Fbx iPS)各10万个分别接种于24孔板中，每3天进行一次传代，测定细胞数的结果。数 字表示加倍时间的平均。图16是表示iPS细胞的基因表达的图。用RT-PCR分析标记基因在MEF、ES细胞、 Nanog-EGFP-IRES-Puro 小鼠 MEF(左)来源的 iPS 细胞(Nanog iPS)禾口 Fbxl50geo/0geo 小鼠 MEF来源的iPS细胞(Fbx iPS)中的表达。下面的数字表示传代数。图17是表示由Nanog iPS细胞形成畸胎瘤的图。显示在裸鼠的背部皮下注射100 万个ES细胞或Nanog iPS细胞，3周后产生的肿瘤的外观(左)和组织图像(右H&E染 色)。图18是表示用Nanog iPS细胞制备嵌合体小鼠的图。将Nanog iPS细胞(克隆 NPMF4EK-24，传代数6)移植于胚泡中，诞生出嵌合体小鼠。由90个移植胚诞生出4只嵌合 体小鼠。图19是表示由Nanog iPS细胞出发的种系传递(germlinetransmission)的图。 对通过图18所示的嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠的交配所诞生的小鼠进行基因组DNA的PCR 分析时，根据在所有的小鼠中存在0ct3/4和Klf4的转基因，确认了种系传递。图20是表示由iPS细胞向神经细胞的分化诱导的图。显示由来源于皮肤成纤维细胞的iPS细胞在体外分化成的神经细胞(上β III微管蛋白阳性)、寡突胶质细胞(左 04阳性)、星形胶质细胞(右GFAP阳性)。图21是表示对不使用药物选择的iPS细胞的建立进行说明的图。在每个IOcm皿 中接种1万至10万个MEF，通过逆转录病毒导入4个因子。对照(Mock)中没有产生集落 (左)，而导入了 4个因子的皿中，除了扁平的转化集落，还获得了与膨胀的iPS细胞相类似 的集落(中央)。一旦将这些细胞传代培养，就获得了与iPS细胞相类似的细胞(右)。图22是表示通过无药物筛选建立的细胞的基因表达的图。从图21中所示的建立 的细胞中提取RNA，用RT-PCR分析ES细胞标记基因的表达。图23是表示人成纤维细胞来源的iPS细胞样细胞的图。显示了通过逆转录病毒 将4个因子的人同源基因导入于人胎儿来源的成纤维细胞中而获得的集落(左)、和2次传 代后的细胞(右)。
图24是表示由人成体皮肤成纤维细胞建立iPS细胞的图。通过逆转录病毒将左边 部分所示的因子导入到用慢病毒感染了小鼠逆转录病毒受体的人成体皮肤成纤维细胞中。 照片表示病毒感染后第8天的相位差图像(物镜xlO)。用于实施发明的最佳方式本发明的核重新编程因子的特征在于含有下述3种基因0ct家族基因、Klf家族 基因和Myc家族基因的各基因的产物，在优选方式中，特征在于除了上述的3种基因之外还 含有Sox家族基因的基因产物。作为确认本发明的核重新编程因子的方法，可以利用例如、国际公开WO 2005/80598中记载的核重新编程因子的筛选方法。通过参照上述出版物的所有公开的内 容，包含于本说明书的公开内容中。本领域人员参照上述出版物筛选核重新编程因子，可以 确认本发明的重新编程因子的存在和作用。例如，可以利用Fbxl5基因座中敲入了 i3geo(i3半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的 融合基因)的小鼠作为容易观察重新编程现象的实验系统。详细内容示于本说明书的实施 例中。小鼠Fbxl5基因是在ES细胞和早期胚等的分化多能性细胞中特异性表达的基因。 在小鼠Fbxl5基因中敲入i3geo的且缺失Fbxl5的功能的同源变异小鼠中，通常没有观察 到包括分化多能性或发生在内的异常的表现型。在该小鼠中，Pgeo受到Fbxl5基因的增 强子和启动子的表达控制，Pgeo在分化的体细胞中不表达，显示出对G418的敏感性。另 一方面，敲入了 Pgeo的同源变异ES细胞显示出对极高浓度(12mg/ml以上)的G418的抗 性。利用该现象，可以构建使体细胞的重新编程可视化的实验系统。利用上述实验系统，可以首先从敲入了 β geo的同源变异小鼠的胎儿(受精后 13.5天)中分离成纤维细胞(Fbxl5ege°〃ge。的MEF)。由于MEF不表达Fbxl5基因，因此也 不表达β geo，表现出对G418的敏感性。可是，一旦该MEF与没有进行基因操作的ES细胞 (仍然呈现对G418的敏感性)相融合，MEF的核进行重新编程的结果是，表达β geo而形成 G418抗性。因此，通过利用该实验系统，可以置换成G418抗性使重新编程现象可视化。可以使用上述的实验系统选择核重新编程因子。作为与核重新编程因子相关的基 因的候选物，选择出多个显示出在ES细胞中特异性表达的基因和提示在ES细胞的分化多 能性维持中起重要作用的基因，通过这些候选物单独或适当组合可以确认是否引出核重新 编程。例如，通过组合所有的选择出的初次候选物，确认可以将分化细胞重新编程诱导至接近ES细胞的状态后、制备从前述组合中每次除去1个基因的组合，确认同样的作用，可以选 择该基因不存在时重新编程诱导能力减弱，或重新编程诱导能力丧失的二次候选物。对于 这样选择出的二次候选物，通过重复同样的步骤，可以选择出必需的核重新编程基因的组 合，可以确认Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的3种基因的基因产物的组合作 为核重新编程因子起作用，除了这3种基因的基因产物，还可以确认Sox家族基因的基因产 物的组合作为核重新编程因子具有极好的性质。核重新编程因子的选择方法的具体例子具 体示于本说明书的实施例中，本领域技术人员参照上述的一般的说明和实施例的具体性说 明可以容易地确认这3种基因的组合诱导体细胞的重新编程，和这3种基因产物的组合对 于核重新编程是必需的。由本发明提供的核重新编程因子至少含有Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家 族基因的基因产物的组合，包括例如0ct3/4、Klf4和c-Myc这3种基因的基因产物的组合。 作为Oct家族基因，可以例举例如0ct3/4、0ctlA和0ct6等。0ct3/4是属于POU家族的转 录因子，据报道其是未分化标记(K. Okamoto等，Cell，60，pp461-72，1990)。而且，还有报告 指出0ct3/4与多能性维持相关(J. Nichols等，Cell, 95, pp379_91，1998)。作为Klf家族 基因，可以例举 Klfl、Klf2、Klf4 和 Klf5 等。据报道 Klf4(Kruppel likefactor-4)是肿 瘤抑制因子(A.M. Ghaleb等，Cell Res.，15，pp92_6，2005)。作为Myc家族基因，可以例举 c-Myc,N-Myc和L-Myc等。有报道指出c-Myc是与细胞的分化和增殖相关的转录控制因子 (S. Adhikary, M. Eilers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.，6，pp635_45，2005)，且与多能性维持相 关(P. Cartwright 等，Development，132，pp885_96，2005)。0ct3/4、Klf4 和 c_Myc 以外的 各家族基因的NCBI登录号如下所示。表 1小鼠人 这些基因都是在包括人在内的哺乳类动物中共通存在的基因，为了在本发明中利 用上述基因产物，可以使用任意哺乳类动物来源(例如小鼠、大鼠、牛、绵羊、马、猴等的哺 乳类动物来源)的基因。而且，除了野生型的基因产物外，还可以利用取代、插入和/或缺 失了多个(例如1 10个、优选1 6个、更优选1 4个、更优选1 3个、特别优选1 或2个)氨基酸的，且与野生型的基因 产物具有同样功能的变异基因产物。例如，除了野生 型之外还可以使用稳定型(T58A)等作为c-Myc的基因产物。对于其它的基因产物也是同 样。本发明的核重新编程因子，除了上述3种基因产物之外，可以包括其它的基因产 物。作为这样的基因产物，可以例举Sox家族基因的基因产物。作为Sox家族基因，可以例 举，例如Soxl、Sox3、Sox7、Soxl5、Soxl7、和Soxl8、优选Sox2。至少包括Oct家族基因(例 如0ct3/4)、Klf家族基因(例如Klf4)、Myc家族基因(例如c_Myc)和Sox家族基因(例 如Sox2)这4种基因的基因产物的组合的核重新编程因子，从重新编程的效率的观点出发 是本发明的优选方式，尤其是为了获得多能性，存在优选组合Sox家族基因的基因产物的 情形。Sox2在初期发生过程中表达，是编码转录因子的基因(A.A. Avilion等，Genes Dev.， 17，ppl26-40,2003)。Sox2以外的Sox家族基因的NCBI登录号如下所示。表 2小鼠人 而且，Myc家族基因的基因产物存在可以被细胞因子替代的情况。作为细胞因子， 例如，优选SCF或bFGF等，但不仅限于此。作为更优选方式，除了上述3种基因产物、优选上述4种基因产物外，还可以列举 诱导细胞的永生的因子。例如，可以列举包括TERT基因的基因产物的因子，与包括选自于 下述基因中的1种以上的基因的基因产物的因子的组合SV40大T抗原、HPV16 E6、HPV16E7和Bmil。TERT是DNA复制时用于维持染色体末端端粒结构所必需的，在人中的干细胞和 肿瘤细胞中表达，但是在许多体细胞中没有发现表达(I. Horikawa，等，Proc Natl Acad Sci USA. 102，ppl8437-442, 2005)。据报道，SV40 大 T 抗原、HPV16 E6、HPV16 E7 或 Bmil 通过 与大T抗原组合，导致人体细胞的永生(S. Akimov等，Stem Cells, 23，ppl423_1433，2005 ； P. Salmon等，Mol. Ther.，2，pp404-414，2000)。这些因子，尤其是在由人细胞诱导i PS细 胞时极为有用。TERT和Bmil基因的NCBI登录号如下所示。表3小鼠人 而且，还可以组合选自于下述基因中的1种或2种以上的基因的基因产物Fbxl5、 Nanog, ERas, ECAT15-2, Tcll和β -连环素。出于重新编程的效率的观点，作为特别优选 的方式，可以例举含有将Fbxl5、Nanog、ERas, ECAT15-2, Tcll和β -连环素的基因产物与 上述4种基因产物组合的共计10种基因产物的核重新编程因子。有报道指出Fbxl5 (Y. Tokuzawa 等，Mol Cell Biol.，23，pp2699_708，2003)、Nanog (K. Mitsui 等，Cell，113， pp631-42,2003) >ERas(K. Takahashi, K. Mitsui, S. Yamanaka, Nature,423, pp541-5,2003) 和 ECAT15-2(A. Bortvin 等，Development, 130, ppl673_80，2003)为 ES 细胞特异性表达基 因，Tcll 与 Akt 的活性化相关(A. Bortvin 等，Development，130，ppl673-80，2003)、β-连 环素为Wnt信号传递途径的重要构成因子，与多能性维持相关(N. Sato等，Nat. Med.，10， pp55-63，2004)。而且，本发明的核重新编程因子还可以含有例如、选自于选自于由下述的基因 构成的组中的1种以上的基因的基因产物ECATU EsgU Dnmt3L、ECAT8、Gdf3, Soxl5、 ECAT15-1、Fthll7、Sall4、RexU UTFU Stella、Stat3 禾口 Grb2。ECATU EsgU ECAT8、 Gdf3 和 ECAT15-1 为 ES 细胞特异性表达基因(K. Mitsui 等，Cell, 113, pp631_42，2003)、 Dnmt3L是DNA甲基化酶相关因子，Soxl5是在初期发生过程中表达编码转录因子的一组 基因(M. Maruyama 等，J Biol Chem.，280，pp24371_9，2005)。Fthll7 编码铁蛋白重链多 肽-样 17 (A. colLoriot, T. Boon, C. De Smet, Int J Cancer, 105, pp 371-6，2003)，Sall4 编码在胚胎干细胞中高表达的锌指蛋白质(J. Kohlhase等，Cytogenet Genome Res. ,98, pp274-7, 2002) ,Rexl 编码存在于 0ct3/4 下游的转录因子(E. Ben-Shushan, J. R. Thompson, L. J. Gudas, Y. Bergman, Mol Cell Biol.，18，ppl866_78，1998)。有报道指出 UTFl 是位于 0ct3/4下游的转录辅助因子，一旦抑制它就抑制ES细胞的增殖(A. Okuda等，EMBO J.，17， PP2019-32,1998)。Stat3是细胞增殖 分化的信号因子，通过Stat3的活性化，激起LIF的 运作，对多能性维持起重要的作用(H. Niwa, T. Burdon, I. Chambers, A. Smith, Genes Dev.， 12，pp2048-60，1998)。Grb2编码存在于细胞膜的各种成长因子受体和Ras/MAPK级联之间 进行介导的蛋白质(A.M. Cheng 等，Cell，95，pp 793-803,1998)。不过，可以包含于本发明的核重新编程因子的基因产物不限于上述具体说明的基 因的基因产物。本发明的核重新编程因子中，除了可以作为核重新编程因子起功能的其它基因产物之外，还可以包括1或2种以上的与分化、发生或增殖等相关的因子或具有其它生 理活性的因子，当然这样的实施方式也应理解为包含于本发明的范围中。可以作为核重新 编程因子起作用的其它基因产物，可以使用例如、只使0ct3/4、Klf4和c-Myc这3种基因中 的1种或2种表达的体细胞，通过筛选可以诱导该细胞的核重新编程的基因产物进行鉴定。 通过本发明提供了上述筛选方法作为新的核重新编程因子的筛选方法。而且，包含于本发明的核重新编程因子的基因产物除了例如由上述基因产生的蛋 白质自身之外，还可以是该蛋白质与其它的蛋白质或肽等的融合基因产物的形态。例如，还 可以使用与绿色荧光蛋白质(GFP)的融合蛋白质或与组氨酸标签等肽的融合基因产物。而 且，制备与来源于HIV病毒的TAT肽的融合蛋白质，通过使用该融合蛋白质，可以促进细胞 膜对于核重新编程因子的细胞内摄取，可以回避基因导入等复杂的操作，只在培养基中添 加融合蛋白质就可以诱导重新编程。这种融合基因产物的制备方法是本领域技术人员所熟 知的，因此本领域技术人员根据目的，可以容易地设计适当的融合基因产物并进行制备。使用本发明的核重新编程因子，使体细胞的核重新编程，可以获得诱导式多能性 干细胞。本说明书中所谓“诱导式多能性干细胞”是具有接近于ES细胞的性质的细胞，更 具体的是，包含一种未分化的且具有多能性和增殖能力的细胞，但该用语无论在何种意思 中都不是限定性解释，需要最广义的解释。对于使用核重新编程因子制备诱导式多能性干 细胞的方法，在国际公开W02005/80598中已有说明(上述公报中使用了 ES样细胞这样的 用语)、诱导式多能性干细胞的分离方法也有具体的说明。因此，本领域技术人员通过参照 上述出版物，可以使用本发明的核重新编程因子容易地制备诱导式多能性干细胞。对使用本发明的核重新编程因子由体细胞制备诱导式多能性干细胞的方法没有 特别的限定，如果在体细胞和诱导式多能性干细胞可以增殖的环境中核重新编程因子可以 与体细胞接触，可以采用任意一种方法。例如，可以在培养基中添加包含于本发明的核重新 编程因子中的基因产物，或还可以采用使用含有可以表达本发明的核重新编程因子的基因 的载体将该基因导入体细胞中等方法。使用这种载体时，通过在载体中整合2种以上的基 因，也可以使各个基因产物在体细胞中同时表达。在应当重新编程的体细胞中，包含于本发 明的核重新编程因子中的基因产物中的1种或2种以上已经表达时，可以从本发明的核重 新编程因子中除去该基因产物，这样的实施方式也应理解为包含于本发明的范围中。使用本发明的核重新编程因子制备诱导式多能性干细胞时，对应当重新编程的体 细胞的种类没有特别的限定，可以使用任意的体细胞。例如、除了胎儿期的体细胞之外，也 可以使用成熟的体细胞。在疾病的治疗中使用诱导式多能性干细胞时，理想的是使用从患 者中分离的体细胞，例如，可以使用与疾病相关的体细胞或与疾病治疗相关的体细胞等。对 按照本发明的方法选择在培养基中出现的诱导式多能性干细胞的方法没有特别的限定，例 如，可以适当采用使用药物抗性基因等作为标记基因，以药物抗性作为指标分离诱导式多 能性干细胞等的公知的方法。可以维持ES细胞的未分化性和多能性的培养基或不能维持 该性质的培养基在本领域中已知有多种，通过组合使用适当的培养基，可以有效分离诱导 式多能性干细胞。通过利用对于ES细胞广泛使用的确认手段，本领域技术人员可以容易地 确认分离的诱导式多能性干细胞的分化能力和增殖能力。对用本发明的方法制备的诱导式多能性干细胞的用途没有特别的限定，可以在使 用ES细胞进行的所有的试验 研究和使用ES细胞的疾病的治疗等中进行利用。例如，通过用视黄酸、EGF等增殖因子、或糖皮质激素等处理由本发明的方法获得的诱导式多能性干 细胞，可以诱导所希望的分化细胞(例如神经细胞、心肌细胞、血细胞等)，通过将这样获得 的分化细胞返回到患者中的自身细胞移植可实现干细胞疗法。然而，本发明的诱导式多能 性干细胞的用途不限于上述的特定的方式。
实施例以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的范围不受下述实施例 的限定。例1 重新编程因子的选择为了鉴定重新编程因子，需要容易地观察重新编程现象的实验系统。作为实验系 统，利用在Fbxl5基因座中敲入了半乳糖苷酶和新霉素抗性基因的融合基因)的 小鼠。小鼠Fbxl5基因是在ES细胞和初期胚等分化多能性细胞中特异性表达的基因。然 而，在小鼠Fbxl5基因中敲入了 0 geo的、缺失Fbxl5功能的同源变异小鼠中没有观察到包 括分化多能性和发生在内的异常的表现型。在该小鼠中，0 geo受到Fbxl5基因的增强子和 启动子的表达控制。也就是，0 geo在分化的体细胞中不表达，对G418显示出敏感性。一 方面，敲入了 0 geo的同源变异ES细胞对极高浓度(12mg/ml以上)的G418显示出抗性。 利用该现象，构建使体细胞的重新编程可视化的实验系统。上述实验系统中，首先从敲入了 0geo的同源变异小鼠的胎儿(受精后13.5日) 中分离成纤维细胞(Fbxl5ege°〃ge。的MEF)。由于MEF不表达Fbxl5基因，因此也不表达 3§60，对6418显示出敏感性。另一方面，一旦该MEF与不进行基因操作的ES细胞(仍然 呈现对G418的敏感性)相融合，MEF的核进行重新编程的结果是，表达0 geo而形成G418 抗性。也就是，通过该实验系统，可以使重新编程现象可视化为G418抗性(国际公开TO 2005/80598)。使用上述实验系统进行重新编程因子的探索(图1)，选择出在ES细胞中显 示特异性表达的基因、和提示在ES细胞的分化多能性维持中有重要作用的基因共计24种 作为重新编程因子的候选物。这些基因示于下表4和表5中。而且，就#21的连环素 和#22的c-Myc而言，使用了活性型的变异体(连环素S33Y，c-Myc :T58A)。表 4 表4(续) 表 5NCBI 登录号 表5 (续) 表5 (续) 在逆转录病毒载体pMX-gw中通过Gateway技术插入这些基因的cDNA。首先使 24个基因一个一个地感染Fbxl50ge°〃ge°的MEF，然后，在ES细胞培养条件下进行G418选 择。然而，G418抗性集落一个都没有获得。接着，使所有24个基因的逆转录病毒同时感染 Fbxl5@geo/Bgeo的MEF。在ES细胞培养条件下进行G418选择时，获得了多个药物抗性集落。 分离这些集落继续培养。这些细胞可以长期培养，而且清楚地显示出与ES细胞类似的形态 (图2)。图中，iPS细胞表示诱导式多能性干细胞(也称为ES样细胞、ES-like细胞、ESL 细胞)，ES表示胚胎干细胞，MEF表示分化细胞(胎儿成纤维细胞)。通过RT-PCR研究标记基因的表达，NanOg、0ct3/4等的未分化标记表达了(图3)。 清楚了 Nanog的表达接近于ES细胞，但0ct3/4的表达比ES细胞低。而且，通过亚硫酸盐 测序法确认了 DNA甲基化状态，清楚了 Nanog基因和Fbxl5基因在MEF中处于高甲基化状 态，但在iPS细胞中被脱甲基化(图4)。印记(imprinting)基因-IGF2基因在MEF和iPS 细胞这两者中约50%被甲基化。已知收集了？1^150^{^°的1^，受精后13.5天的原始生 殖细胞中失去印记记忆的IGF2基因几乎被完全脱甲基化，因此得出了 iPS细胞不是来源于 混入Fbxl5egWege。的MEF中的原始生殖细胞的结论。根据以上结果，表示通过24种因子的 组合，可以将分化细胞(MEF)重新编程诱导成接近于ES细胞的状态。然后，对所有24种基因对于重新编程是否必需进行了研究。使每次除去1个基因 的23个基因感染FbX150gWege°的MEF。其结果清楚了，对于10个基因，除去它们的时候， 抑制集落的形成(图5 基因的编号对应于表4中所示的基因的编号，#3、#4、#5、#11、#14、 #15、#18、#20、#21、和#22这10种基因)。使这10种基因同时感染Fbxl50geo/figeo的MEF 时，结果，与使24种基因同时感染时相比，显著更有效地获得了 G418抗性集落。进而，使这10个基因中每次除去1个基因的9个基因感染Fbxl5ege°〃ge。的MEF。 其结果是，发现分别除去4种基因(#14、#15、#20、或#22)时，没形成G418抗性的iPS细胞 集落(图6)。因此提示，10个基因中，这4种基因对于重新编程诱导来说起到了特别重要 的作用。例2 通过4种基因群的组合进行的重新编程诱导对10种基因中提示有特别重要性的4个基因是否可以诱导体细胞的重新编程进 行了研究。在Fbxl5基因中敲入了 0 geo的MEF的细胞中，使用上述10种基因的组合、上述4种基因的组合、上述4种中的仅3种基因的组合和上述4种中的仅两种基因的组合，将这 些基因组合(gene set)通过逆转录病毒导入体细胞中。其结果是在导入了 4种基因时获 得了 160个G418抗性集落。尽管该结果与导入10种基因时的结果(179个集落)几乎数 量相同，但是导入4个基因时，集落比导入10个基因时要小。而且，传代培养这些集落时， 呈现iPS细胞的形态的集落，在导入10个基因时，在12个克隆中有9个克隆，与之相对，在 导入4个基因时，12个克隆中有7个克隆，存在某种程度减少的倾向。作为4个基因，无论 是小鼠来源的基因还是人来源的基因中都获得了数目几乎相同的iPS细胞。导入从上述4个基因中选择出的3个基因时，有个组合(#14、#15和#20)中获得 了 36个扁平的集落，但是即使传代培养也没有观察到iPS细胞。其它的组合(#14、#20、和 #22)中获得了 54个小集落。这些集落中，对较大的6个集落进行次传代培养时，所有6个 克隆都获得了与ES细胞类似的细胞。然而，如果与ES细胞相比，认为细胞与细胞之间以及 与培养皿的粘附弱。而且，细胞增殖的速度，与导入4个基因的情况相比要慢。而且，从4 个基因中选择出3个基因的其它的2组组合中分别形成了各1个集落，但是即使传代培养 也没有发现细胞的增殖。从4个基因中选择出的2个基因的组合(组合6)中，每一种情况 连1个G418抗性集落都没有形成。以上结果示于图7。而且，图10中，表示了通过RT-PCR确认ES细胞标记基因的表达的结果。方法的 详细内容如下所示。从向Fbxl50geo/figeo的MEF中导入3个基因(0ct3/4、Klf4和c-Myc、表 示为Sox2minus)、4个基因(除3个基因之外还加上了 Sox2，表示为4ECAT)、10个基因(除 了 4个基因之外还加上了表4的#3、#4、#5、#11、#18、#21，表示为10ECAT)所建立的iPS 细胞、在有其Fbxl5基因中敲入了 0geo的成体小鼠的尾部皮肤而建立的成纤维细胞中导 入10个基因所建立的iPS细胞(表示为10ECAT皮肤成纤维细胞)、从小鼠ES细胞和没有 导入基因的MEF细胞中纯化总RNA，通过DNasel处理除去混入的基因组DNA。通过逆转录 反应制备第一链cDNA，通过PCR研究ES细胞标记基因的表达。而且，对于0ct3/4、Nanog, ERas，使用不对来自导入的逆转录病毒，而只对来自内源性基因扩增转录产物的引物进行 PCR。引物序列示于表6。表 6 根据此图中所示的结果，清楚了导入3个基因时，ERas和Fgf4被有效诱导表达，但 不引起多能性维持所必需的因子_0ct3/4与Nanog的诱导，或者即使引起也非常弱。另一 方面，导入4个基因时，在检测的4个克隆中，存在有一个0ct3/4和Nanog被较强诱导的克 隆(#7)。进而，在导入10个基因时，研究的5个克隆中，3个克隆中发现了 0ct3/4和Nanog 的强诱导。根据这些结果清楚了，为了重新编程，至少3个基因的组合(#14、#20、和#22)是 必需的，在含有这3种基因的4个基因群和10个基因群中随着基因的数目增加，重新编程 的效率上升。例3 重新编程的细胞的多分化能力的分析为了评价建立的iPS细胞的分化多能性，将通过24个因子、10个因子和4个因子 建立的iPS细胞移植到裸鼠的皮下。其结果是，在所有例子中均形成了与ES细胞同样大小 的肿瘤。以组织学观察，肿块由多种细胞构成，确认有软骨组织、神经组织、肌肉组织、脂肪 组织和肠道样组织(图8)，因此证明了 iPS细胞的多能性。另一方面，一旦将由3个因子建 立的细胞移植到裸鼠中就形成肿瘤，其只由组织学上未分化细胞形成。因而清楚了，为了诱 导分化多能性，Sox家族是必需的。例4 源于成体小鼠的尾部的成纤维细胞的重新编程将用小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)鉴定的4个因子导入来源在Fbxl5基因中敲入 3 geo且在全身表达绿色荧光蛋白质(GFP)的成体小鼠的尾部的成纤维细胞。然后，在饲养 细胞上，在与ES细胞培养条件相同的条件下进行培养，通过G418进行选择。药物选择开始 后约2周内获得了多个iPS细胞集落。一旦将这些细胞移植到裸鼠的皮下，就形成了三胚 层系的各种组织构成的畸胎瘤。而且，将来源于成体皮肤成纤维细胞的iPS细胞移植到胚 泡中，移植到假孕小鼠的子宫中，结果在受精后第13. 5天的胚中发现GFP阳性细胞分布于 全身(图9)。这表明iPS细胞具有多能性，对小鼠胚胎形成有作用。该结果表明鉴定的因 子群不止对胎儿期的体细胞而且对成熟的小鼠的体细胞都具有诱导重新编程的能力。在成 体皮肤来源的细胞中可以重新编程诱导这一点在实用性上极为重要。仿lj 5研究iPS细胞建立中细胞因子的影响。在饲养细胞(ST0细胞)中导入碱性成纤 维细胞生长因子(bFGF)或干细胞因子(SCF)的表达载体(pMX逆转录病毒载体)，建立稳定 表达这些细胞因子的细胞。在这些ST0细胞上培养Fbxl5egWege°小鼠来源的MEF(50万个 /100mm皿)，导入4个因子后，通过G418进行选择时，结果与在常规的ST0细胞上的培养的 情况相比，在产生bFGF(图11)、SCF (数据未显示)的ST0细胞上的集落形成数提高20倍 以上。而且，即使导入c-Myc以外的3个因子，在常规的ST0细胞上没有形成iPS细胞集落， 但是在产生bFGF(图11)、SCF(数据未显示)的ST0细胞上发现集落的形成。根据这些结 果，清楚了通过细胞因子的刺激，由MEF建立iPS细胞的效率提高，和可以通过使用细胞因 子代替从c-Myc使核重新编程成为可能。
例 60ct3/4、Klf4、c_Myc、和Sox2基因都存在家族基因(表1和2)。于是，研究通过 家族基因代替4个基因是否可以建立iPS细胞。表7中公开了 2次实验的汇总的结果。对 于Sox家族而言，Soxl的G418抗性集落数和iPS细胞建立效率，均与Sox2的程度相同。 Sox3的G418抗性集落数是Sox2的十分之一左右，但挑选的集落中的iPS细胞建立效率要 比Sox2高。Soxl5的G418抗性集落数和iPS细胞建立效率都比Sox2低。Soxl7的G418 抗性集落与Sox2程度相同，但是iPS细胞建立效率低。对于Klf家族而言，Klf2产生了比 Klf4更少的G418抗性集落，iPS细胞的建立效率程度相同。对于Myc家族而言，首先确认 了野生型的c-Myc与T58A变异体在G418抗性集落数、iPS细胞建立效率两方面的程度均 相同。而且，N-Myc和L-Myc (都是野生型)，同时在这二者中的c_Myc和G418抗性集落数、 iPS细胞建立效率的程度均相同。表7 例 7用Fbxl5-0geO以外的报告因子研究是否可以建立iPS细胞。首先，分离中心部 位含有Nanog基因的大肠杆菌人工染色体(BAC)，通过大肠杆菌内的重组，敲入GFP基因和 嘌呤霉素抗性基因(图12A)。然后，在ES细胞中导入进行了相同的改良的BAC，确认了形 成未分化状态特异的GFP阳性(数据未显示)。然后，通过移植到相同的ES细胞的小鼠胚 泡中通过嵌合体小鼠制备转基因小鼠。在该小鼠中在胚泡的内部细胞块和受精后第13.5 天胚的生殖腺中特异性发现了 GFP阳性细胞(图12B)。从受精后13. 5天胚(DBA、129和 C57BL/6小鼠的杂种)中除去生殖腺，分离MEF。确认了用流式细胞仪分离的MEF为GFP阴 性(图13)。通过逆转录病毒将4个因子导入于该MEF中，通过嘌呤霉素进行选择时，获得 了多个抗性集落。其中只有约10 20%为GFP阳性。一旦传代培养GFP阳性集落，就呈 现出类似于ES细胞的形态(图14)和增殖(图15)。而且如果观察基因表达，就会清楚相 较于通过G418从Fbxl5egWege°的MEF中选择分离出的iPS细胞，其更接近于ES细胞的表 达模式(图16)。一旦将该细胞移植于裸鼠中，根据形成畸胎瘤，确认了其为iPS细胞(图 17)。而且，通过将经Nanog-GFP选择获得的iPS细胞移植到C57BL/6小鼠的胚泡中诞生了嵌合体小鼠(图18)。而且，通过使该嵌合体小鼠之间交配，确认了种系传递(图19)。在 通过这种Nanog-GFP选择建立的更接近于ES细胞的iPS细胞中，来自于逆转录病毒的4个 因子的表达几乎完全被沉默，这提示自我复制由于内源性的0ct3/4和Sox2而被维持。例 8对10cm汇合的iPS细胞进行胰蛋白酶处理，悬浮于ES细胞用培养基中(悬浮后 10 20分钟通过使ST0细胞粘附于涂覆了明胶的皿，而将其除去)。在涂覆了 HEMA(甲基 丙烯酸-2-羟乙酯)的大肠杆菌培养用皿中悬浮培养2X 106的细胞4天，使之形成胚状体 (EB) (1-4天)。EB形成的第4天(第4天)，将所有EB转移到10cm组织培养用皿中，用ES 细胞用培养基培养24小时使之粘附。24小时后(第5天)，更换成含有ITS/纤连蛋白的 培养基。培养7天(每两天进行培养基更换)、选择脑巢蛋白(nestin)阳性细胞(如果在 无血清下培养，其它谱系的细胞会在一定程度死亡)(第5-12天)。然后进行A2B5阳性细 胞的诱导。7天后(第12天)通过胰蛋白酶处理使细胞分散，除去残存的EB。将1X105个 细胞接种于涂覆了聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白的24孔板上，在含有N2/bFGF的培养基中培养 四天(每两天更换一次培养基(第12-16天)。四天后(第16天)更换成含有N2/bFGF/ EGF的培养基，培养四天(每两天更换一次培养基)(第16-20天)。四天后(第20天) 更换成含有N2/bFGF/PDGF的培养基，培养四天(每两天更换一次培养基)(第20-24天)。 这期间(第12-24天)，在细胞过度增加形成汇合的时候随时传代，接种1 2X105个细 胞(数量由于传代时期而改变)。四天后(第24天)更换成N2/T3培养基，培养7天(第 24-31天)，每两天更换一次培养基。第31天固定，免疫染色。其结果是，确认了由iPS细 胞分化出0 III微管蛋白阳性的神经细胞、04阳性的寡突胶质细胞、GFAP阳性的星形胶质 细胞(图20)。例 9为了由敲入了 Fbxl5_ 3 geo的小鼠以外的任意的小鼠体细胞建立iPS细胞，开发 了不使用药物选择的建立方法。在10cm皿(ST0饲养细胞上)中培养比以上的更少数量(1 万、5万或10万个)的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)，通过逆转录病毒导入对照DNA或4个因 子。在ES细胞培养基中进行2周培养(无G418选择)，在导入了对照DNA的皿中没有发现 集落形成，但在导入了 4个因子的皿中除了被认为是转化的扁平的集落，还形成了多个致 密的集落(图21)。从这些中选择出24个集落，继续培养，发现了 ES细胞样的形态。通过 RT-PCR研究其基因表达，7个克隆中发现了 ES细胞标记-Esgl的表达。而克隆4中发现了 Nanog、ERas、⑶F3、0ct3/4、Sox2等许多ES细胞标记的诱导，因此被认为其是iPS细胞(图 22)。根据以上结果，表明i PS细胞建立中使用Fbxl5-0 geo敲入等的药物选择不是必需 的，由任意的小鼠来源的体细胞可以建立iPS细胞。提示出通过本技术可以由疾病模型小 鼠的体细胞中建立iPS细胞的可能性。例10作为诱导iPS细胞的细胞，研究了成纤维细胞以外的细胞-肝细胞和胃粘膜细胞。 通过灌流从FbX150gWeg 小鼠的肝脏中分离出肝细胞。用逆转录病毒将4个因子施加给该 肝细胞，通过G418进行选择，结果获得了多个iPS细胞集落。通过DNA微阵列对基因表达 模式进行分析的结果是，清楚了肝脏来源的iPS细胞比皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞 来源的iPS细胞更接近于ES细胞。同样，从胃粘膜细胞和肝细胞中也获得了 iPS细胞。
例11已知PD98059为MAP激酶的抑制剂，在许多分化细胞中抑制增殖，但在ES细胞中 促进未分化状态维持和增殖。于是研究了 iPS细胞建立中PD98059的效果。用逆转录病毒 将4个因子施加到由具有Nanog-EGFP-IRES-Puro的选择标记的小鼠建立的MEF中，通过嘌 呤霉素进行选择。不施加PD98059时，在获得的iPS细胞集落中，GFP阳性的比率为8%。 另一方面，逆转录病毒感染的次日开始持续施加PD98059 (终浓度25 u M)的组中，所获得 的集落中的45%为GFP阳性。这可被认为因为PD98059促进GFP阳性的更接近ES细胞的 iPS细胞的增殖，也可能是PD98059抑制GFP阴性的iPS细胞和分化细胞的增殖。因此表 明PD98059可以用于更接近于ES细胞的iPS细胞的建立和不使用药物选择的iPS细胞的 建立中。例12 通过核转染(Nucleofection)将小鼠0ct3/4基因启动子下游整合了红色荧光蛋 白质基因和在PGK启动子下游整合了潮霉素抗性基因的质粒导入于用慢病毒使小鼠同向 性病毒(ecotropic virus)受体-可溶性载体家族7 (Slc7al、NCBI登录号NM_007513)在 胎儿来源的人皮肤成纤维细胞(HDF)中表达的细胞中。通过潮霉素进行选择，建立稳定 表达株。用丝裂霉素处理800000个的细胞，接种在ST0细胞上，次日通过逆转录病毒导入 0Ct3/4、SOX2、Klf4、C-MyC (均来源于人)。挑选3周后获得的集落中的24个(图23左)， 转移到接种了 ST0细胞的24-孔板上进行培养。将2周后逐渐增加的1个克隆传代到接种 了 ST0细胞的6-孔板上进行培养，结果获得了在形态上类似于ES细胞的细胞(图23右)， 提示其为iPS细胞。培养基通常使用小鼠ES细胞用培养基。例13将用慢病毒使Slc7al (小鼠逆转录病毒受体)导入于人成体皮肤成纤维细胞(成 体HDF)的细胞接种于800000个饲养细胞(丝裂霉素处理ST0细胞)上，以以下组合，用逆
转录病1_导入基因。
1.0ct3/4、Sox2、Klf4、(:;-Myc、TERT、SV40 大 T 抗原
2.0ct3/4、Sox2、Klf4、(:-Myc、TERT、HPV16 E6
3.0ct3/4、Sox2、Klf4、(:-Myc、TERT、HPV16 E7
4.0ct3/4、Sox2、Klf4、(:-Myc、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7
5.0ct3/4、Sox2、Klf4、(-Myc、TERT、Bmil(0ct3/4、Sox2, Klf4，c_Myc，TERT 来源于人，Bmil 来源于小鼠)在小鼠Es细胞的培养条件下，继续无药物筛选的培养，在导入了组合1的因子的 皿中，在病毒感染8天后出现了被认为是iPS细胞的集落(图24)。在其它的组合(2至5) 中，尽管没有组合1的情况明显，但出现了 iPS细胞样的集落。当只导入4个因子时，也没 有出现任何集落。产业上应用的可能性通过使用由本发明提供的核重新编程因子，不使用胚和ES细胞就可以简便且再 现性强地诱导分化细胞核的重新编程，可以建立与ES细胞具有同样的分化和多能性和增 殖能力的未分化细胞_诱导式多能性干细胞。本说明书还包括以下内容
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1. 一种体细胞的核重新编程因子，该因子含有下述3种基因0ct家族基因、Klf 家族基因和Myc家族基因的各基因的产物。2.项目1中记载的因子，其含有下述3种基因0ct3/4、Klf4和c-Myc的各基因的产物。3.项目1或2中记载的因子，其还含有下述基因Sox家族基因的基因产物。4.项目3中记载的因子，其含有Sox2的基因产物。5.项目1至4中任意一项中记载的因子，其含有细胞因子，该细胞因子和Myc家族 基因的基因产物共同存在、或者代替Myc家族基因的基因产物。6.项目5中记载的因子，所述细胞因子为bFGF和/或SCF。7.项目1至6任意一项中记载的因子，其还含有下述的基因TERT基因的基因产 物。8.项目1至7任意一项中记载的因子，其还含有选自于由下述的基因构成的组中 的1种以上的基因的基因产物SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16 E7和Bmil。9.项目1至8任意一项中记载的因子，其还含有选自于由下述的基因构成的组中 的1种以上的基因的基因产物:Fbxl5、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcll和3 -连环素。10.项目1至9任意一项中记载的因子，其还含有选自于由下述的基因构成的组 中的 1 种以上的基因的基因产物ECAT1、Esgl、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Soxl5、ECAT15-1、 Fthll7、Sall4、Rexl、UTF1、Stella、Stat3、和 Grb2。11.通过体细胞的核重新编程制备诱导式多能性干细胞的方法，其包括使项目1 至10任意一项中记载的核重新编程因子与该体细胞接触的步骤。12.项目11中记载的方法，所述体细胞为人细胞。13.由项目11或12中记载的方法获得的诱导式多能性干细胞。14.通过诱导项目13中记载的诱导式多能性干细胞分化而得到的体细胞。15. 一种改善细胞的分化能力和/或增殖能力的方法，该方法包括使项目1至10 任意一项中记载的核重新编程因子与细胞接触的步骤。16.项目15中记载的方法，所述细胞为人细胞。17.由项目15或16中记载的方法获得的细胞。18.通过诱导项目17中记载的细胞分化而得到的体细胞。
权利要求
一种诱导式多能性干细胞，其特征在于下述的(i)-(iii)(i)衍生自体细胞；(ii)不使用生殖细胞或者胚胎干细胞即可获得；和(iii)具有多能性和生长能力。
2.一种诱导式多能性干细胞，其可通过将选择的核重新编程因子导入到体细胞获得。
3.根据权利要求1或2的诱导式多能性干细胞，其中的体细胞是人细胞。
4.根据权利要求1或2的诱导式多能性干细胞，其表达内源性Oct3/4基因和Nanog基因。
5.根据权利要求2的诱导式多能性干细胞，其中的重新编程因子包含在胚胎细胞中 表现出特异性表达的基因，或在维持胚胎细胞的多能性中具有重要作用的基因。
6.根据权利要求2的诱导式多能性干细胞，其中的重新编程因子包含至少0ct3/4基因。
7.根据权利要求6的诱导式多能性干细胞，其中的重新编程因子包含选自0ct3/4基 因、Sox2基因、c-Myc基因和Klf4基因的两个基因。
8.根据权利要求7的诱导式多能性干细胞，其中的重新编程因子包含选自0ct3/4基 因、Sox2基因、c-Myc基因和Klf4基因的三个基因。
9.根据权利要求8的诱导式多能性干细胞，其中的重新编程因子包含0ct3/4基因、 Sox2基因、c-Myc基因和Klf4基因。
10.制备诱导式多能性干细胞的方法，其包括下述的步骤(i)-(iv) (i)将重新编程因子导入到体细胞；( )在培养基中培养在步骤(i)中获得到细胞以产生表达内源性0ct3/4基因和 Nanog基因的细胞；(iii)选择在步骤(ii)中产生的具有胚胎干细胞样形态学的细胞；和(iv)进一步在培养基中培养在步骤(iii)中选择的细胞。
11.根据权利要求10的方法，其中的体细胞是人细胞。
12.根据权利要求10的方法，其中的重新编程因子包含在胚胎细胞中表现出特异性 表达的基因，或在维持胚胎细胞的多能性中具有重要作用的基因。
13.根据权利要求12的方法，其中的重新编程因子包含至少0ct3/4基因。
14.根据权利要求13的方法，其中的重新编程因子包含选自0ct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因的两个基因。
15.根据权利要求14的方法，，其中的重新编程因子包含选自0ct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因的三个基因。
16.根据权利要求15的方法，其中的重新编程因子包含0ct3/4基因、Sox2基因、c-Myc 基因和Klf4基因。
17.重新编程因子在制备诱导式多能性干细胞中的用途，其中的诱导式多能性细胞来 自体细胞。
18.根据权利要求17的用途，其中的重新编程因子包含在胚胎细胞中表现出特异性 表达的基因或对应的基因产物，或在维持胚胎细胞的多能性中具有重要作用的基因或对应 的基因产物。
19.根据权利要求18的用途，其中的重新编程因子包含至少Oct3/4基因或者Oct3/4 基因产物。
20.根据权利要求19的用途，，其中的重新编程因子包含选自Oct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因的两个基因或其对应的基因产物。
21.根据权利要求20的用途，其中的重新编程因子包含选自Oct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因的三个基因或其对应的基因产物。
22.根据权利要求21的方法，其中的重新编程因子包含Oct3/4基因、Sox2基因、 c-Myc基因和Klf4基因；或Oct3/4基因产物、Sox2基因产物、c_Myc基因产物和Klf4基因 产物。
23.用于制备体细胞的方法，其包括诱导权利要求1-9的诱导式多能性干细胞分化的步骤。
24.用于评价化合物、药物或毒药的生理功能、功效或毒性的方法，包括使用通过诱导 权利要求1-9的诱导式多能性干细胞分化可获得的细胞。
25.细胞在制备用于干细胞移植治疗的化合物中的用途，其中所述细胞是通过诱导权 利要求1-9的诱导式多能性干细胞分化而获得的细胞。
全文摘要
作为用于不利用胚和ES细胞而诱导分化细胞的重新编程，简便且再现性强地建立具有与ES细胞同样的多能性和增殖能力的诱导式多能性干细胞的方法，本发明提供了含有下述3种基因Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的各基因的产物的体细胞的核重新编程因子。
文档编号A61L27/38GK101864392SQ20101012618
公开日2010年10月20日 申请日期2006年12月6日 优先权日2005年12月13日
发明者山中伸弥 申请人:国立大学法人京都大学