专利名称：：一种改善微胶囊血液相容性的方法
技术领域：
：本发明涉及一种改善微胶囊血液相容性的方法，尤其是通过静电作用吸附表面修饰剂或者通过共价作用利用交联剂接枝表面修饰剂而对微胶囊表面进行修饰并改善其血液相容性的方法。
背景技术：
：微胶囊是通过成膜物质将囊内空间与囊外空间隔离开以形成特定几何结构的物质。微胶囊的形状以球形结构为主，也可为卵圆形、多角形及其它不规则形状。传统微胶囊尺寸大小通常在微米至毫米级，壁厚在亚微米至几百微米。根据囊壁形成的原理，微胶囊的传统制备技术大体可分为三类利用反应生成囊壁的化学方法、利用相分离形成囊壁的物理化学方法和利用机械或其它物理作用形成囊壁的物理方法。囊壁通常由天然或合成的高分子材料组成，也可是无机化合物。根据囊心的性质和微胶囊的使用要求，囊壁可由一种材料或多种材料复合构成。微胶囊的特点在于囊内物质被包埋，囊壁具有半透性能和一定的阻隔性能。核-壳结构微胶囊的囊心物质以固体或液体为主，也可是气体。在药物的包埋与传递中，聚电解质微胶囊显示出了十分独特的性能。例如，利用自沉积技术和电荷调控渗透性能，可将多种水溶性物质如蛋白、酶、维生素、纳米微粒及各种药物自发高效地包埋在微胶囊内。由于囊壁的半透性质，微胶囊具有缓释药物的能力，从而达到低毒、长效的目的。靶向药物载体最主要的应用形式即载体微球或微胶囊。对作为靶向药物载体高分子材料的基本要求包括其必须无毒，有一定的生物可降解性和血液相容性，能在血液循环中保持一定的寿命。除了定点注射，通过血液流动的方法将药物传递到需要的部位是一种更为前沿的给药方式，操作更为简便。但是，由于聚电解质微胶囊的特殊带电结构，它们与血液接触后，将可能引起较为严重的凝血反应，导致血栓形成进而影响到动物的生命。因此，对微胶囊表面进行物理或化学改性以提高其血液相容性、降低蛋白质的吸附(减少微球或微胶囊等的非特异性吞噬)是十分必要的。
发明内容本发明的目的是提供一种操作过程简单、适用范围广、效率高的改善微胶囊血液相容性的方法。本发明提供的改善微胶囊血液相容性的方法，其原理是通过静电作用吸附表面修饰剂或者通过共价作用利用交联剂接枝表面修饰剂而对微胶囊表面进行修饰。具体包括以下步骤1)室温下，在0.5mol/L的NaCl溶液中，将浓度为0.5-4mg/mL的具有相反电荷的聚电解质层_层自组装在胶体微粒表面，得到核_壳结构的胶体微粒；2)按每25-100mg的胶体微粒加入含0.5mo1NaCl的0.5-4mg/mL的牛血清白蛋3白溶液l-2ml，振荡吸附15-60min;或者按每25_100mg的胶体微粒加入0.5_2ml的质量浓度为1%的交联剂，室温下反应l-12h后，再加入l-2ml含0.5molNaCl的0.5_4mg/mL的牛血清白蛋白溶液或端胺基聚乙二醇溶液，振荡吸附15-60min，再将此微粒用质量浓度为0.1%的NaBH4浸泡处理15-60min;3)用乙二胺四乙酸二钠溶解或用盐酸分解去除胶体微粒，得到悬浮在水中的血液相容性被改善的中空微胶囊。本发明中，所述的胶体微粒是微交联三聚氰胺_甲醛树脂微粒、碳酸钙微粒、聚苯乙烯磺酸钠掺杂的碳酸钙微粒或碳酸锰微粒。所述的聚电解质是聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)、聚二烯丙基二甲基季铵盐(PDADMAC)、壳聚糖、胶原、多聚赖氨酸(PLL)、阳离子化葡聚糖(DEAE-葡聚糖)、聚苯乙烯磺酸钠(PSS)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMA)、硫酸软骨素、硫酸肝素、透明质酸、藻酸钠或硫酸葡聚糖。所述的交联剂可以是戊二醛或京尼平。本发明中胶体微粒的去除方法与其结构有关，如微交联三聚氰胺_甲醛树脂微粒用盐酸分解，碳酸钙微粒和碳酸锰微粒用盐酸分解或乙二胺四乙酸二钠溶解去除。本发明方法的有益效果在于改善微胶囊血液相容性，为微胶囊在生物材料、药物传递、组织工程等领域的应用创造了良好条件。图1微胶囊的人血桨复f丐化时间(PRT):a，(PSS/PAH)5;b，(PSS/PAH)5/GA，c，(PAH/PSS)4PAH/GA/PEG;d，(PSS/PAH)5/GA/BSA微胶囊；图2微胶囊的新鲜兔血的全血凝固时间(CT):a，(PSS/PAH)5;b，(PSS/PAH)5/GA，c，(PAH/PSS)4PAH/GA/PEG;d，(PSS/PAH)5/GA/BSA微胶囊；图3微胶囊吸附荧光标记的FITC-BSA后的荧光显微镜照片其中，(A):(PAH/PSS)4PAH;(B):(PAH/PSS)4PAH/BSA;(C):(PAH/PSS)4PAH/GA/BSA/NaBH4;(D):(PAH/PSS)4PAH/GA/PEG/NaBH4;(E):(PAH/PSS)4PAH/GA/NaBH4(无荧光信号，用光镜照片代替)；图4用流式细胞仪定量表征微胶囊吸附FITC-BSA前[(A)-(E)]与吸附FITC-BSA后[(F)-(J)]的荧光强度变化关系图(A)，(F):(PAH/PSS)4PAH;(B)，(G):(PAH/PSS)4PAH/BSA;(C)，(H):(PAH/PSS)4PAH/GA/BSA/NaBH4;(D)，(I):(PAH/PSS)4PAH/GA/PEG/NaBH4;(E)，(F):(PAH/PSS)4PAH/GA/NaBH4微胶囊；具体实施例方式以下实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。实例1往400mL浓度为0.025M/L的硝酸钙(Ca(N03)2)溶液快速加入400mL浓度为0.025M/L的碳酸钠(NaC03)溶液。15分钟后，将生成的碳酸钙(表示为CaC03)微粒离心收4集，用水洗涤3次，保存于乙醇中。将lmL(固含量5-10%)直径为3-10iim的CaC03微粒置于2mL的离心管中。(1)离心去除乙醇，用水洗涤3次。(2)加入lmL的聚苯乙烯磺酸钠(PSS)的NaCl溶液(NaCl浓度为0.5mol/L)，间或振荡离心管。10分钟后，用水洗涤3次，以去除多余的PSS，从而在CaC03表面吸附了一层PSS(表示为CaC03-PSS)。(3)然后加入lmL的聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)的NaCl溶液(NaCl浓度为0.5mol/L)，间或振荡离心管。10分钟后，用水洗涤3次，以去除多余的PAH，从而在CaC03-PSS表面又吸附了一层PAH(表示为CaC03_PSS/PAH)。重复上述(2)、(3)过程，直至形成CaC0f(PSS/PAH)5的核壳微粒。往组成为CaC03-(PSS/PAH)5的微粒中加入1ml1%戊二醛(GA)，室温下反应12h，4000rpm离心lmin，弃上清，水洗三次，即为CaC03-(PSS/PAH)5/GA的核壳微粒。往组成为CaC03-(PSS/PAH)5/GA的微粒中分别加入BSA或PEG,即得最外层共价接枝BSA或PEG的微粒，即CaC03-(PSS/PAH)5/GA/BSA或CaC03-(PSS/PAH)5/GA/PEG的核壳微粒。然后向以上各类核壳微粒中加入浓度为0.lmol/L的盐酸溶液或者乙二胺四乙酸溶液，反应30min使核分解。然后在5000rpm离心3min，除去上清。以上过程重复3_5次，以彻底除去碳酸钙，得到聚电解质中空微胶囊。各类微胶囊分别用(PSS/PAH)5、(PAH/PSS)4/PAH/GA、(PSS/PAH)5/GA/BSA、(PSS/PAH)5/GA/PEG来表示。测定微胶囊的抗凝血桨复f丐化时间(PRT):将人体抗凝血桨和0.025M的CaCl2溶液在37t:水浴中预热，取lmL已预热至37t:的人体血浆加入内表面已硅化的玻璃试管中，再加入0.5mL的浓度为1.OX106个/mL(通过血球计数器计数)的微胶囊溶液，静置60s。然后往试管中加入上述CaCl2溶液lmL，同时开动秒表计时，将一根不锈钢小钩伸入溶液中缓慢而均匀的搅动，检查是否有纤维蛋白形成。记录小钩上开始出现丝状物的时间，此时间即为PRT。每个样品重复测六次，取平均值。采用新鲜兔血测定微胶囊的全血凝固时间(CT):实验分为(PSS/PAH)4、(PSS/PAH)4/GA、(PSS/PAH)4/GA/PEG、(PSS/PAH)4/GA/BSA四组微胶囊体系，每组采用3支2mL的离心管，每支离心管分别加入0.5mL的微胶囊(约2X105个/mL)，全部置于37。C水浴中预热。从兔静脉采血，用两个硅化注射器抽取，少量血液进入注射器后废弃(约l-2mL)，即刻更换第2个注射器，当血液进入第2个注射器时开始开动秒表计时。取血后弃去针头，沿试管壁注入血液lmL，将全部试管置于37t:水浴箱中。血液离体3min后，每隔1530s将每组微胶囊体系的第1支试管轻轻倾斜至约30。，直至血液不再流动为止。再以相同方式依次观察各组第2、3管，以第3管的血液凝固时间为凝血时间。通过对(PSS/PAH)5微胶囊的人血桨复f丐化时间PRT(如图1)和新鲜兔血的全血凝固时间CT(见图2)的测定，发现最外层接枝PEG和BSA后的血浆复钙化时间和全血凝固时间较未接枝的(PSS/PAH)乂GA微胶囊均有所延长，血液相容性有所改善。微胶囊的溶血性能测定首先制备2%红细胞悬液的制备。用肝素钠抗凝管抽取新西兰兔(健康雄性，1.8-2.3kg)新鲜血液20mL，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振动摇晃10min，除去纤维蛋白原，制成脱纤血液，加100mL生理盐水摇匀，1500rmin—1离心20min，除去上清液，反复用生理盐水洗至上清液无红色，将所得红细胞用生理盐水配制成2%红细胞混悬液，备用。取2%兔血红细胞悬液0.2ml加入10ml蒸馏水中，用酶标仪545nm波长测量，吸光度为0.760，符合试验要求，正常阳性对照组吸光度值为0.8±0.3。5将微胶囊(约1X107个微胶囊)浸于0.9%生理盐水，在37°C下恒温恒湿细胞培养箱中浸提72h，分别取10ml微胶囊浸提液、去离子水(阳性对照)、0.9%生理盐水(阴性对照)于15ml离心管，37。C水浴X30min，每只试管分别加2%兔血红细胞悬液0.2ml，于37t:水浴下预热60min后，将各管的溶液置入干燥离心管中离心(1000prm)5min，取上清在分光光度计上545nm处扫描，以蒸馏水为空白读取各管吸光度(OD)值，每组设10个平行样溶血试验的评价标准生物材料的溶血率用％表示，计算公式如下溶血率(%)=(Dt-Dnc)/(Dpc_Dnc)X100其中Dt——试验样品吸光度Dn。——阴性对照吸光度Dp。——阳性对照吸光度以Dnc吸光度应不大于0.03，Dpc吸光度值为0.8±0.3，若溶血率<5%，则材料符合生物材料溶血实验要求；若溶血率>5%，则预示试验材料有溶血作用。溶血实验结果显示(PSS/PAH)5/GA、(PSS/PAH)5/GA/BSA、(PSS/PAH)5/GA/PEG等各类微胶囊的溶血率分别为1.56%、2.31%和2.07%，见表1，三者的溶血率均小于5%，均无致溶血性。发现上诉各类微胶囊在一定浓度下将具有良好的血液相容性，符合生物医学材料的血液相容性标准。表1微胶囊的溶血率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实例2往400mL浓度为0.05M/L的硝酸钙(Ca(N03)2)溶液与800mg聚苯乙烯磺酸钠(PSS)混合，10分钟后，快速加入400mL浓度为0.05M/L的碳酸钠(NaC03)溶液。15分钟后，将生成的碳酸钙(表示为CaCOjPSS))沉淀离心收集，用水洗涤3次，保存于乙醇中。以CaC03(PSS)微粒为核，PAH、PSS为组装聚电解质，参照实例1制备CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH的核壳微粒。向50mg的CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH胶体微粒中加入lml的2mg/mL的BSA(盐浓度0.5mol/LNaCl)溶液，振荡吸附30min，即通过静电作用吸附表面修饰剂而对微胶囊表面进行修饰得到组成为CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/BSA的核壳微粒；或者向50mg的CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH胶体微粒中加入1ml的浓度为lwt%GA，室温下反应12h，4000rpm离心lmin，弃上清，水洗三次，得到组成为CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/GA/NaBH4的核壳微粒，再加入1ml的2mg/mL的BSA(盐浓度0.5mol/LNaCl)或PEG溶液，振荡吸附30min;然后将经GA交联过的微粒用0.1%的NaBH4浸泡处理30min。水洗三次，即通过得到组成分别为CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/GA/NaBH4、CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/GA/BSA/NaBH4、CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/GA/PEG/NaBH4的核壳微粒。将以上各类核壳微粒用O.lM的EDTA去核，反应30min，然后在5000rpm离心3min，除去上清。以上过程重复3-5次，以彻底除去碳酸钙，得到中空微胶囊。各类微胶囊分别用(PAH/PSS)4/PAH、(PAH/PSS)4/PAH/BSA、(PAH/PSS)4/PAH/GA/NaBH4、(PAH/PSS)4/PAH/GA/BSA/NaBH4、(PAH/PSS)4/PAH/GA/PEG/NaBH4来表示。采用血球计数器计数微胶囊，再分别往1X107个不同种类的微胶囊中加入1ml的FITC-BSA(2mg/mL)，吸附一小时后，在5000rpm下离心3min以除上清，再用纯水洗三次，以备测试。将各类微胶囊吸附FITC-BSA后，比较各微胶囊表面吸附的情况。为观察所制微胶囊吸附FITC-BSA后的表面情况，分别取10L吸附后的微胶囊，在荧光显微镜下观察并拍照。图3分别是各类微胶囊吸附FITC-BSA的荧光显微镜图像。微胶囊本身没有荧光标记，吸附了FITC-BSA后才会有荧光，才在荧光显微镜下可见。又用流式细胞仪(FCM)定量分析了各类微胶囊在吸附FITC-BSA前后的平均荧光强度。每次测量平均计数10000个微胶囊，每个样品测三次。结果见图4与表2。发现(PAH/PSS)4/PAH微胶囊与(PAH/PSS)4/PAH/BSA微胶囊吸附FITC-BSA后荧光强度均有明显增加，表明其能吸附较多量的FITC-BSA;而其它最外层经修饰过的微胶囊的荧光强度几乎没有改变，表明其难以再吸附FITC-BSA，血液相容性提高。表2微胶囊吸附FITC-BSA前后的平均荧光强度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种改善微胶囊血液相容性的方法，其特征在于包括如下步骤1)室温下，在0.5mol/L的NaCl溶液中，将浓度为0.5-4mg/mL的具有相反电荷的聚电解质层-层自组装在胶体微粒表面，得到核-壳结构的胶体微粒；2)按每25-100mg的胶体微粒加入含0.5molNaCl的0.5-4mg/mL的牛血清白蛋白溶液1-2ml，振荡吸附15-60min；或者按每25-100mg的胶体微粒加入0.5-2ml的质量浓度为1％的交联剂，室温下反应1-12h后，再加入1-2ml含0.5molNaCl的0.5-4mg/mL的牛血清白蛋白溶液或端胺基聚乙二醇溶液，振荡吸附15-60min，再将此微粒用质量浓度为0.1％的NaBH4浸泡处理15-60min；3)用乙二胺四乙酸二钠溶解或用盐酸分解去除胶体微粒，得到悬浮在水中的血液相容性被改善的中空微胶囊。2.根据权利要求1所述的改善微胶囊血液相容性的方法，其特征在于胶体微粒是微交联三聚氰胺_甲醛树脂微粒、碳酸钙微粒、聚苯乙烯磺酸钠掺杂的碳酸钙微粒或碳酸锰微粒。3.根据权利要求1所述的改善微胶囊血液相容性的方法，其特征在于所述的聚电解质是聚烯丙基胺盐酸盐、聚二烯丙基二甲基季铵盐、壳聚糖、胶原、多聚赖氨酸、阳离子化葡聚糖、聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸软骨素、硫酸肝素、透明质酸、藻酸钠或硫酸葡聚糖。4.根据权利要求1所述的改善微胶囊血液相容性的方法，其特征在于所述的交联剂是戊二醛或京尼平。全文摘要本发明公开了一种改善微胶囊血液相容性的方法。该方法步骤依次为采用胶体微粒为模板，通过层层静电自组装方法将具有相反电荷的聚电解质组装到微粒表面，得到了核—壳结构的胶体微粒，在微粒的最外层接枝聚乙二醇(PEG)或牛血清白蛋白(BSA)，或通过静电吸附BSA，然后采用溶解或分解的方法去除模板而得到聚电解质中空微胶囊。测定各种微胶囊的抗凝血浆复钙化时间(PRT)、全血凝固时间(CT)以及微胶囊的溶血性能，证明了如此改性的微胶囊的血液相容性有较大提高。这为微胶囊在生物材料、药物传递、组织工程等领域的应用创造了良好条件。文档编号A61K47/36GK101785764SQ20101012782公开日2010年7月28日申请日期2010年3月19日优先权日2010年3月19日发明者仝维鋆,张裕英,彭采宇,高长有申请人:浙江大学