专利名称：低氧间充质干细胞的培养方法、用途及组合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及干细胞应用技术领域，尤其是一种低氧间充质干细胞的培养方法、用 途及组合制剂。
背景技术：
间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质
干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既
有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分
化为成纤维细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、肝细胞、
心肌细胞、胰岛P细胞和内皮细胞等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向
分化潜能。间充质干细胞免疫源性低，不论是自体还是同种异源的间充质干细胞， 一般都不会
引起宿主的免疫反应。间充质干细胞有向衰退、缺血或损伤组织归巢的特征。间充质干细胞
输入宿主体内后，可以归巢在特定部位，在微环境影响下有可能分化成为心肌、肝、肾、胰岛、
神经、皮肤、肌肉、骨、软骨、肌腱等组织器官的细胞，达到治疗疾病的目的。 在临床应用方面，当前国内外的临床研究主要集中在用间质干细胞来治疗诊断明
确的疾病上，尤其是难治疾病，如移植物抗宿主反应(GVHD)、牙周疾病、心肌梗死、半月板损
伤、骨或软骨缺损、股骨头坏死、脊髓损伤、脑瘫、克隆氏病、肌萎縮侧索硬化症、系统性红斑
狼疮、系统性硬化症、中风、糖尿病、糖尿病足坏疽或肝脏损伤等疾病，部份疾病已取得明显
的疗效，其余也得到了部分改善或缓解。大家公认的间充质干细胞在机体内的作用机制有
①干细胞分化为功能性细胞，代替衰退、损伤的功能性细胞；②启动再生相关基因的顺序表
达，使组织器官的内源性衰退、损伤修复启动；③外源性干细胞进入体内，分泌多种生长营
养因子，改善组织器官内部微环境；④免疫调节作用可减轻了局部组织器官的炎性反应。 当前针对间充质干细胞用于防治机体功能性衰退的研究尚少。机体功能性衰退
(包括了亚健康、生理性衰退及疾病前期)与疾病的发生密切相关，可以说机体功能性衰退
是疾病的前期，机体可同时存在机体功能性衰退和疾病两种情况，两者可互为因果条件相
互促进，伴随着机体的整个生命周期。我们在进一步的研究中发现①静脉输注的骨髓、外
周血动员或体外培养的间充质干细胞，只有极少数间充质干细胞能植入受者体内，多数细
胞滞留于微血管处而死亡。②间充质干细胞有贴壁生长的特性，间充质干细胞在静脉输注
中会出现粘附、聚集成团，出现细胞团栓塞的可能。③胎盘、脐带来源的间充质干细胞取材
方便、无道德伦理问题的限制，细胞的分化潜力、活力、增殖能力和细胞内的活性营养因子
种类及含量，都强于来源于成体的间充质干细胞。目前还尚未发现有人将源于胎盘、脐带的
间充质干细胞用于抗衰老目的。
发明内容
本发明的任务是要克服现有技术的缺陷，提供一种在人体内的活力及植入成活率高，具有防治机体功能性衰退，不会滞留于微血管处而死亡，在静脉输注中不会出现粘附、 聚集成团从而导致细胞团栓塞，细胞的分化潜力、活力、增殖能力和细胞内的活性营养因子 种类及含量都强于来源于成体的低氧间充质干细胞的培养方法、用途及组合制剂。
本发明的技术方案是
一种低氧间充质干细胞的培养方法，其特征是在3_10%氧浓度的低氧条件下，按如下 步骤培养a、无菌操作将脐带或胎盘切成组织块，用Hank' s液冲洗后去除残留血液并分离 血管；b、将处理后的组织块用胰蛋白酶消化，观察细胞大部分分散时，终止消化；c、对消化 后的物质过滤；d、将所得滤液低速离心；e、在离心后的滤液中加入细胞培养液制成细胞混 悬液；f、将细胞混悬液按(1 :2 4)的比例历时约14-15天，进行4-5代传代，得成品低氧 间充质干细胞。 进一步的该优化措施是
在所述步骤f后还设有检验程序g、对步骤f所得产物进行病源生物检测，排除病源学 污染；h、进行表型检测，符合CD31、 HLA-DR、 CD34和CD45阴性，CD44、 CD73、 CD90和CD105 阳性的细胞为合格细胞；i、将合格细胞加入冻存液后置于-205t: -185t:液氮中保存，并 记录脐带或胎盘的来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期。
在于在所述步骤a中，将所述组织块切成0. 5mm3 1. 5mm3的小块。
在所述步骤d后设有步骤d':用Hank's液对间充质干细胞混悬液离心清洗至少1 次。 低氧间充质干细胞的用途，其特征是所述低氧间充质干细胞在防治人或动物机 体功能性衰退方面的应用。 用所述方法制得的低氧间充质干细胞配制的组合制剂，由使用时提前输注的复合 氨基酸注入液、所述低氧间充质干细胞及与该间充质干细胞一同在后输注的含肝素的生理 盐水组配而成。 所述复合氨基酸注入液由18种氨基酸组成，包括L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-亮氨 酸丄-天门冬氨酸、醋酸L-赖氨酸丄-半胱氨酸丄-谷氨酸丄-蛋氨酸丄-组氨酸丄-苯丙 氨酸丄-脯氨酸丄-苏氨酸丄-丝氨酸丄-色氨酸丄-酪氨酸丄-缬氨酸、甘氨酸和L-丙氨 酸，每100ml复合氨基酸注入液中含10g左右氨基酸。 每组组合制剂中含低氧间充质干细胞的细胞数106_108个，每组组合制剂中所述
生理盐水含肝素10-20IU/ml，每组组合制剂中含所述复合氨基酸25 50g。 经理论及实践表明，用本发明培养方法所培养的低氧间充质干细胞所配制的组合
制剂，在人体内的活力及植入成活率高，不仅不会滞留于微血管处而死亡，在静脉输注中不
会出现粘附、聚集成团从而导致细胞团栓塞，反而细胞的分化潜力、活力、增殖能力和细胞
内的活性营养因子种类及含量都强于来源于成体的间充质干细胞，具有明显的防治机体功
能性衰退的作用。 以下通过实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式
低氧间充质干细胞的培养方法，在3_10%，优选5%氧浓度的低氧条件下，按如下步 骤培养a、无菌操作，将脐带或胎盘切成0. 5mm3 1. 5mm3的小组织块(优选lmm3小组织块)，用Hank's液冲洗后去除组织块上残留的血液并分离血管；b、将处理后的组织块用胰蛋白酶 消化，观察到细胞大部分分散时终止消化；c、对消化后的物质过滤；d、将所得滤液低速离 心；d'、用Hank's液对间充质干细胞混悬液离心清洗5次；e、在离心后的滤液中加入细胞培 养液，制成细胞混悬液。该细胞培养液可以是采用美国StemCell公司的间充质干细胞专用 培养基MesencultTM作成的培养试剂，还可以是在美国GIBC0公司的DMEM、 F12、 DMEM/F12、 RPMI1640基础培养基的基础上添加血清、胰岛素和/或细胞因子而得到的完全培养基；f、 将细胞混悬液按1 :2 4 (优选1 :3)的比例历时约14-15天，进行4-5代传代；g、检验对 步骤f所得产物进行病源生物检测，排除病源学污染；h、进行表型检测，符合CD31、HLA-DR、 CD34和CD45阴性，CD44、 CD73、 CD90和CD105阳性的细胞为合格细胞；i、将合格细胞加入 冻存液后置于_205°C _185°C (优选_196°C )液氮中保存，并记录脐带或胎盘的来源信息、 细胞代数、细胞数量以及制备日期，即得成品低氧间充质干细胞。 本发明低氧间充质干细胞可配制成组合制剂，用来防治人或动物的机体功能性衰 退。该组合制剂由使用时提前输注的复合氨基酸注入液、低氧间充质干细胞及与该低氧间 充质干细胞一 同在后输注的含肝素的生理盐水组配而成。 所述复合氨基酸注入液由18种氨基酸组成，包括L-异亮氨酸丄-精氨酸丄-亮氨 酸丄-天门冬氨酸、醋酸L-赖氨酸丄-半胱氨酸丄-谷氨酸丄-蛋氨酸丄-组氨酸丄-苯丙 氨酸丄-脯氨酸丄-苏氨酸丄-丝氨酸丄-色氨酸丄-酪氨酸丄-缬氨酸、甘氨酸和L-丙氨 酸，每100ml复合氨基酸注入液中含10g左右氨基酸。 当然，复合氨基酸注入液也可由不足18种氨基酸组成，只是使用效果不如18种氨 基酸的理想。 每组组合制剂中含低氧间充质干细胞的细胞数106-108 (优选107)个，每组组合制 剂中所述生理盐水含肝素10-20IU/ml(优选10IU/ml)，每组组合制剂中含复合氨基酸25 50g，优选40g。 在临床验证中，我们按下列验证条件选择实验对象 1、符合下列条件者
① 内分泌及性功能衰退人群男性、女性性功能下降、减退，女性月经失调、内分泌紊 乱，卵巢早衰、更年期提前，睡眠、情绪欠佳等；
② 机体未老先衰人群机体衰老，缺乏活力，易疲倦，组织器官功能老化等；
③ 心血管系统功能退变人群动脉硬化、老化，冠状动脉硬化、狭窄，血压增高等；
④ 内脏器官功能退化人群心、肝、肺、肾、胃肠等器官功能衰退或下降；
⑤ 骨骼运动系统退变人群骨质疏松，骨关节增生疼痛，骨关节退变，关节炎，肌肉、韧 带、肌腱功能退化，运动及活动能力下降等；
⑥ 免疫系统衰退人群免疫力弱，易感冒或患感染性疾病等；
⑦ 血液系统功能衰退人群血脂高，血粘稠度高，血液流变学改变等；
⑧ 高压力、工作紧张、亚健康人群；
⑨ 预防衰老，要求维持机体年轻化、面部美容年轻化的人群。
2、排除下列情况
① 高度过敏体质或者有严重过敏史者；
② 休克或全身衰竭生命体征不稳定者；③ 恶性肿瘤者；
④ 全身感染或局部严重感染需抗感染治疗者；
⑤ 合并心、肺、肝、肾等重要脏器的功能障碍，身体情况不稳定者；
⑥ 凝血功能障碍者如血友病；
⑦ 血清学检查阳性者如艾滋病、梅毒等(乙肝除外)；
⑧ 染色体或基因缺陷，免疫功能缺陷；
⑨ 诊断上尚未明确者；
⑩ 极个别的期望值过高，或者不切合实际的要求者。
3、验证前作一下体检项目
① 必需项目乙肝两对半、丙肝病毒抗体测定(HCV-IgG)、转氨酶、艾滋病病毒抗体(HIV-Ab)、梅毒血清实验测定；
② 建议项目血压、血脂、血糖、肝功生化、肾功、超敏C反应蛋白、心肌酶谱、C3、C4、IgA、 IgM、 IgG、性激素、风湿4项、血浆骨钙素等，及B超、心电图和体内脂肪测定等。
4、实施验证
(1)、观察疗效人数确定56人，女性32人，男性24人，年龄29-78岁之间。所有人符合上述治疗条件，体检项目的必需项目及建议项目中的常规项目在治疗前一月内完成。
(2)、治疗细胞数及次数确定同样在低氧条件下培养的间充质干细胞，3-5代为主，细胞数在107左右；治疗次数依据个人身体情况及体检结果， 一般在3-4次，必要时可在5次以上。 (3)、间充质干细胞解冻干细胞从-196°〇液氮中取出，置入42t:水浴箱进行解冻。 (4)、复合氨基酸的提前输注建立静脉通道，依据受治疗者实际情况选250ml复合
氨基酸，少数选500ml，采取缓慢静脉滴注的方式。注射速度每小时输注氨基酸相当10g左
右(本品100ml)， 1分钟约25滴缓慢滴注。老人及身体情况较差都更需缓慢滴注。 (5)、间充质干细胞输注用9号以上注射器针头抽取间充质干细胞浓縮液，配合
0. 9%生理盐水(内含10IU/ml低分子肝素钠)20ml进行缓慢静脉推注或滴注。 (6)、观察与处理治疗过程中观察受治疗者的情况，有无过敏反应或特殊反应。56
人中出现过2人次轻度过敏反应，密切观察未做特殊处理自愈。必要时可静脉推注2mg地
塞米松进行处理。未见其它不良反应。 5、临床实验效果
A、观察周期疗程开始后的一年时间。
B、可能出现的效果
①外在变化刚开始皮肤变光滑、润泽，肤色变白；1月左右细小皱纹减轻、变浅，面部色斑变淡；3月后，头发出现增多、白转黑现象，全松弛的皮肤开始变得紧致以及肌肉变得紧实，女性乳房、臀部变得紧致富有弹性。
②免疫力增强，原来易感冒的人不易再感冒。
③睡眠改善，不容易疲倦，精力充沛，心情舒畅，记忆力好转。
④肌肉变得有力，腰膝酸软疼痛症状减轻。
⑤食欲好转，腹胀、便秘现象减轻甚至消失，肠炎症状好转。 ⑥男性功能改善，前列腺肥大增生减轻好转；女性卵巢早衰患者月经的恢复，更年期症状的改善，女性乳房及臀部变得紧致有弹性，乳晕由黑转红现象。 ⑦代谢率提高，减肥不再困难，体态发生变化，肥胖的人身材变的苗条，脂肪重新分布，机体年轻态的恢复。 ⑧全面提高人体机能，改善人体退变现状，使机体保持青春活力和年轻状态。
⑨体检指标如血压、血脂、血糖、肝功生化、肾功、超敏C反应蛋白、心肌酶谱、C3 、C4、 IgA、 IgM、 IgG、性激素、风湿4项、血浆骨钙素等，及B超、心电图和体内脂肪测定等有明显改善或提高。 ⑩对于长期使用降糖药的糖尿病人，用本发明药物治疗后降糖药的用量会明显减少。 C、疗效及疗养评估标准，分为无效、有效、明显有效三个标准
① 无效治疗前后主客观症状无一项明显变化；
② 有效主观症状改善2项或/和客观指标改善1项；
③ 明显有效主观症状改善2项以上或/和客观指标改善1项以上。
56人实验中含无效0例，有效18例，明显有效38例。
权利要求
一种低氧间充质干细胞的培养方法，其特征是在3-10% 氧浓度的低氧条件下，按如下步骤培养a、无菌操作将脐带或胎盘切成组织块，用Hank，s液冲洗后去除残留血液并分离血管；b、将处理后的组织块用胰蛋白酶消化，观察细胞大部分分散时，终止消化；c、对消化后的物质过滤；d、将所得滤液低速离心；e、在离心后的滤液中加入细胞培养液制成细胞混悬液；f、将细胞混悬液按1(2～4)的比例历时约14-15天，进行4-5代传代，得成品低氧间充质干细胞。
2. 依照权利要求1所述的低氧间充质干细胞的培养方法，其特征是在所述步骤f后 还设有检验程序g、对步骤f所得产物进行病源生物检测，排除病源学污染；h、进行表型检 测，符合CD31、HLA-DR、CD34和CD45阴性，CD44、 CD73、 CD90和CD105阳性的细胞为合格细 胞；i、将合格细胞加入冻存液后置于_205°C _1851:液氮中保存，并记录脐带或胎盘的来 源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期。
3. 依照权利要求1所述的低氧间充质干细胞的培养方法，其特征在于所述细胞培养液 采用美国StemCell公司的间充质干细胞专用培养基Mesencult 作为培养试剂。
4. 依照权利要求1所述的低氧间充质干细胞的培养方法，其特征是所述细胞培养液 是在美国GIBC0公司的DMEM、 F12、 DMEM/F12、 RPMI1640基础培养基的基础上添加血清、胰 岛素和/或细胞因子而得到的完全培养基。
5. 依照权利要求l-4所述的任一种低氧间充质干细胞的培养方法，其特征在于在所述 步骤a中，将所述组织块切成0. 5mm3 1. 5mm3的小块。
6. 依照权利要求l-4所述的任一种低氧间充质干细胞的培养方法，其特征是在所述 步骤d后设有步骤d':用Hank's液对间充质干细胞混悬液离心清洗至少1次。
7. 权利要求1-6所述任一种低氧间充质干细胞的用途，其特征是所述低氧间充质干 细胞在防治人或动物机体功能性衰退方面的应用。
8. 用权利要求1-6所述的任一种方法制得的低氧间充质干细胞配制的组合制剂，由使 用时提前输注的复合氨基酸注入液、所述低氧间充质干细胞及与该间充质干细胞一同在后 输注的含肝素的生理盐水组配而成。
9. 依照权利要求8所述的组合制剂，其特征是所述复合氨基酸注入液由18种氨基酸 组成，包括L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-天门冬氨酸、醋酸L-赖氨酸、L-半胱氨 酸、L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-色 氨酸丄-酪氨酸丄-缬氨酸、甘氨酸和L-丙氨酸，每100ml复合氨基酸注入液中含10g左右 氨基酸。
10. 依照权利要求8或9所述组合制剂，其特征是每组组合制剂中含低氧间充质干细 胞的细胞数106-108个，每组组合制剂中所述生理盐水含肝素10-20IU/ml，每组组合制剂中 含所述复合氨基酸25 50g。
全文摘要
本发明公开了一种低氧间充质干细胞的培养方法、用途及组合制剂。采用低氧条件下培养的脐带或胎盘间充质干细胞，结合复合氨基酸注射液提前输注等手段，提高了间充质干细胞在体内的活力、植入成活率及治疗效果；为了避免间充质干细胞在血管中出现粘附、聚集成团，出现细胞团栓塞的可能，治疗时配合含肝素的生理盐水，通过静脉注射或静脉滴注的方式进行。通过3次以上的治疗，受治疗者身体状况明显好转，免疫、血脂、血糖等客观指标显著改善。
文档编号A61K31/198GK101792737SQ20101013053
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月24日 优先权日2010年3月24日
发明者晏泽 申请人:晏泽