专利名称:哈巴俄苷在制药中的应用的制作方法
哈巴俄苷在制药中的应用
技术领域:
本发明涉及哈巴俄苷(harpagoside)在制药中的用途。背景技术:
中枢神经系统的常见疾病如帕金森病(Parkinson’ Disease, PD)越来越受重视。 尽管它的原发病因尚未阐明,但随着研究的不断深入,属于神经退行性病变这一点却越来越明确。帕金森症主要是和运动系统有关的神经细胞发生退行性病变,这些变化和氧应激引起的黑质中多巴胺神经元变性密切有关。目前对这一疾病临床上主要还是对症疗法,主要用多巴类药物,不能改善神经退行性病变的进程,长期使用甚至可能导致病变的加重。目前国际上正在大力研究能延缓或纠正神经退行性病变的药物。已有大量研究表明,神经营养因子是有特异活性作用的蛋白质具有明显的神经保护作用,包括胶质细胞源神经生长因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)、脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和保守性多巴胺神经营养因子 (conserved dopamine neurotrophic factor, CDNF)。GDNF、BDNF 在 PD 时降低,它们都是多肽,不能直接透过血脑屏障,因此作为药物应用确有困难。因此,有不少研究试图以神经营养因子为靶点,寻找能提高脑内这些神经营养因子的药物,例如,实验室研究已经发现 rasagiline, pramipexole和ropinirole能提高某些培养细胞的⑶NF,但是这些化合物本身多为多巴类药物,实际临床应用中它们是否确实能通过改善神经退行性病变而排除这些药物本身固有的缺点,还有待研究。哈巴俄苷(harpagoside,)是一种环烯醚萜类化合物,分子式为C24H30011,中药玄参的主要活性成分之一。目前用于热病伤阴,舌绛烦渴,温毒发斑,津伤便秘,骨蒸劳嗽,目赤,咽痛,瘰疬, 白喉,痈肿疮毒(胡瑛瑛,黄真.玄参的化学成分及药理作用研究进展.浙江中医药大学学报,2008. 268-270);谢丽华等的动物实验研究表明皮下注射哈巴俄苷能够增强阴虚小鼠的免疫功能。在欧美等地常用于疼痛和骨关节炎的辅助治疗;韩国学者Kim等从北玄参中研究发现哈巴俄苷对谷氨酸诱导的大鼠皮层神经元损伤在0. 1 10 μ M浓度范围内都有保护作用。另外从北玄参分离的哈巴俄苷改善东莨菪碱损伤的小鼠记忆,并且具有抗氧化的活性。其对PD细胞模型和PD整体动物模型的作用效果尚未有报道。glc
哈巴俄苷(harpagoside)
发明内容本发明的目的在于提供哈巴俄苷在制药中的新用途。具体地说,本发明涉及哈巴俄苷在制备治疗或预防帕金森氏症药物中的应用。哈巴俄苷在制备治疗或预防帕金森氏症药物中的应用时,浓度优选为10_6M-10_5M 数量级。涉及哈巴俄苷在制备治疗或预防帕金森氏症保健品中的应用。哈巴俄苷在制备治疗或预防帕金森氏症保健品中的应用时,浓度优选为10_7M数量级。哈巴俄苷保护或修复脑多巴胺神经元的作用通过诱导⑶NF的表达来实现。为了更好的理解本发明的实质,下面将用哈巴俄苷的药理实验和结果来说明其在制药领域中的新用途。(一 )哈巴俄苷对PD细胞模型的神经保护作用一、哈巴俄苷对MPTP+诱导PD细胞模型的神经保护作用实验方法
1.中脑多巴胺神经元的培养将妊娠14 15天的SD大鼠用无水乙醚在密闭空间中麻醉,采用无菌操作方式取出胚胎中脑腹侧部分。0. 125%胰酶的D-Hanks溶液消化 5min,吸弃部分胰酶消化液,再加入DMEM/F12培养基(内含10%胎牛血清、5%马血清、50U/ ml青霉素和50yg/ml链霉素)终止反应。轻轻吹打使之成细胞悬液,200目筛过滤。滤液经IOOOrpm离心5min收集细胞,以含血清DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀,按照1 X 105/cm2 的密度接种到预先经多聚赖氨酸包被的BD FalconTM 96孔细胞培养板中,置于饱和蒸汽二氧化碳培养箱(5% CO2, 37 0C ),3天后换成无血清含B27DMEM/F12培养基,以后每3 4天换液一次。培养的第7天进行后续实验。2.分组与处理(图1A)哈巴俄苷为脂溶性化合物,在水中溶解度较低,因此配制成二甲基亚砜(DMSO)溶液,过滤灭菌后用于实验,在培养基中DMSO的终浓度为0. 25%。 本实验设7组培养基对照组(medium)、DMSO对照组(DMSO)、MPP+模型组(10 μ M MPP+)、 3 个剂量的给药模型组(0. lyMharpagoside+10yM MPP+, 1 μ M harpagoside+10 μ M MPP+, 10 μ M harpagoside+10 μ M MPP+)、10 μ M 哈巴俄苷组(harpagoside)。每组设 3 个复孔。中脑多巴胺神经元经过6天培养后,加入哈巴俄苷使培养孔中终浓度到达0. 1,1,10 μ Μ,再经过24小时培养后加入ΜΡΡ+(终浓度ΙΟμΜ)进行损伤。继续培养48小时后,进行免疫细胞化学染色。3.免疫细胞化学染色
4
CN 102198143 A
说明书2/9页
中脑多巴胺神经元酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,ΤΗ)的测定。弃去细胞培养孔中培养基,PBS洗5minX3次。4%多聚甲醛固定20min,PBS洗5minX3次。3% H2O2 室温孵育 15min,PBS 洗 5minX3 次。0.3% Triton-X-IOO 溶液孵育 30min ;PBS 洗 5minX3 次。5%牛血清白蛋白封闭液室温下封闭20min。TH第一抗体(兔抗小鼠,1 1000)37°C孵育4小时,PBS洗5minX3次。抗兔第二抗体(1 3),37°C孵育0. 5小时;PBS洗IOminX3 次。力卩SABC孵育室温30min;PBS洗10minX3次。DAB显色。PBS终止反应。Nikon倒置显微镜下观察,每个培养孔在100倍和200倍放大的视野下分别拍摄10张图片。100倍视野下计数TH阳性神经元数量;200倍视野下测量视野中的每个TH阳性神经元的最长的突起,用于评估TH阳性突起长度。二、哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元的修复(治疗)作用分组与处理(图1B)实验设6组培养基对照组(medium)、DMSO对照组 (DMSO)、MPP+ 模型组(10 μ M MPP+)、3 个剂量的给药模型组(1 μ Mharpagoside+10 μ MMPP+, 10 μ Mharpagoside+10 μ MMPP+, 100 μ Mharpagoside+10 μ M MPP+)。每组设 3 个复孑L。中脑多巴胺神经元经过6天培养后,加入MPP+使终浓度到达10 μ Μ,损伤24小时后弃去培养孔中含有MPP+的培养基,并使用培养基洗涤1次,重新加入含Β27的无血清 DMEM/F12培养基。加入哈巴俄苷使培养孔中终浓度到达1,10,100 μ Μ。继续培养48小时后,进行免疫细胞化学染色。三、PPl抑制RET时,哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元的影响分组与处理(图1C)对MPP+损伤的中脑细胞进行两因素两水平的实验处理 PPl (0,1 μ Μ)和哈巴俄苷(0,1 μ Μ)。同时另加培养基对照组(medium)和DMSO对照组(DMS0 vehicle)。每组设3个复孔。中脑多巴胺神经元经过6天培养后,先加入PPl (终浓度1 μ Μ)抑制RET激酶, IOmin后加入哈巴俄苷使培养孔中终浓度1 μ Μ,再经过24小时培养后加入ΜΡΡ+(终浓度 10 μ Μ)进行损伤。继续培养48小时后,进行免疫细胞化学染色。四、哈巴俄苷对中脑细胞培养体系中GDNF mRNA水平的影响1、中脑多巴胺神经元的培养为了在以下实验中能够抽提到足够的RNA,采用BD Falcon 6孔细胞培养板培养大鼠中脑细胞。2、分组与处理(图1D)为了进一步证实⑶NF在哈巴俄苷的神经保护方面的作用,设计了模型组和哈巴俄苷预保护模型组在5个时间点(MPP+损伤后0,6,24,48,72h)⑶NFmRNA水平在的变化。在预实验的基础上选择在MPP+损伤后24小时加上DMSO对照组和哈巴俄苷处理组。在实验中哈巴俄苷终浓度设为1MM,MPP+终浓度设为10 μ Μ。3、RNA 的抽提细胞培养孔中加入适量无RNase水洗涤细胞,然后加入4°C保存的600 μ ITroze试剂,反复吹打至细胞完全裂解,转移至无RNase的1.5ml EP管中。然后依次加入2M NaAc (pH 4. 0)60 μ 1、酸化苯酚(H+/phenol,pH < 5. 0)600 μ 1和氯仿异戊醇600 μ 1。蜗旋振荡后, 置于冰上lOmin。4°C离心IOOOOXg IOmin0吸取最上层,避免吸到界面和下层液体。加入等体积异丙醇(v/v),-20°C放置lh。离心弃上清。RNA沉淀加入75%乙醇(用DEPC水配制)lml,充分摇勻,4°C离心SOOOXg 5min,弃上清乙醇,将RNA沉淀置空气中挥发5 IOmin,加入DEPC处理水20 μ 1将沉淀完全溶解备用。4、RNA含量及纯度检测取上述细胞总RNA溶液1 μ 1加249 μ 1 DEPC水,紫外分光光度计在260nm和280nm 处分别检测RNA样品的光密度(optical density, 0D)。0D26(1/0D28(1在1. 7 2. 0范围内, 说明纯度较高。5、引物设计大鼠⑶NF的引物序列如下Forward :5’ -ATG TCA CTG ACT TGG GTT TGG G-3’ ;Reverse 5' -GCT TCA CAG GAA CCG CTA CAA-3‘.GAPDH的引物序列Forward :5,-TGG GTG TGAACC ACG AGAAAT A-3,;Reverse 5' -GCT AAG CAG TTG GTG GTG CAG-3’ .参照文献Ledda F, Paratcha G, Sandoval-Guzman T, et al. GDNF andGFRalphal promote formation of neuronal synapses by ligand—induced celladhesion. Nat Neurosci,2007. 293-3006、逆转录反应(reverse transcription, RT)逆转录反应采用20 μ 1反应体系,在无RNA酶的0.5ml EP管中进行反应,具体步骤如下细胞总 RNA 2μ g,0. 5μ g/μ 1 ol igo (dT) 1 μ 1,补充 DEPC 处理水至 10μ 1。65°C 孵育 5min。在冰上放置Imin后,按顺序加入下列反应物2. 5mM dNTP 5μ 1、 5XAMVbuffer 4yl、RNA 酶抑制剂(RNsin) 0. 5 μ 1、10U/μ 1 AMV 逆转录酶 (reversetranscriptase) 0. 5 μ 1。加入后总反应体积为20 μ 1。混勻后42°C反应60min,然后80°C反应IOmin以除去过量的AMV逆转录酶,得到cDNA产物,_20°C保存备用。7、实时定量聚合酶联反应(Real-time PCR)采用SYBR Green 染料 PCR 反应法。反应体系cDNA 1. 0 μ 1,2 X SYBRGreen PCR Master mix 12. 5 μ 1,Η20 11. 5 μ 1,总体积 25. 0 μ 1。PCR循环50°C 2min — 95°C IOmin —( 95°C 15sec — 60°C lmin) X 40 个循环统计学分析数据除特别说明外,先以每次实验培养基对照组结果为100%,对其他各组进行标准化处理。处理后的数据用均数士标准误(mean士SEM)表示,采用SAS6. 12软件包进行统计学分析。多组数据间比较用单因素方差分析(one wayANOVA),如果有统计学意义,再采用 Student-Newmann-Keuls法进行两两比较。两组数据的比较采用团体设计Student,st检验。当P <0.05时,认为有统计学差异。( 二 )结果分析一、哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元的保护作用1、哈巴俄苷对离体中脑多巴胺神经元的影响10 μ M哈巴俄苷对离体中脑TH⑴神经元的数量和突起长度均无明显影响(均P > 0. 05)。
2、哈巴俄苷保护MPP+损伤的中脑TH⑴神经元的作用在MPP+损伤前24小时给予哈巴俄苷进行预保护。如图2所示,随着哈巴俄苷的浓度从ΟμΜ增加到ΙΟμΜ,中脑ΤΗ(+)神经元的数量和突起长度呈现增加的趋势。 ΙμΜ和ΙΟμΜ哈巴俄苷使MPP+损伤的中脑ΤΗ(+)神经元相对数量从(0. 604 士 0. 010) 增加至(0. 739士0. 015)和(0. 842士0. 034),分别增加了 22. 4 % (P < 0. 01)和 39. 4 % (P < 0. 001) ;ΤΗ(+)突起相对长度从(0. 488 士 0. 022)增加到(0. 657 士 0. 025)和 (0. 724 士 0. 020),分别增加了 36. 3 % 和 48. 4 % (均 P < 0. 001)。而 0. 1 μ M 哈巴俄苷对 MPP+ 损伤的中脑ΤΗ(+)神经元的数量和突起长度影响均不明显(均P > 0. 05)。二、哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元的修复作用10 μ M哈巴俄苷在MPP+损伤24小时后加入到细胞培养体系中,如图3所示,随着哈巴俄苷的浓度从0 μ M增加到100 μ Μ,中脑TH⑴神经元的数量和突起长度呈现增加的趋势。10 μ M和100 μ M哈巴俄苷使MPP+损伤的中脑ΤΗ(+)神经元相对数量从(0. 699士0. 020) 增加至(0. 781 士0. 021)和(0. 824士0. 018),分别增力卩 J 11. 7 % (P < 0. 05)和 17. 9 % (P < 0. 001) ;ΤΗ(+)突起相对长度从(0. 499 士 0. 027)增加到(0. 682 士 0. 037)和 (0. 737 士 0. 014),分别增加了 36. 7%和 47. 7% (均P < 0. 001)。而 1 μΜ 哈巴俄苷对 MPP+ 损伤的中脑ΤΗ(+)神经元的数量和突起长度影响均不明显(均P > 0. 05)。三、PPl抑制RET酶活力的情况下,哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元的影响1、在哈巴俄苷预保护后MPP+损伤的离体中脑细胞实验中,预保护前IOmin所加 PPl的作用在哈巴俄苷预保护后MPP+损伤的离体中脑细胞上,如图4所示预保护前IOmin所加PPi可引起ΤΗ(+)神经元相对数量从(0. 851 士0. 009)降低到(0. 693士0. 023),降低了 18.6% (P < 0. 01),ΤΗ(+)突起相对长度从(0.719 士 0.028)降低至(0. 451 士 0. 010),降低了 62. 7% (P < 0. 001)。2、PPl抑制RET激酶活性时,哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元的保护作用被部分抑制PPl抑制RET激酶活力的情况下,哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑TH⑴神经元突起相对长度的保护作用被完全抑制,ΡΡ1+ΜΡΡ+处理组(0. 419士0. 036)与PPl+哈巴俄苷+MPP+ 处理组(0. 451 士0.010)之间差别不显著;而哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑TH(+)神经元相对数量的保护作用仅被部分抑制,PPl+哈巴俄苷+MPP+处理组(0. 693士0. 023)比ΡΡ1+ΜΡΡ+ 处理组(0. 575士0. 021)仍然提高了 20. 5% (P < 0. 05)。证明哈巴俄苷对拟PD模型保护和修复作用是与GDNF密切相关。四、哈巴俄苷对中脑细胞培养体系中GDNF mRNA水平的影响1、哈巴俄苷对离体中脑细胞⑶NF mRNA水平的影响如图5所示,MPP+损伤24小时后哈巴俄苷对离体中脑细胞中⑶NFmRNA水平影响不明显。2、哈巴俄苷对MPP+损伤中脑细胞⑶NF mRNA水平的影响在ΙΟμΜ MPP+损伤后0 72小时内,离体中脑细胞⑶NF mRNA水平没有明显改变。哈巴俄苷预保护24小时引起MPP+损伤中脑细胞内⑶NF mRNA水平,在损伤后0 72小时内,呈现先升高后降低的变化,其中第24小时处(即哈巴俄苷处理后的第48小时)最高,与对应的模型组比较明显升高(P < 0. 05)。⑶NF是Lin等1993年从大鼠胶质细胞株B49中提取的一种蛋白质,对DA神经元有特异性营养作用。⑶NF是转化生长因子-β (transforming growthfactor-β,TGF-β )超家族成员之一,由134个氨基酸残基构成,蛋白分子量32kD,以二硫键连接成同源二聚体。 (1)表达中枢神经系统内神经元和胶质细胞均表达⑶NF。Pochon等用⑶NF和TH双标记原位杂交证实黑质大多数DA神经元表达⑶NF,除表达于黑质外,⑶NF还广泛表达在皮层、 海马、纹状体、丘脑、小脑和脊髓等。(2)受体GDNF的受体由两个部分构成,一部分是与膜外糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol, GPI)耦联的直接与⑶NF结合的受体GFRa 1,另一部分是具有酪氨酸激酶活性部分RET。(3)信号转导GDNF以二聚体的形式与单体或二聚体的特征性GFRa 1结合形成复合体,再与RET作用并使其二聚化,诱发RET 自身磷酸化,激活受体酪氨酸激酶信号通路,主要有P13K/Akt通路和MEK/MAPK通路。除了上述⑶NF的信号通路外,近年来还从GFR α 1与RET之间的差异表达出发,发现了一种新的信号通路,独立于RET的⑶NF受体神经细胞粘着分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)介导的配基诱导细胞粘附,调控成神经细胞的迁移、化学吸附和突触形成。与健康对照组比较死亡PD患者脑内⑶NF水平变化情况,不同研究者的报道差异较大。Chauhan等采用免疫荧光法研究显示,死亡PD患者黑质⑶NF水平降低了 19. 4% (P < 0. 0001)。Mogi等采用高灵敏ELISA测定的研究表明在健康对照组和PD患者组的⑶NF 在多个脑区低于同区的BDNF,而且在黑质纹状体区显著高于小脑和前皮层,然而即使在黑质纹状体区PD患者的⑶NF水平与健康对照组也没有显著差别。Backman等采用实时定量 RT-PCR法研究发现死亡PD患者纹状体壳核(putamen)组织中I型GNDF mRNA水平呈现明显的中度上调而其受体cRet和GFRa 1表达未见显著变化,发明人认为PD患者黑质DA 神经元的大量丢失,同时伴有纹状体DA降低,可能靶向诱导GDNF表达的这种代偿性变化。 Collier等以MPTP颈内动脉注射至恒河猴,伴随DA的剧减,青中年猴纹状体BDNF水平降低,而老年猴不变;而⑶NF不因年龄改变和MPTP损伤而变化。Hirata等研究发现亚急性 MPTP损伤小鼠纹状体内Ret下调而GFR α 1保持不变。Schober等对亚急性MPTP损伤小鼠模型研究发现,MPTP损伤不是影响黑质DA神经元TH表型的丢失,而是引起黑质DA神经元的丢失,而⑶NF可缓解MPTP损伤所致黑质DA神经元的丢失和纹状体TH阳性纤维的丢失。本发明中也发现哈巴俄苷提高中脑细胞的⑶NF mRNA表达水平,而且以PPl抑制 GDNF的受体RET酶活力后哈巴俄苷促TH(+)神经元突起生长的作用被完全阻断,仍然保留部分促TH(+)神经元存活的作用。PPl为src家族蛋白激酶抑制剂,对各种蛋白激酶的 IC50 分别是:Lck, 5nM ;Fyn, 6nM ;RET, 80nM ;EGF-R, 250nM ;Abl, 1 μ M JAK2, 50μΜ;ΖΑΡ-70, 100μΜ。从上述数据可以看出,除了 src家族蛋白激酶Lck和Fyn外,RET 的IC50是最低的。在没找到对RET更为专一的抑制剂的情况下,我们选择PPl抑制RET的激酶活性来研究哈巴俄苷的药理学作用。结果显示诱导GDNF表达,是哈巴俄苷发挥对拟PD 模型保护和修复作用的一个重要途径。我们对哈巴俄苷进行研究,并发现能够保护并修复TH阳性神经元,减轻MPP+引起的神经元数量减少和突起缩短。哈巴俄苷诱导MPP+损伤大鼠中脑细胞培养体系中GDNF mRNA的表达,而抑制GDNF受体RET激酶活力也将会削弱哈巴俄苷的神经保护作用。换言之,哈巴俄苷保护或修复MPP+损伤大鼠中脑多巴胺神经元的作用部分通过诱导GDNF的表达完成的。从以上实验数据,可以得出本发明的优点在于(1)本发明对哈巴俄苷发掘了新的医疗及保健用途,开拓了一个新的应用领域。(2)本发明中证实了哈巴俄苷对中枢神经系统多巴胺能神经元有明显保护作用, 而这种保护作用和多巴胺能神经提高胶质细胞源神经生长因子(⑶NF)基因表达密切相关,哈巴俄苷还能够对MPTP诱导的PD慢性小鼠模型脑具有神经保护作用,它可能通过改善黑质纹状体通路功能,保护多巴胺能神经系统来恢复MPTP诱导的运动功能障碍。
图1为实验流程图其中,图IA为哈巴俄苷对MPTP+诱导多巴胺神经元损伤保护作用的实验方案;图IB为哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元修复(治疗)作用的实验方案;图IC为PPl抑制RET酶活力的情况下,哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元影响的实验;图ID为哈巴俄苷对MPP+损伤中脑细胞GDNF mRNA水平影响的实验。图2为哈巴俄苷对原代培养中脑细胞中TH阳性神经元的数量和突起长度的保护作用其中,图2A为免疫细胞化学染色中脑多巴胺神经元TH,Nikon倒置显微镜下摄图;图 2B为在100倍放大的视野下计数TH阳性神经元数量的统计数据;图2C为在200倍视野下测量视野中的每个TH阳性神经元最长的突起统计数值。图3为哈巴俄苷对原代培养中脑细胞中TH阳性神经元的数量和突起长度的修复作用其中,图3A为先予以MPP+损伤再以哈巴俄苷处理中脑细胞的免疫细胞化学染色图; 图:3B为在100倍放大的视野下计数TH阳性神经元数量的统计数据;图3C为在200倍视野下测量视野中的每个TH阳性神经元最长的突起统计数值。图4为哈巴俄苷的保护作用被⑶NF受体RET抑制剂PPl完全阻断其中,图4A为图IC处理中脑细胞的免疫细胞化学染色图;图4B为PPl处理后哈巴俄苷对TH阳性神经元数量增加的作用被阻断;图4C为PPl处理后哈巴俄苷对促进TH阳性神经元突起长度的作用被抑制。图5为哈巴俄苷对原代培养中脑细胞中⑶NF mRNA表达的影响。图6为哈巴俄苷药品剂型的制作流程。
具体实施方式以下结合附图对本发明做详细说明。实施例1 哈巴俄苷保护对MPTP+诱导的神经元损伤作用方法中脑多巴胺神经元的培养同前,处理按图IA的实验方案。细胞存活率测定采用MTT法。培养细胞用PBS洗一次,每孔加入MTT (0. 5mg/ml), 孵育4小时后,吸弃上清,加入DMS0,振荡器上振荡15分钟使全部溶解,酶标仪490nm读取吸光度。细胞存活率=(不加MPTP+组OD-加MPTP+组0D) / (不加MPTP+组OD-MPTP+组 0D) X 100%,得到细胞存活数量的变化值。结果细胞活性分析的实验中观察到MPTP+对原代神经细胞的损伤的毒性作用,加入不同浓度哈巴俄苷(10_6M,10- 存活细胞百分比从65.0%升高至80. 9%及87. 3%,与
9对照组相比,均具有显著差异(P < 0. 01和P < 0. 001)(表1)。然而KTfiM哈巴俄苷存活细胞百分比增加到73. 4%,但是统计学上无显著性差异。哈巴俄苷保护对MPTP+诱导的神经元损伤作用(均数士SE,η = 8)
细胞存活数量(%)
对照组100±0.00MPTP+模型组65.0 士 2.21MPTP++哈巴俄苷(10_7Μ)组73.4 士 3.68MPTP++哈巴俄苷(I(T6M)组80.9 士 2.10*MPTP++哈巴俄苷(10·5Μ)组87.3 士 1.27***Ρ < 0. 01,**Ρ < 0. 001,MPTP++ 哈巴俄苷组与 MPTP+ 模型组比较实施例2 哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元的保护作用免疫细胞化学染色中脑多巴胺神经元酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH),TH阳性⑴细胞数的变化是PD的标志性酶。图2A是采用图IA的实验方案,得到的图片。在Nikon倒置显微镜下观察,每个培养孔在100倍放大的视野下分别拍摄10张图片, 计数TH阳性神经元数量,200倍视野下测量视野中的每个TH阳性神经元的最长的突起,用于评估TH阳性神经元突起长度。图2B显示随着哈巴俄苷的浓度从0. ΙμΜ增加到10 μ Μ,中脑TH⑴神经元的数量呈现增加。ΙμΜ和 ομ M哈巴俄苷使MPP+损伤的中脑TH⑴神经元相对数量从(0. 604士0. 010)增加至(0. 739士0. 015)和(0. 842士0. 034),分别增加了 22. 4 % (P < 0. 01)禾Π 39. 4% (P < 0. 001)。而0. 1 μ M哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑ΤΗ(+)神经元的数量影响不明显(均Ρ>0. 05)。图2Α是在200倍视野下测量视野中的每个TH阳性神经元的最长的突起,用于评估TH阳性突起长度。如图2C所示,随着哈巴俄苷的浓度从0. 1 μ M增加到10 μ Μ,中脑ΤΗ(+) 神经元的突起长度呈现增加的趋势。1 μ M和10 μ M哈巴俄苷使MPP+损伤的中脑TH⑴神经元突起相对长度从(0.488 士0.022)增加到(0.657 士0.025)和(0. 7 士0. 020),分别增加了 36. 3%和48. 4% (均P <0.001)。而0. 1 μ M哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑TH(+)神经元的突起长度影响也不明显(P > 0. 05)。上述结果证明以1 μ M和10 μ M哈巴俄苷预保护时,均显著保护MPP+损伤的中脑 ΤΗ(+)神经元数量和突起长度,也是保健品应用的依据。实施例3 哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑多巴胺神经元的修复(治疗)图3Α是采用图IB的实验方案,免疫细胞化学染色得到中脑多巴胺神经元图片。计数TH阳性神经元的数量和突起长度显示,10 μ M哈巴俄苷在MPP+损伤M小时后加入到细胞培养体系中,随着哈巴俄苷的浓度从0. ΙμΜ增加到10(^11,中脑^(+)神经元的数量(图3Β)和突起长度(图3C)呈现增加的趋势。ΙΟμΜ和ΙΟΟμΜ哈巴俄苷使MPP+损伤的中脑TH(+)神经元相对数量从(0.699士0.020)增加至(0. 781 士0.021)和 (0.拟4士0. 018),分别增加了 11. 7% (P < 0. 05) ^P 17. 9% (P < 0. 001) ;TH(+)突起相对长度从(0. 499士0. 027)增加到(0. 682士0. 037)和(0. 737士0. 014),分别增加了 36. 7%禾口 47.7% (均P<0.001)。而ΙμΜ哈巴俄苷对MPP+损伤的中脑TH(+)神经元的数量和突起长度影响均不明显(均P > 0. 05)。上述结果证明先予以MPP+损伤再以哈巴俄苷处理,10 μ M和100 μ M哈巴俄苷均能显著修复(治疗)ΜΡΡ+损伤的中脑ΤΗ(+)神经元神经元数量和突起长度。PD显著的神经化学改变是纹状体内多巴胺(DA)水平降低。在体内,TH是DA合成过程中的限速酶。Damier等研究发现在PD患者脑内,TH阳性神经元在SNpc丢失的程度与病程有关,哈巴俄苷提高TH阳性细胞数量和突起长度,从而可以使黑质中TH量增加,有利于黑质纹状体通路中DA的合成,改善PD的病理变化。实施例4 哈巴俄苷对MPP+损伤中脑细胞⑶NF mRNA水平的提升作用实验设计了模型组和哈巴俄苷预保护模型组在5个时间点(MPP+损伤后0,6,24, 48,72h)⑶NF mRNA水平在的变化。在预实验的基础上选择在MPP+损伤后M小时加上DMSO 对照组和哈巴俄苷处理组。在实验中哈巴俄苷终浓度设为1 μ M,MPP+终浓度设为10 μ Μ。 培养大鼠中脑细胞分组与处理按图ID进行,不同时间收集细胞。抽提总RNA,与oligo(dT) 在逆转录酶促反应条件下得到cDNA,然后用ABI公司的STOR Green试剂盒,实验方法按说明书,在ABI 7000进行实时定量聚合酶联反应(Real-time PCR)。用反应的CT值进行⑶NF 表达的数据统计。图5肌寸0 结果显示,1(^]\1 MPP+损伤后0 72小时内,离体中脑细胞⑶NF mRNA 水平没有明显改变。哈巴俄苷预保护M小时引起MPP+损伤中脑细胞内GDNF mRNA水平时相变化,在损伤后0 72小时内,呈现先升高后降低的变化,其中第M小时处(即哈巴俄苷处理后的第48小时)最高,与对应的模型组比较明显升高(P < 0. 05)。总之,哈巴俄苷能显著提高⑶NF mRNA表达水平,而且在MPP+损伤后24h处作用最强。结论哈巴俄苷保护或修复MPP+损伤大鼠中脑多巴胺神经元部分通过诱导⑶NF 的表达完成的,即哈巴俄苷均有可能成为一类通过诱导神经营养因子发挥抗PD作用的一类新型药物。药品剂型的制作流程见附图6。1. 口服胶囊定量与辅型剂混合制成口服胶囊,推荐剂量IOmg/天/成人。2. 口服片剂推荐剂量IOmg 40mg/天/成人。
权利要求
1.哈巴俄苷在制备治疗或预防帕金森氏症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的哈巴俄苷在制备治疗或预防帕金森氏症药物中的应用,其特征在于哈巴俄苷的浓度为10_6M-10_5M数量级。
3.哈巴俄苷在制备治疗或预防帕金森氏症保健品中的应用。
4.根据权利要求3所述的哈巴俄苷在制备治疗或预防帕金森氏症保健品中的应用,其特征在于哈巴俄苷的浓度为10_7M数量级。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用,其特征在于哈巴俄苷保护或治疗脑多巴胺神经元的作用通过诱导⑶NF的表达来实现。
全文摘要
本发明对哈巴俄苷发掘了新的医疗及保健用途,开拓了一个新的应用领域。证实了口服哈巴俄苷对中枢神经系统黑质纹状体多巴胺神经元的退行性病变有明显保护作用,这种保护作用包括预防和治疗两个方面,和哈巴俄苷提高胶质细胞源神经生长因子(GDNF)的基因表达及蛋白质水平密切相关,从而解决了GDNF虽然对黑质纹状体多巴胺能神经元的退行性病变有防治作用但不能通过血脑屏障的难题,并证实哈巴俄苷对于治疗或预防神经退行性疾病尤其是帕金森氏症具有良好的应用前景。
文档编号A61K31/7048GK102198143SQ20101013666
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者夏宗勤, 张永芳, 熊中奎, 胡雅儿 申请人:上海交通大学医学院