专利名称：一种生产人表皮生长因子(egf)的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，属生物工程领域。
背景技术：
1962 年，美国 Dr. Manley Cohen 博士与意大利科学家(Rita Levi-Montalcini) 教授发现了决定皮肤年龄的“表皮生长因子”EGF(Epidermal Growth lector)，他们因此获得了世界科学的最高奖之一——诺贝尔生理学奖。表皮细胞生长因子是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活细胞，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞.EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效.EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤、促进伤口愈合、修复肠胃道、肝脏和眼角膜的损伤等，功效十分显著。尽管目前已有一些EGF的基因工程生产方法，但这些方法均存在着发酵液中产物浓度低，提取工艺复杂，操作成本高及收率低等缺点，因此，至今为止，尚未有一个成熟的工业化发酵生产工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法简单、不受环境影响、周期短的用基因工程大肠杆菌生产人表皮生长因子(EGF)的方法。为了达到上述目的，本发明采取下列措施一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，生产步骤如下(1)工程菌发酵从保存的菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中达到一定的浓度，经摇床培养，按比例的接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其继续在摇床培养，之后，再按比例的接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中培养，然后温度诱导，继续培养一定时间。人表皮生长因子(EGF) 表达于菌种中。(2)扩张床吸附用冷冻离心机将发酵液离心，弃上清液保留沉淀保存备用。取适量沉淀，用数倍量的缓冲液溶解，经超声处理若干个循环，再用冷冻离心机将缓冲液离心，弃上清液，取沉淀用裂解液溶解，再离心，收集上清液，用层析系统将该上清液加入扩张床中，用缓冲液以相同速度洗涤至波长为^Onm时紫外吸收峰值为零，再用缓冲液以一定比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将复性液液加入扩张床中，用精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用氯化钠和精氨酸缓冲液以一定比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，洗脱液于在一定温度条件下保存备用。(3)、凝胶分离用层析系统将洗脱液加入到凝胶层析柱中，然后将精氨酸缓冲液洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长^Onm下进行检测，收集保留吸收峰，收集原液。0)、冷冻升华干燥将收集液冷冻升华干燥，得白色干粉状人表皮生长因子(EGF)。
具体实施例方式实施例一(1)工程菌发酵从_70°C保存的菌种管中挑取单菌落接入5_15ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/mlJ8-32°C，150-250rpm摇床培养8_12小时，按1-8%接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在 50-200mg/mlJ8-32°C，150-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8%接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，29-31°C，160-240rpm，PH值维持7.0，培养9-11小时，然后温度诱导， 继续培养2-8小时。人表皮生长因子(EGF)表达于菌种中。(2)扩张床吸附用冷冻离心机将发酵液与2-18°C条件下以6000-12000rpm的速度离心10_30min， 弃上清液保留沉淀于2-18°C条件下保存备用。取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，700-1800W超声处理10- 个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与2_18°C 条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液，取沉淀用15-45倍裂解液溶解， 6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将100_800ml的该上清液以 1. 5-8. 5ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为^Onm时紫外吸收峰值为零，再用含IM氯化钠20mMTris缓冲液以7%比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将1500-3500ml 的复性液液以4-lOml/min速度加入source 30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为^Onm时紫外吸收峰值为零，再用含0. 75M氯化钠15mM精氨酸缓冲液以 10%比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，洗脱液于2-18°C条件下保存备用。(3)、凝胶分离用层析系统将15-30ml上面洗脱液以4-8ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以4-8ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长^Onm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为220480ml。0)、冷冻升华干燥将收集液于-35 °C至_42°C下冷冻升华干燥，得白色干粉状人表皮生长因子 (EGF)。实施例二 (1)工程菌发酵从_70°C保存的菌种管中挑取单菌落接入IOml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到100mg/ml，30°C，200rpm摇床培养10小时，按5 %接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在100mg/ml，3(TC， 200rpm摇床培养10小时，再按5 %接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，30°C， 200rpm, PH值维持7. 0，培养10小时，然后温度诱导，继续培养4小时。人表皮生长因子 (EGF)表达于菌种中。(2)扩张床吸附用冷冻离心机将发酵液与4°C条件下以IOOOOrpm的速度离心30min，弃上清液保留沉淀于4°C条件下保存备用。取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，900w超声处理25个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与4°C条件下以IOOOOrpm的速度离心30min，弃上清液，取沉淀用20倍裂解液溶解，IOOOOrpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将200ml的该上清液以;3ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用 20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含IM氯化钠 20mMTris缓冲液以7%比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将2000ml的复性液液以Sml/min速度加入source 30Q扩张床中， 用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为^Onm时紫外吸收峰值为零，再用含0. 75M 氯化钠15mM精氨酸缓冲液以10%比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，洗脱液于4°C条件下保存备用。(3)、凝胶分离用层析系统将25ml上面洗脱液以6. 5ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以6. 5ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长^Onm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为250ml。0)、冷冻升华干燥将收集液于-40°C下冷冻升华干燥，得白色干粉状人表皮生长因子(EGF)。利用上述方法制得的人表皮生长因子(EGF)，具有发酵液中产物浓度高(大于 100mg/L，较以往的技术提高一倍)，提取工艺简单(只需要3步层析操作，较之前工艺简化丄倍)，操作成本低及纯度高(90 %以上)，是一个较为成熟的工业化发酵生产工艺，经济效益十分显著。
权利要求
1.一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，其特征在于它的生产步骤如下(1)工程菌发酵从保存的菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中达到一定的浓度，经摇床培养，按比例的接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其继续在摇床培养，之后，再按比例的接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中培养，然后温度诱导，继续培养一定时间。人表皮生长因子(EGF)表达于菌种中。(2)扩张床吸附用冷冻离心机将发酵液离心，弃上清液保留沉淀保存备用。取适量沉淀，用数倍量的缓冲液溶解，经超声处理若干个循环，再用冷冻离心机将缓冲液离心，弃上清液，取沉淀用裂解液溶解，再离心，收集上清液，用层析系统将该上清液加入扩张床中，用缓冲液以相同速度洗涤至波长为^Onm时紫外吸收峰值为零，再用缓冲液以一定比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将复性液液加入扩张床中，用精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用氯化钠和精氨酸缓冲液以一定比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，洗脱液于在一定温度条件下保存备用。(3)、凝胶分离用层析系统将洗脱液加入到凝胶层析柱中，然后将精氨酸缓冲液洗脱直至出峰完毕， 用紫外检测检测仪在波长^Onm下进行检测，收集保留吸收峰，收集原液。G)、冷冻升华干燥将收集液冷冻升华干燥，得白色于粉状人表皮生长因子(EGF)。
2.根据权利要求1所述的一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，其特征在于它的生产步骤如下(1)工程菌发酵从_70°C保存的菌种管中挑取单菌落接入5-15ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/mlJ8-32°C，150-250rpm摇床培养8_12小时， 按1-8%接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在 50-200mg/mlJ8-32°C，150-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8%接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，29-31°C，160-240rpm，PH值维持7. 0，培养9-11小时，然后温度诱导，继续培养2-8小时。人表皮生长因子(EGF)表达于菌种中。(2)扩张床吸附用冷冻离心机将发酵液与2-18°C条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液保留沉淀于2-18°C条件下保存备用。取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解， 700-1800w超声处理10- 个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与2_18°C条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液，取沉淀用15-45倍裂解液溶解， 6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将100_800ml的该上清液以 1. 5-8. 5ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为^Onm时紫外吸收峰值为零，再用含IM氯化钠20mMTris缓冲液以7%比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将1500-3500ml的复性液液以4-lOml/min速度加入source 30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0. 75M氯化钠15mM精氨酸缓冲液以 10%比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，洗脱液于2-18°C条件下保存备用。(3)、凝胶分离用层析系统将15-30ml上面洗脱液以4-8ml/min的速度加到SuperdeX30凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以4-8ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长^Onm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为220480ml。G)、冷冻升华干燥将收集液于_35°C至_42°C下冷冻升华干燥，得白色干粉状人表皮生长因子(EGF)。
3.根据权利要求1所述的一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，其特征在于它的生产步骤如下(1)工程菌发酵从_70°C保存的菌种管中挑取单菌落接入IOml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素， 使其在培养基中的浓度达到100mg/ml，30°C，200rpm摇床培养10小时，按5%接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在100mg/ml，30°C，200rpm摇床培养10小时，再按5%接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，30°C，200rpm，PH值维持7.0，培养10小时，然后温度诱导，继续培养4小时。人表皮生长因子(EGF)表达于菌种中。(2)扩张床吸附用冷冻离心机将发酵液与4°C条件下以IOOOOrpm的速度离心30min，弃上清液保留沉淀于4°C条件下保存备用。取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，900w超声处理 25个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与4°C条件下以IOOOOrpm的速度离心 30min,弃上清液，取沉淀用20倍裂解液溶解，IOOOOrpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将200ml的该上清液以3ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为^Onm时紫外吸收峰值为零，再用含IM氯化钠20mMTris缓冲液以7%比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性， 用层析系统将2000ml的复性液液以8ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0. 75M氯化钠15mM 精氨酸缓冲液以10%比例洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，洗脱液于4°C条件下保存备用。(3)、凝胶分离用层析系统将25ml上面洗脱液以6. 5ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中， 然后将15mM精氨酸缓冲液以6. 5ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长^Onm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为250ml。G)、冷冻升华干燥将收集液于-40°C下冷冻升华干燥，得白色干粉状人表皮生长因子(EGF)。
4.根据权利要求1或2所述的一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，其特征在于扩张床吸附过程中，含IM氯化钠20mMTris缓冲液为洗脱液洗脱时所占比例为7%，含 0. 75M氯化钠15mM精氨酸为洗脱液洗脱时所占比例为10%。
5.根据权利要求1或2所述的一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，其特征在于所用裂解液为20mM三羟甲基氨基甲烷、8M尿素、0. 1% β -巯基乙醇所组成的缓冲液。
6.根据权利要求1或2所述的一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，其特征在于所用复性液为50mM精氨酸、IOmM氯化钠、10%甘油所组成的缓冲液。
7.根据权利要求1或2所述的一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，其特征在于冷冻干燥收集液中所添加辅料为注射用甘露醇和海藻糖。
8.根据权利要求1或2所述的一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，其特征在于其既可用于化妆品也可用于烧烫伤患者，对I型糖尿病患者，尤其是糖尿病足坏疽、糖尿病引发的眼肌都有很好的作用效果。
全文摘要
本发明公开了一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法，它是采用工程菌发酵从保存的菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中加入氨苄青霉素，摇床培养；扩张床吸附，用冷冻离心机将发酵液离心，弃发酵液保留沉淀，超声处理后离心，入扩张床，洗脱，收集含人表皮生长因子(EGF)的洗脱峰，洗脱液保存备用；凝胶分离，用层析系统将洗脱液加到凝胶层析柱中，缓冲洗脱液，保留吸收峰；冷冻升华干燥工艺获得，本发明具有方法简单、产物浓度高、操作成本低、收率高、提取工艺简单的优点。
文档编号A61P3/10GK102212596SQ20101013743
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月1日 优先权日2010年4月1日
发明者孙民富 申请人:孙民富