专利名称：用于治疗皮肤创伤之医药组合物的制作方法
技术领域：
本发明系关于皮肤创伤治疗之技术领域。具体而言，本发明提供一种治疗皮肤创伤之医药组合物，其包括脐带间质干细胞。
背景技术：
皮肤是身体在面对外在威胁性伤害、微生物等，的第一道防御关卡。在生理上具有重要功能。创伤、烧烫伤、慢性溃疡等，可能会造成皮肤构造严重损害，影响其皮膜屏障的初级免疫功能，进而可能伴随全身性难以估计之危险。皮肤创伤的愈合主要必须历经发炎反应、表皮再生、肉芽组织(granulation tissue)生成、血管增生，创伤收缩以及细胞外基质重新构建等过程，才能帮助创伤后再生的皮肤组织。近年来随着干细胞研究的兴起，研究人员使用不同来源的干细胞给予创伤皮肤治疗，期望干细胞能够在各方面帮助整个皮肤创伤的再生与重建，且已达不错成效(Yaojiong et al. , Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation andangiogenesis. Stem Cells,25(10) :2648-59, 2007)。惟大部分干细胞来源不易取得，有些甚至有道德或安全上的疑虑，仍有许多问题待解决。人类脐带是一种生产后的废物，来源取得容易，没有道德顾虑，处理方式简单，而且人类脐带干细胞数量极多、繁殖快速，是很好的干细胞来源。过去研究出移植人类脐带间质干细胞于大白鼠纹状体中，植入的细胞可以存活在大白鼠脑中四个月，表示人类脐带间质干细胞，不会引起宿主的免疫及排斥反应。因此，人类脐带间质干细胞为一株适合用于进行异体移植的良好干细胞来源。
发明内容
在一方面，本发明提供一种用于治疗皮肤创伤之医药组合物，其包括脐带间质干细胞(umbilical mesenchymal stem cells)。特定而言，所述医药组合物可促进创伤愈合。再另一方面，本发明是针对脐带间质干细胞之用途，其用以制备供治疗治疗皮肤创伤之医药。在一具体实施例中，所述脐带间质干细胞来自人类。
前文之所述以及实施方式可通过说明书附图达到更好的说明效果。为了加强本发明之说明，将适当的实施例之附图列举于此。图1是HUMSCs与真皮纤维母细胞共同培养，于时间点0小时、M小时、48小时、72 小时观察其爬行补回缺口的情形，发现与HUMSCs共同培养的大鼠真皮纤维母细胞爬行能力较好(图1A)，发现在M小时和48小时有显著差异(ρ < 0. 05，图1B)，发现与HUMSC共同培养的纤维母细胞分泌到培养液中的胶原蛋白量明显较多(P < 0. 05，图1C)。图2为HUMSCs处理创伤皮肤之创伤变化情形纪录，显示移植组的愈合速度较快 (图2A)，移植组创伤面积的百分比和控制组相比显著较低(ρ < 0. 05，图2B)。
图3为HUMSCs处理创伤皮肤后第4、8及14天控制组及HUMSCS治疗组连续切片 HE染色的结果(图3A)，给予HUMSCs治疗的创伤剩于体积较控制组小(ρ < 0. 05，图3Β)， 移植组之创伤两侧毛囊间距离较近(P < 0. 05，图3C)。图4为HUMSCs处理创伤皮肤在皮肤创伤愈合的过程中观察嗜中性球吸引巨噬细胞聚集的结果，控制组皮肤组织第二天和第四天有MPO反应之细胞表现极低(图4中的Α、
C)，而移植组皮肤组织第二天和第四天有MPO反应之细胞表现有增多的趋势(图4中的B、D)。图5为HUMSCs处理创伤皮肤后，EDl用以标识嗜中性球与巨噬细胞之结果，控制组在第二、第四天已有有EDl反应之细胞进入创伤部位(图5中的A、C)；移植组在第二、第四天有较多的有EDl反应之细胞浸润(图5中的B、D)；。在第十四天时，有EDl反应之细胞分布情形(图5中的E、F)，在皮肤构造已经构建完成的区域，控制组和移植组皆没有其分部(图5中的E中的El、F中的Fl)，而在皮肤构造上未构建完成区域仍有EDl反应之细胞分布于内(图5中的E中的E2)；在浸润现象已减缓的情况下，移植组仍留有较多有EDl 反应之细胞在其中(图5中的F中的F2)。图6A-6B为HUMSCs处理创伤皮肤后，胶原蛋白折叠情形(图6A中的A、B、C、D)， 第八天控制组在创伤部位仍无法累积构建真皮所必须之胶原蛋白(图6A中的E)。图7为HUMSCs处理创伤皮肤后与控制组织比较(图7中的A)，HUMSCs仍然存在于皮肤组织(图7中的D、E)，。在创伤愈合的过程中也具有爬行能力，可移动到皮肤创伤处(图7中的B、C)。
具体实施例方式除非另外定义，本文中所用的所有技术及科学词汇具有所属技术领域的技术人员所通常明了之相同意义。在本文中，冠词“一”指一个或一个以上(亦即，至少一个)之该冠词之文法客体。 举例而言，“一元件”意谓一个组件或一个以上之元件。在一方面，本发明提供一种用于治疗皮肤创伤之医药组合物，其包括脐带间质干细胞(umbilical mesenchymal stem cells) 0另一方面，本发明提供脐带间质干细胞之用途，其用以制备供治疗皮肤创伤之医药。本文所使用的“脐带间质干细胞” 一词指位于哺乳类动物脐带，较佳为人类脐带间质组织中之干细胞，可为未经纯化的细胞培养物或纯化后的细胞。以下实施例说明从个体组织取得脐带间质干细胞之流程。脐带为生产后废弃物，来源取得容易，没有道德顾虑，处理方式简单，数量极多、繁殖快速。且本实验室先前发现，移植人类脐带间质干细胞，不会引起宿主产生免疫排斥反应。所以人类脐带间质干细胞为一种适合用来进行异体移植的良好干细胞来源。本文所使用的“医药组合物”是指一种作为医药之混合物，其通常含有载体，诸如， 医药可接受之载体或赋形剂，其是所属技术领域的技术人员公知且适合投药至对象中，以作为治疗性、诊断性或预防性之目的，其亦可包括细胞培养物或细胞。医药组合物之形式可为溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊或粉末，其给药方式较佳为注射。本文所使用的“医药可接受之载体”指任何习知类型之无毒固体、半固体或液体之填充剂、稀释剂、包胶囊材料、调配物辅助剂或赋形剂。医药可接受之载体系在所用之剂量及浓度下，对接受者无毒性，且可与该调配物之其它成分兼容。医药可接受之载体一般均可由公众轻易取得。此外，医药可接受之辅助物质，诸如，PH调节及缓冲剂、渗透压调节剂、安定剂、湿润剂及类似物，亦皆可由公众取得。适当之载体包括，但不限于，水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合。载体可含有额外之试剂，诸如，湿润及乳化剂、PH缓冲剂或是佐剂，其可增强该调配物之有效性。局部性载体包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95% )、溶于水中的聚氧乙烯单月桂酸酯 (5%)或是溶于水中的十二烷基硫酸钠(5%)。可视需要加入其它材料，诸如，抗氧化剂、 保湿剂、黏度稳定剂及类似试剂。本发明之医药组合物可用于治疗皮肤创伤，个体较佳为哺乳动物，更佳为人类。在一具体实施例中，所述医药组合物可植入皮肤创伤，或置于皮肤创伤周围，或皮肤创伤上。 或施加于敷料在置于皮肤创伤上。本发明之各个具体实施例的细节说明如后。本发明之其它特征将会通过以下各个具体实施例中的详细说明及权利要求而清楚呈现。所属技术领域的技术人员可了解本发明具有各种实施例方式，下述具体实施例仅用以说明而非作为本发明之限制。除非另外定义，本文中所用之所有技术及科学词汇具有所属技术领域的技术人员所通常明了之相同意义。本发明之各个具体实施例的细节说明如后。本发明之其它特征将会经由以下各个具体实施例中的详细说明及申请专利范围而清楚呈现。所属技术领域的技术人员可了解本发明具有各种实施方式，下述具体实施例仅用以说明而非作为本发明之限制。实施例1 人类脐带间叶细胞之制备人类脐带以无菌操作方式收集并在4°C下储存于HBSS(BiOChrOmL201-10)不超过 24小时。脐带先泡在75%之乙醇中30秒以消毒。在无菌操作台中将消毒过之脐带置于无钙及无镁离子之缓冲溶液(CMF，Gibco 14185-052)，以消毒过之器具将脐带纵切，并将其中之血管及间叶组织(瓦顿氏凝胶)去除。将间叶组织切成0. 5立方厘米之小块，以250Xg 离心5分钟。去除上清液，并以适量之无血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉淀物二次，再以250Xg离心5分钟。间叶组织在37°C下以胶原酶(collagnase)处理14至18小时，清洗后，再以2. 5%之胰蛋白酶(trypsin)于37°C及震荡下处理30分钟。加入FBS(Hyclone SH30071. 03)至间叶组织以终止胰蛋白反应。此时间叶组织已变成间叶细胞。间叶细胞以 10% FBS-DMEM使其分散并计算其数量后，便可直接用于培养及进行后续实验。实施例2 大白鼠真皮纤维母细胞(Rat dermal fibroblasts)之体外培养初生3 5天的大白鼠，取其皮肤，加入胰蛋白酶(trypsin)以剔除表皮，再以胶原酶处理真皮组织，此时真皮组织内的纤维母细胞便可分离出来，再以10% FBS DMEM进行培养。利用blue tip尖端，将培养单层(monolayer)的真皮纤维母细胞刮出一道等距离的缺口，同时与人类脐带间质干细胞共同培养。于时间点0小时、24小时、48小时、72小时，由光学显微镜观察其爬行，补回缺口的情形，可以发现与人类脐带间质干细胞共同培养的大鼠真皮纤维母细胞爬行能力较好(图1A)。统计后，发现在M小时和48小时有显著差异(P < 0. 05，图 1B)。
实施例3 皮肤创伤的大白鼠模式建立取7周大，250g重之雄性大白鼠，剔除其背部毛，于两耳联机下1. 5cm，利用组织切割器(biopsy punch)移除直径8mm的皮肤，盖上防水透气贴布，以防止抓伤。本研究将实验动物分成两组，第一组为控制组，皮肤创伤建立后，立即于创伤周围四个点分别给予20 λ生理食盐水(saline)。第二组为实验组，皮肤创伤建立后立即于创伤周围四点分别移植5*105/20 λ人类脐带间质干细胞(HUMSCs)。实施例4 =HUMSCs对创伤皮肤产生胶原蛋白之影响将实验动物分成两组，第一组为控制组，皮肤创伤建立后，立即于创伤周围四个点分别给予20 λ之生理食盐水。第二组为实验组，分为大鼠真皮纤维母细胞单独培养，与纤维母细胞与干细胞共同培养两组，培养三天后收集细胞培养液，以可溶性胶原纤维测量套组(Sircol Soluble CollagenAssay kit)测量大白鼠皮肤组织内或细胞培养液中可溶性胶原纤维的含量。检测控制组及实验组之细胞培养液中之胶原蛋白含量结果显示，与干细胞共同培养之纤维母细胞的培养液中，每毫升含有(1沈3. 73士52. 24) μ g，较单独培养纤维母细胞组，每毫升(724. 83士78. 91) μ g的胶原蛋白相比，明显高出许多(ρ < 0. 05，图1C)。证实在体外培养系统中，与HUMSC共同培养后，纤维母细胞分泌到培养液中的胶原蛋白量明显较多。实施例5 =HUMSCs对皮肤创伤愈合之影响利用抗原抗体结合的原理，标定细胞内蛋白质所在位置的方法。本实验所用的初级抗体为兔抗-MPO抗体(Rabbit anti-MPO antibody)，小鼠抗-MPO抗体(Mouse anti-EDl antibody),小鼠抗-人类专一性细胞核抗原抗体(Mouse anti-human specific nuclei antigen antibody) 0作用后连接适当二级抗体，接着以DAB进行成色。由巨观型态定义其出血或湿润乃至形成血栓纤维蛋白(blood clottingfibrin) 是为创伤伤口，持续关注创伤变化情形，测量面积且持续记录其数值到第十四天为止。第四天，在移植HUMSCs之实验组(移植组)，观察到创伤有收缩现象，创伤面积较仅给予生理食盐水的控制组小，显示移植组的愈合速度较快(图2A)。经由统计发现自第四天起，移植组创伤面积的百分比和控制组相比显著较低(ρ <0.05，图2B)。另外，组内前后每两天进统计分析，移植组第二天到第四天的愈合面积比例有显著差异(P < 0. 05，图2B)，而控制组在此阶段并无差异，因此，我们推测此时间点为HUMSCs影响创伤愈合最剧的时机，后续便于此时观察创伤愈合微观变化与可能机制。 实施例6 =HUMSCs对皮肤创伤体积缩小及皮肤组织重建之效果
连续切片后HE染色的结果显示，第四天，已经有细胞浸润(蓝紫色)于皮肤创伤处。控制组被移除的皮肤仍有许多空洞，帮助创伤修复的细胞仍未完全进入创部(图3A，第 4天控制组)。移植组已经有许多细胞进入创伤帮助修复，且创伤体积较小(图3A，第4天移植组)。第八天，控制组的细胞浸润数量已将创伤部位填满HE染色呈现蓝紫色(图3A， 第8天控制组)。移植组浸润创伤部位的细胞已经开始释放细胞外基质，使HE染色红色部分明显(图3A，第8天移植组)。第十四天，创伤已经明显缩小，且毛囊等组织明显复原或再生，移植组的创伤后再生的皮肤厚度较接近周边正常皮肤构造，残余创伤两侧的毛囊距离也较控制组为近(图3A，第14天)。统计结果显示第四天、第八天以及第十四天愈合过程中，给予HUMSCs治疗的创伤剩于体积较控制组小(ρ < 0. 05，图3Β)。同时统计分析创伤两侧毛囊间距离，移植组较近(P < 0. 05，图3C)，第十四天，移植组的毛囊再生或是创伤收缩的能力较控制组为强。实施例7 =HUMSCs对创伤皮肤聚集嗜中性球与巨噬细胞之效果皮肤创伤愈合的过程中，嗜中性球(neutrophil)会自血管浸润到创伤部位，MPO 用以标识嗜中性球。结果显示，控制组皮肤组织中，第二天和第四天有MPO反应之细胞 (MPO-positive cells)表现极低(图4中的A、C)。移植组皮肤组织中，第二天和第四天有 MPO反应之细胞表现，从低倍到高倍的染色图观察到明显有增多的趋势(图4中的B、D)。 嗜中性球会吸引巨噬细胞的聚集，而巨噬细胞所分泌的细胞激素在皮肤创伤愈合过程中扮演关键角色。EDl用以标识嗜中性球与巨噬细胞。结果显示，控制组在第二、第四天已有EDl反应之细胞(EDl-positive cells)进入创伤部位(图5中的A、C)。移植组在第二、第四天有较多的有EDl反应之细胞浸润(图5中的B、D)。在第十四天时，有EDl反应之细胞分布情形(图5中的E、F)，可由两部分观察。第一，在皮肤构造已经构建完成的区域，控制组和移植组皆没有其分部(图5中的E中的E1、F中的F1)。第二，在皮肤构造上未构建完成区域仍有有EDl反应之细胞分布于内(图5中的E中的E2)，在浸润现象已减缓的情况下，移植组仍留有较多有EDl反应之细胞在其中(图5中的F中的F2)，可持续改善其最后阶段的组织再生。实施例8 =HUMSCs对创伤皮肤胶原蛋白之构建以sirius red标定壁层腹膜组织中的胶原蛋白，即红色区域，用以定量真皮胶原蛋白折叠构建在创伤皮肤部位的比例。结果显示，第二天和第四天，控制组和移植组的皮肤组织中，胶原纤维的表现量都跟周围正常构造皮肤相比都较低，且在生皮肤的胶原纤维与下层筋膜的界线难以分辨，故无法确实判定胶原蛋白折叠情形(图6A中的A、B、C、D)。第八天，控制组在创伤部位仍无法累积构建真皮所必须之胶原蛋白(图6A中的E)。移植组则明显堆栈许多胶原蛋白(图6A中的F)。在第十四天时移植组的胶原蛋白在创伤处的分部比例(80. 27 士 5. 19) %，明显高于控制组(33. 22 士 1. 18) %，其创伤皮肤组织内的胶原蛋白分部，明显优于控制组(P < 0. 05，图6A中的I)。实施例9 =HUMSCs于创伤皮肤之再构建移植后第二周，以抗人类专一性细胞核抗原(anti-human specific nucleiantigen)标定的人类脐带间质干细胞之细胞核，仍然存在于皮肤组织(图7中的D、 图7中的E)。在创伤愈合的过程中，其也具有爬行能力，可移动到皮肤创伤处(图7中的 B、图7中的C)，持续帮助皮肤组织的再构建。显示HUMSCs对于治疗皮肤创伤有极佳之效
统计分析 所有数据以Mean 士 SEM表示。各组之平均值以One-Way ANOVA或Two-Way ANOVA 分析，再以LSD test进行多重比较。实验数据ρ <0.05判定为具有显著差异。
所属技术领域的技术人员将可在不背离本发明精神之下，根据实施例进行改变和修改。要注意的是，本发明并不受限于说明书中实施例所揭示之范围，而涵盖于其它根据权利要求所揭示的所有变化之形式。
权利要求
1.一种用于治疗皮肤创伤之医药组合物，其包括脐带间质干细胞。
2.根据权利要求1所述之医药组合物，其特征在于，可促进创伤愈合。
3.根据权利要求1或2所述之医药组合物，其特征在于，脐带间质干细胞为植入皮肤创伤。
4.根据权利要求1或2所述之医药组合物，其特征在于，脐带间质干细胞为置于皮肤创伤周围。
5.根据权利要求1或2所述之医药组合物，其特征在于，脐带间质干细胞为置于皮肤创伤上。
6.根据权利要求1或2所述之医药组合物，其特征在于，脐带间质干细胞系来自人类。
7.根据权利要求1或2所述之医药组合物，其特征在于，该医药组合物置于敷料上。
8.一种脐带间质干细胞之用途，其用于制备供治疗皮肤创伤之医药。
9.根据权利要求8所述之用途，其特征在于，该医药可促进创伤愈合。
10.根据权利要求8所述之用途，其特征在于，该脐带间质干细胞系来自人类。
全文摘要
本发明提供一种用于治疗皮肤创伤之医药组合物，其包括脐带间质干细胞。特定而言，所述医药组合物可促进创伤愈合。同时，本发明针对脐带间质干细胞之用途，提供了一种用以制备供治疗皮肤创伤的医药。
文档编号A61P17/02GK102198156SQ20101013965
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者傅毓秀, 施养性 申请人:傅毓秀, 施养性