一种用于结核病预防的重组卡介苗的制作方法

专利名称：一种用于结核病预防的重组卡介苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域和新型结核疫苗领域，具体涉及一种重组的卡介苗。
背景技术：
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，近年来随着流 动人口增加、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核杆菌伴发感染以及结核杆菌多重耐药性菌株 的出现，使全球结核病疫情增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。卡介苗(Bacille CalmetteGuerin,BCG)是目前唯一用于预防结核病的疫苗，但是其免疫保护效果极不稳定， 不同地区的人群接种BCG后其免疫保护作用差异很大(保护率为0-80%不等)。开发比 BCG更为有效的抗结核病疫苗已成为当今迫切需要解决的问题。但目前尚没有任何一种新 型疫苗能完全替代BCG免疫，因此对卡介苗进行分子改造，研制更为安全有效的新型抗结 核病疫苗具有特别重要的意义。BCG作为一种活疫苗，应用于免疫力低下的人群(如HIV感染者或艾滋病患者等) 有较大的局限性，将外源性基因导入卡介苗构建重组卡介苗(rBCG)是TB疫苗改造的重要 方向之一。通过BCG的生长繁殖，在体内表达分枝杆菌保护性抗原，从而更有效地激发机体 免疫应答，增强BCG的免疫效果。Horwitz在BCG菌株中引入编码MTB 30kD主要分泌型和 细胞外蛋白(Ag85B)的质粒来观察rBCG的效力，发现rBCG均能稳定表达这种蛋白分子，与 亲本BCG免疫的豚鼠相比，rBCG免疫的豚鼠尽管体重变化不明显，但动物存活率和组织抑 制细菌生长的能力均超过BCG，已计划开始进行I期人体试验。Bao构建了两株分别表达 Hsp60-ESAT6融合蛋白和ESAT6分泌蛋白的rBCG，前者比BCG诱导更高滴度的特异性抗体 和更强烈的细胞免疫应答，而后者的免疫原性与亲本BCG株相似，两株rBCG的毒力未见增 强，都能明显抵御MTB感染，但免疫保护效力方面尚低于BCG。目前，结核疫苗的研究主要集 中在以下几个方面(1)营养缺陷型结核减毒活疫苗；(2)亚单位疫苗；(3) DNA疫苗；(4)重 组卡介苗。尽管前三种方法都能不同程度的刺激机体的保护性免疫反应，但其安全性也受 到质疑。在结核分枝杆菌中，早期分泌抗原靶6 (earlier secreted antigenic taget 6， ESAT-6)是一种分泌性抗原，和培养滤液蛋白 10 (culture filtrate protein 10，CFP-10) 是结核病免疫诊断中2个很有前途的抗原。这2个抗原均由RD (Regions of deletion, RD) 1 区的RV3875和RV3874基因编码，该区只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆 菌基因组中，所有BCG菌株基因组中均缺乏该区域，是BCG减毒传代过程中最先缺失的一段 区域，与结核分枝杆菌毒力和抗原性相关，能被宿主免疫系统高度识别，该区基因编码所表 达的蛋白多属于免疫优势抗原，可望成为新疫苗研制的主要候选分子。ESAT-6可致再感染结核菌小鼠的记忆性免疫细胞增殖及早期IFN- γ的大 量产生，从而显著活化巨噬细胞，提高巨噬细胞对胞内结核菌的生长抑制作用和杀伤能力， 同时在保护性细胞免疫反应中也发挥着作用，并介导长期持久的免疫记忆。表达ESAT-6的 重组BCG疫苗优于亚单位疫苗和DNA疫苗，它既保留了 BCG中的原有抗原，又增添了新的保护性抗原，且这种抗原可被广泛识别，能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆。 CFPlO也是一种有效的T细胞抗原，能够引发PPD阳性试验者的外周血单核细胞的增殖反 应和IFN-Y的产生。单一抗原的抗结核免疫效果不理想，而编码CFPlO的基因RV3874的 3'端位于ESAT-6基因RV3875上游34bp处，2个基因方向一致，协同表达，共用1个启动 子，CFPlO和ESAT6形成1 1紧密的异二聚体结构，CFP10-ESAT6融合蛋白基因疫苗能诱 导较强的细胞免疫应答，表明表达CFP10-ESAT6融合蛋白的疫苗免疫效果较好，这种疫苗 可能具有更好的免疫原性和保护力。机体对结核病的免疫主要通过ra4+T、细胞等的细胞免疫来完成，BCG是一 种强的CD4+T细胞型免疫应答诱导剂，但它诱导MHCI类限制性CD8+T细胞的作用较弱， 这可能是BCG的主要缺陷之一，而细胞可通过多种机制在宿主防御结核杆菌感染 和潜伏感染中发挥重要作用。粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor GM-CSF)是一种能够刺激粒细胞、巨噬细胞形成集落的细胞 因子，可调控粒细胞、单核/巨噬细胞的分化、增殖和存活，激活单核_巨噬细胞、释放炎性 介导因子，杀死某些微生物和肿瘤，在造血调控和免疫调节中发挥重要作用。GM-CSF在体内 外都能影响巨噬细胞的活性，促进树突状细胞发育，并增加其表面MHC分子的表达，有效促 进抗原提呈，已作为免疫佐剂广泛应用于免疫学领域。利用GM-CSF作为佐剂的动物模型试 验均表明，GM-CSF能增强感染的免疫原性，在与BCG —起免疫的小鼠中，GM-CSF能显著增强 小鼠对结核分枝杆菌二次攻击的免疫保护作用。ra4+Thi型细胞免疫反应和ra8+CTL反应是机体抗结核必需的保护免疫，有效的疫 苗既要能刺激产生上述参与保护免疫的T细胞，又要产生所需的细胞因子，而由单个靶抗 原同时产生这两种效果可能存在一定困难，理想的结核疫苗应为含多个靶抗原的多价疫 苗，以期提高TB疫苗效果，因此，多价疫苗是结核病疫苗研制的重要研究方向之一。由于 GM-CSF不仅能诱导强的细胞反应，又能诱导强的细胞反应，可以弥补卡介苗功 能上的缺陷，选择其作为佐剂与结核分枝杆菌免疫优势抗原CFPio和ESAT6共同转入卡介 苗，构建能表达人GM-CSF和结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的重组卡介苗可能具有更 好的免疫原性和保护力，对今后结核新疫苗的开发、发病机制的研究及结核病的防治有重
Jk 眉、ο

发明内容
1、本发明的目的是提供一种重组卡介苗的制备方法。根据Genbank中报道的人GM-CSF的CDS序列和结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6 基因序列设计3对引物，用SOE法(重叠延伸，Gene splicing by overlap extension)先 扩增CFP10-ESAT6融合基因，再次用SOE法将人GM-CSF基因与CFP10-ESAT6融合基因连 接到一起，组成GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因。将此嵌合基因与大肠杆菌_结核分支杆菌 穿梭质粒PMV361同时双酶切插入至穿梭质粒的多克隆位点处，构建重组穿梭质粒rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6，先用卡那霉素筛选阳性重组子，再用PCR、酶切及基因序列分析进行鉴 定。PCR、酶切及测序结果均显示，在穿梭质粒pMV361中插入了一个1065bp的特异性片段， 与预期的GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因大小一致，重组穿梭表达载体构建成功。将-70°c冻存的BCG菌株快速解冻后，迅速转移至37°C预热的Sauton培养基中，放入37°C培养箱静置培养4-5周，待菌膜长出，直至菌体恢复正常生长状态，菌体呈 白色或略带黄色，有皱褶并覆盖整个培养基液面，将其转种并扩大培养，待菌膜覆盖满液 面后用于电转化。将测序正确的重组质粒rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6用电转化的方法 转入至感受态BCG中，构建rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6重组卡介苗。通过卡那霉素筛选阳 性重组子，一方面提取重组卡介苗的基因组行PCR鉴定，另一方面，通过热诱导的方法，用 小鼠抗hGM-CSF单克隆抗体进行Western-blot分析，观察其蛋白表达水平。以提取具有 卡那霉素抗性的重组BCG菌的基因组为模板，经PCR扩增出1065bp的目的片段，证明重 组质粒PMV GMCSF-ESAT6已成功转化进BCG菌；重组BCG经热诱导后，菌体裂解液上清 用GM-CSF单克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，经ECL显色后显示在35kDa 左右出现一特异性的条带，和目的蛋白的预期分子量吻合 ，而空质粒(PMV361)电转化组 未出现阳性条带，表明重组BCG可以表达GMCSF-CFP10-ESAT6外源目的蛋白，重组卡介苗 rBCG: GMCSF-CFP10-ESAT6 构建成功。2、本发明的另一个目的是提供一种效果优于目前市售卡介苗的重组卡介苗。取6周龄的BALB/C小鼠32只(雌雄不限)，每组8只，随机分为PBST组、BCG组、 rBCG: 361组和rBCG:GMCSF-CFP10_ESAT6组，各组适应性饲养1周后，于背部皮下多点分别 注射PBST、BCG及rBCG(5X IO6CFU/只，用PBST稀释成0. ImL)，共免疫1次。免疫后6、8、 10,12周四个时间点各组随机抽取小鼠2只，摘眼球取血，分离血清，检测各组小鼠血清特 异性抗体滴度IgG。同时无菌分离脾脏，收集脾淋巴细胞，经台盼蓝染色后细胞计数，活细胞 数在90 %以上，调整细胞密度为2 X 106/L进行下述实验(1)特异性脾淋巴细胞增殖试验分离培养的脾细胞加入96孔圆底培养板，每组 小鼠脾细胞做6个复孔，并设阴性对照孔和调零孔，试验孔加入25mg/L TB-PPD,对照孔不 加特异性蛋白，调零孔不加淋巴细胞。于37°C 5% CO2培养68小时后加入XTT再培养4h， 用酶标仪测定A450吸光值，结果用刺激指数表示，SI =刺激组/非刺激组。(2)细胞因子的诱生上述分离培养的脾细胞加入24孔圆底培养板(0. 5mL/孔)， 每组小鼠脾细胞做3个复孔，25mg/L TB-PPD刺激72h后，收集培养液上清，按ELISA检测试 剂盒说明书测定IFN- γ和IL-4水平。(3)流式细胞术检测T淋巴细胞⑶4+及⑶8+细胞亚群脾淋巴细胞转入6孔板，每 组做3个复孔(ImL/孔)，同时加入25mg/L TB-PPD刺激，培养72h后，加入PE荧光素标记 的抗小鼠CD4+和FITC标记的⑶/抗小鼠一抗，流式细胞仪检测T淋巴细胞表面⑶/及OT8+ 细胞亚群所占比例。结果显示，免疫后6、8、10、12周rBCG:361组和卡介苗组各时间点血清抗体滴度 相差不明显，而rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6组免疫小鼠的抗体滴度明显高于rBCG: 361组和 卡介苗组，在第8周达到高峰，然后逐渐降低，但仍然高于卡介苗组和rBCG:361组；各免 疫组脾淋巴细胞增殖活性均较PBST组明显升高，在第10周时达到最高，rBCG: 361组和卡 介苗组比较，刺激指数差异不显著，而rBCG GMCSF-CFP 10-ESAT6组脾淋巴细胞增殖活性 显著高于卡介苗组和rBCG: 361组；各免疫小鼠IFN-γ水平均较PBST明显升高，10周达 到高峰，rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6组IFN-γ含量显著高于卡介苗组和rBCG:361组；卡 介苗组、rBCG: 361组和重组BCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞CD4+T细胞均有 增高的趋势，在免疫后10周达到最高，其中，卡介苗组和rBCG: 361组细胞的比例相当，而重组卡介苗rBCG GMCSF-CFP10-ESAT6组细胞比例在各个时间点均明显高于 其它各组，重组BCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞细胞比例自免疫8周就 明显增加，10周时达高峰，至12周有所回落。体液免疫反应和细胞免疫反应均提示重组 BCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6 免疫原性强于 BCG。本发明的疫苗具有以下优势1、重组表达了人GMCSF和结核分枝杆菌两个重要的优势保护性抗原CFPlO和ESAT6。2、将人GM-CSF基因与结核分枝杆菌CFPlO和ESAT6基因通过分子生物学工程技
术融合在一起。3、能稳定的在卡介苗中表达外源蛋白GMCSF-CFP 10-ESAT6。4、重组疫苗的免疫原性优于传统卡介苗。


图1为hGMCSF基因、CFPlO基因、ESAT6基因、CFP10-ESAT6融合基因及 GMCSF-CFP 10-ESAT6 嵌合基因的 PCR 图。1，DNA 分子量标准；2，hGMCSF 条带；3，CFPlO 条 带；4，ESAT6 条带；5，CFP10-ESAT6 条带；6，GMCSF-CFP 10-ESAT6 条带。图2为rpMV361 GMCSF-CFP 10-ESAT6的PCR及酶切鉴定图。1，DNA分子量标准 1 ；2，PCR 鉴定；3，pMV361 空质粒双酶切；4，rpMV GMCSF-CFP 10-ESAT6 单酶切；5，rpMV361 GMCSF-CFP 10-ESAT6 双酶切。图 3 为 rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6 基因组 PCR 鉴定图。1，DNA 分子量标准；2， GMCSF-CFP 10-ESAT6 条带。图4为pMV361的质粒图谱。图 5 为 Western-blot 检测 rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6 细胞裂解液中 GMCSF-CFP 10-ESAT6 蛋白表达图。1，rBCG:361 菌体蛋白 Western-blot 检测。2， rBCGGMCSF-CFP 10-ESAT6 菌体蛋白 Western-blot 检测。图6为血清特异性抗体滴度IgG。图7 为血清 IgG2a/IgGl·图8为免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应。图9为脾淋巴细胞培养上清中IFN- γ水平。图10为免疫小鼠脾淋巴细胞⑶4细胞百分比。图11为免疫小鼠脾淋巴细胞⑶8细胞百分比。图12为免疫小鼠脾淋巴细胞亚群分析。1，PBST组；2，BCG组；3，rBCG:361 ；4， rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6 组。
具体实施例方式1、分别以pORF-hGMCSF质粒和结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，分别设计 人GM-CSF基因和结核分枝杆菌CFPlO和ESAT6基因的引物，克隆GM-CSF、CFPlO和ESAT6基因。2、通过基因工程手段，将克隆的CFPlO和ESAT6基因末端加上连接肽段，获得CFP10-ESAT6融合蛋白基因。3、将克隆的GM-CSF基因和CFP10-ESAT6融合基因末端加上连接肽段，获得GMCSF-CFP10-ESAT6 嵌合基因。4、将嵌合基因转入pMV361穿梭质粒，构建rpMV361 GMCSF-CFP 10-ESAT6重组质粒。5、提取重组质粒，分别进行PCR、酶切及测序鉴定。6、运用电转化的方法将各重组质粒转入卡介苗，构建重组 BCGGMCSF-CFP10-ESAT6。7、用卡那霉素进行初步筛选。8、提取重组BCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6基因组并进行PCR鉴定。9、通过热诱导的方法诱导重组卡介苗蛋白表达并用Western-blot的方法鉴定。10、分别用重组卡介苗、传统卡介苗和PBS免疫小鼠，观察并分析各组小鼠的体液 免疫和细胞免疫反应。实施例实施例1 GMCSF-CFP 10-ESAT6嵌合基因重组卡介苗的构建、表达与鉴定1 材料1. 1菌株及质粒BCG上海株由成都生物制品研究所提供，质粒PMV361由本室保存，pORF_hGMCSF质 粒购自Invitrogen公司。1. 2主要试剂prime STAR HS DNA 聚合酶、dNTP、DNA 连接试剂盒是 Takara 公司产品；EcoR I、 HindIII及蛋白分子量标准购自晶美公司；Omega质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒及 胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购自宝信生物 ’人GM-CSF单克隆抗体为Abcam公司 产品；HRP酶标羊抗鼠IgG和ECL显色试剂盒购自北京中杉公司。1.3主要仪器PCR仪、电转仪购自百乐公司，低温冰箱购自三洋公司。2 方法2. 1人GM-CSF和结核分枝杆菌CFPlO基因和ESAT6基因的PCR扩增根据Genbank中报道的人GM-CSF的CDS序列和结核分枝杆菌CFPlO基 因和ESAT6基因序列设计3对引物，引物序列为hGMCSF上游5，-CG GAATTC ACATGTGGCTGCAGAGCCTG-3，， hGMCSF 下游5’ -GTCTTCATCTCTGCCATCTCCTGGACTGGCTCCC-3’，上游黑体字是EcoR I的酶切位点，下游删除终止密码子TGA，下划线部分是含有17 个碱基的 linker 序列。CFPlO 上游5，-GGGAGCCAGTCCAGGAGATGGCAGAGATGAAGAC-3’， CFPlO 下游5， -GCTGCCGCCACCGCCGGATCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCGAAGCCCATTTGCGAGG AC-3’，上游下划线部分是含有17个碱基互补的linker序列，下游删除终止密码子TGA， 下划线部分是含有45个碱基的linker序列。ESAT6上游5，-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTG GCGGATCCGGCGGTGGCGGCAGCATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCG-3’，ESAT6 下游5，-TA AAGCTT CTATGCGAACATCCCAGTG-3，，上游下划线部分是含有45个碱基的linker序列，下游黑体字是 Hind III的酶切位点。
以pORF-hGMCSF质粒DNA为模板，PCR扩增hGMCSF基因。hGMCSF基因PCR扩增体系总体积为 50 μ L，5 X prime STAR Buffer 10 μ L, dNTP 4 μ L(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 10mmoL/L)，pORF-hGMCSF 质粒 DNA 1 μ L, hGMCSF 基因上下游引物各 1 μ L, prime STAR HS DNAPoLymerase 1U，去离子水32. 5 μ L。PCR反应条件如下95°C预变性5分钟，94°C变 性30秒，60°C复性45秒，72°C延伸1分钟，30个循环，72°C延伸10分钟。扩增得到下游带 linker 的 hGMCSF 基因。以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，分别PCR扩增CFPlO基因和ESAT6 基因。CFPlO 基因 PCR 扩增体系总体积为 50μ L，5Xprime STAR Buffer 10 μ L，dNTP 4 μ L (dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 10mmoL/L)，H37Rv 株基因组 DNA 1 μ L, CFPlO 基因上下游引 物各 1 μ L, prime STARtmHS DNA Polymerase IU，去离子水 32. 5 μ L。ESAT6 基因 PCR 扩增 体系总体积为 50μ L，5XprimeSTAR Buffer 10 μ L, dNTP 4μ L(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 10mmoL/L)，H37Rv 株基因组 DNA 1 μ L, ESAT6 基因上下游引物各 1 μ L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U，去离子水32. 5 μ L。PCR反应条件如下95°C预变性5分钟，94°C变性 30秒，60 V复性45秒，720C延伸1分钟，30个循环，72 V延伸10分钟。扩增得到上、下游均 带linker的CFP10基因和上游带linker的ESAT6基因。2. 2CFP10-ESAT6 融合基因的 PCR 扩增取设计的CFP10基因上游引物1 μ L，ESAT6基因的下游引物1 μ L，以上述扩增的 CFP10 和 ESAT6 的 PCR 产物各 1 μ L 为模板，dNTP 4 μ L, 5 X prime STAR Buffer 10 μ L, prime STARtmHS DNA Polymerase IU，去离子水 31. 5 μ L，总体积 50 μ L，用 SOE 法扩增 CFP10-1 inker-ESAT6序列的融合基因CFP10-ESAT6。PCR反应条件95°C预变性5分钟， 94°C变性45秒，68°C复性1分钟，72°C延伸1分30秒，30个循环，72°C延伸10分钟。扩增 得到上游带linker的CFP10-ESAT6融合基因。2. 3GMCSF-CFP10-ESAT6 嵌合基因的 PCR 扩增取设计的GMCSF基因上游引物1 μ L，ESAT6基因的下游引物1 μ L，以上述扩增 的GMCSF基因和CFP10-ESAT6融合基因的PCR产物各1 μ L为模板，dNTP 4 μ L, 5Xprime STAR BufferlOy L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U，去离子水 31. 5 μ L，总体积 50 μ L，用SOE法扩增GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因。PCR反应条件95°C预变性5分钟， 94°C变性45秒，68°C复性1分钟，72°C延伸1分30秒，30个循环，72°C延伸10分钟。扩增 得到GMCSF-CFP 10-ESAT6嵌合基因。将GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因PCR产物用柱式胶回 收试剂盒纯化，具体实验步骤参照说明书。2. 4重组质粒rpMV361 GMCSF-CFP 10-ESAT6的构建用质粒提取试剂盒提取 PMV361空质粒，和上述GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因纯化产物用EcoR I和Hind III进行 双酶切，反应体系分别为PMV361 空质粒 5 μ L，5 X Tango buffer 4μ L, EcoR I 0. 5 μ L, Hind III0. 5 μ L，总体积 20 μ L ；GMCSF-CFP10-ESAT6 嵌合基因 PCR纯化产物 5 μ L，5 X Tango buffer 4 μ L，EcoR I 0. 5 μ L, Hind ΙΙΙ0. 5 μ L，总体积 20 μ L。反应条件37°C水浴 5 小 时。纯化后的空质粒和嵌合基因的双酶切产物按照基因空质粒浓度比1 10的比例混 合，再加入等体积的连接试剂，轻轻混勻后，16°C连接3小时。取5μ L连接液加入至50 μ L DH5a感受态菌液中，轻轻混勻，冰浴30分钟，42°C水浴静置90秒，取出迅速转入至冰浴中 2分钟，加入不含抗生素的LB液体培养基250μ L，37°C缓慢振摇60分钟，取转化后的菌液100 μ L铺于含卡那霉素50 μ g/mL的LB平板上，37 °C过夜培养。2. 5 重组质粒 rpMV361 GMCSF-CFP10-ESAT6 的鉴定随机挑取3个生长菌落分别接种于3mL LB液体培养基中(含卡那霉素50 μ g/ mL)，37°C振摇过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，电泳初步观察质粒DNA大小。取较空质粒 略大者进行PCR鉴定，其中阴性对照以pMV361为模板，待检样本则以含有插入片段的重组 质粒DNA为模板进行PCR扩增，引物为GM-CSF上游和ESAT6下游，PCR反应体系及循环参 数同前述，另一方面用Hindlll+EcoR I双酶切消化，电泳检测有无插入片段及其大小。初 步鉴定重组质粒插入片段大小与预期相符后，将重组质粒送至Irwitrogen公司进行DNA序 列测定，测序引物分别为GMCSF上游和ESAT6下游。2. 6 重组卡介苗 rBCG: GMCSF-CFP10-ESAT6 的构建将-70°C冻存的BCG菌株快速解冻后，迅速转移至37°C预热的Sauton培养基中， 放入37°C培养箱静置培养4-5周，待菌膜长出，直至菌体恢复正常生长状态，菌体呈白色或 略带黄色，有皱褶并覆盖整个培养基液面，将其转种并扩大培养，待菌膜覆盖满液面后用于 电转化。37°C静置培养于Sauton培养液约20天的卡介苗于转化前加入甘氨酸至终浓度为 4%,继续培养24小时。用无菌玻璃珠振摇3小时以打碎菌膜。冰浴1小时后，4000rpm 4°C 离心10分钟集菌，菌团用预冷的10%甘油洗涤4次后重悬于10%甘油中。取200 μ L菌液 加入10 μ L重组质粒，冰浴30分钟，转入预冷2mm电穿孔杯中，在2. 5KV/cm, 25 μ F，720 Ω 条件下电转化。放电完毕后立即冰浴10分钟，轻柔加至IOmL Sauton培养液中，37°C静置 培养。待长出菌膜后转入含20 μ g/mL卡那霉素的Sauton培养液中，于37°C继续静置培养 3 4周。2. 7 重组卡介苗 rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6 的鉴定待菌膜长满液面后，离心集菌，依据基因组提取试剂盒提取重组卡介苗总DNA，以 其为模板按前述扩增条件，分别以GMCSF上游和ESAT6下游为引物，进行PCR扩增。含外源 基因的重组卡介苗在Sauton培养液(含20 μ g/mL卡那霉素)中静置培养两周，迅速加入 等体积53°C的Sauton培养液，置45°C水浴热诱导30分钟。5000rpm离心15分钟集菌。收 集培养液上清备用。菌体用冰预冷的PBS(pH7. 2)洗涤2次，振荡混勻，超声波裂解菌体40 分钟，-20°C备用。根据Laemmli等介绍的方法，依次灌制12%的分离胶5mL和5%的浓缩胶2mL，待胶完全凝固后，将上述制备的蛋白样品及蛋白质分子量标准各取10 μ L上样于疏齿孔中进 行电泳，先80V稳压电泳至分离胶，再120V电泳至结束。电泳完毕后，剥下凝胶块，先剪与 凝胶块相同大小的4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。连同凝胶块一起浸入转移电泳缓冲液 (25mmoL/LTris,0. 2moL/L氨基乙酸，20%甲醇)中浸泡30分钟，然后在BR10592型半干转 移装置的阳极板上依次平铺滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸，盖上阴极板，接通电源，于IOV 稳压电泳45分钟；取出硝酸纤维素膜，将膜置5%脱脂奶粉中封闭1小时后用TTBSdOmM/ LTris-HCl，150mmoL/L NaCl, 0. 05% Tween20，pH7. 5)室温轻摇洗涤 3X5 分钟，然后浸入含 小鼠抗GM-CSF多克隆抗体(1 1000)的一抗中于室温孵育2小时，TTBS洗膜3X5分钟， 浸入含竦根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(l 5000)的二抗稀释液液中，室温孵育1小 时；TTBS洗膜3X5分钟，ECL显色，观察嵌合蛋白在卡介苗中的表达。
3 结果3. 1人GM-CSF基因、结核分枝杆菌CFPlO基因、ESAT6基因、CFP10-ESAT6融合基因及GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因的扩增以设计的GM-CSF基因上下游为引物，通过PCR方法从pORF_hGMCSF质粒获得 449bp的人GM-CSF基因片段(不含终止密码子)；以CFPlO和ESAT6基因上下游为引物，从 结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中分别获得362bp和333bp的结核分枝杆菌CFPlO 基因(不含终止密码子)和ESAT6基因，以CFPlO基因上游、ESAT6基因下游为引物，CFPlO 和ESAT6基因为模板，扩增得到650bp的CFP10-ESAT6融合基因；以GM-CSF基因上游、ESAT6 基因下游为引物，GM-CSF基因和CFP10-ESAT6融合基因为模板，扩增得到1065bp的特异性 片段，与预期的GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因大小一致(见图1)。3. 2 重组质粒 rpMV361 GMCSF-CFP 10-ESAT6 的鉴定以抗生素筛选阳性重组子提取的质粒为模板，以GM-CSF基因上游、ESAT6基因 下游为引物进行PCR扩增，同时用EcoR I、HindIII双酶切该重组质粒，均证实有大小为 1065bp的目的片段插入pMV361质粒(见图2)，测序结果和GenBank中人GM-CSF基因、结 核分枝杆菌CFPlO基因、ESAT6基因序列比对，均100%匹配，表明重组质粒构建成功。3. 3重组BCG的PCR鉴定以提取具有卡那霉素抗性的重组BCG菌的基因组为模板，经PCR扩增出1065bp的 目的片段，证明重组质粒pMV GMCSF-CFP 10-ESAT6已成功转化进BCG菌(图3)。3. 4重组BCG表达产物的Westrn-blot分析重组BCG经热诱导后，菌体裂解液上清用GM-CSF单克隆抗体为一抗，HRP标 记的羊抗鼠IgG为二抗，经ECL显色后显示在35kDa左右出现一特异性的条带，和目的 蛋白的预期分子量吻合，而空质粒电转化组未出现阳性条带，表明重组BCG可以表达 GMCSF-CFP 10-ESAT6外源目的蛋白(见图5)，重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6构建成功。4 结论运用分子生物学技术成功构建了能表达GMCSF-CFP10-ESAT6外源蛋白的重组卡 介苗 rBCG: GMCSF-CFP 10-ESAT6。实施例2重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6免疫原性研究1 材料1. 1实验动物BALB/C小鼠购自四川大学华西校区实验动物中心。1. 2主要试剂IFN-γ、IL-4 ELISA检测试剂盒购自R&D公司，PE标记的CD4和FITC 标记的OT8抗小鼠一抗购自eBioscience公司，RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司。1. 3 主要仪器 FACSCalibur 流式细胞仪(BD Biosciences)，酶标仪(Bio-Rad)。2 方法2. 1动物免疫取6周龄的BALB/C小鼠32只(雌雄不限)，每组8只，随机分为PBST组、BCG组、 rBCG: 361组和rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6组，各组适应性饲养1周后，于背部皮下多点分别 注射 PBST (0. 05 % Tween80)、BCG 及 rBCG (5 X IO6CFU/ 只，用 PBST 稀释成 0. ImL)，共免疫 1次。免疫后观察动物注射部位有无红肿、溃疡、化脓等，同时观察动物皮毛、精神状态、饮食 及大小便。2. 2血清特异性抗体水平检测免疫后6、8、10、12周四个时间点各组随机抽取小鼠2只，摘眼 球取血，待血液固体 成分凝结固缩，离心吸取血清，分装后-70°C冻存备用。用TB-PPD标准品(IOOyL/孔)包 被酶标板，4°C避光过夜。PBST洗涤，5%脱脂奶粉封闭90分钟，再次洗涤后依次加入2倍 系列稀释的待检血清，37°C温育90分钟，洗板后分别加入1 1000稀释的HRP酶标记羊抗 鼠IgG、IgGl和IgG2a，再次37°C温育90分钟，洗板，加入底物液(含0. 4mg/mL邻苯二胺的 0. 05M磷酸盐-柠檬酸缓冲液，ρΗ5· 0，临用前加5 μ L 30% H2O2/IOmL) 100 μ L/孔，室温避 光15-30分钟。加入50 μ L/孔H2SO4 (2M)终止反应，于波长490nm测定吸光度。实验中以 PBST组为空白对照、以rBCG: 36IrBCG: 361组及BCG组血清为阴性对照，以结核病人血清作 为阳性对照(1 100稀释)，检测各组小鼠血清特异性抗体滴度。结果以双复孔A值均值 表示，当A值> 0. 05，A实验组/A对照组> 2. 0时，判为阳性，以出现阳性反应的最高稀释 度作为该样本的抗体滴度。2. 3脾淋巴细胞分离免疫后6、8、10、12周各组随机抽取2只小鼠，无菌分离脾脏，同组脾脏混合后，用 玻璃勻浆器研磨，经200目筛网过滤，PBS洗涤1-2次，加入0. 83%NH4C1溶液(0. 15M NH4Cl, IOmMNaHCO3, ImM EDTA-Na2)混勻后静置5分钟以裂解红细胞，1500rpm离心5分钟，收集细 胞，加入含10% FBS和双抗的RPMI1640，经台盼蓝染色后细胞计数，活细胞数在90%以上， 调整细胞密度为2X106/L进行后续实验。2. 4特异性脾淋巴细胞增殖试验(XTT)将上述分离培养的脾细胞加入96孔圆底培养板(0. ImL/孔)，每组小鼠脾细胞做 6个复孔，并设阴性对照孔和调零孔，试验孔加入25mg/L TB-PPD,对照孔不加特异性蛋白， 调零孔不加淋巴细胞。于37°C 5 % CO2培养68小时后加入XTT (含lmg/mL XTT和0. 125mmoL/ L PMS)再培养4h，用酶标仪测定A450吸光值，结果用刺激指数表示，SI =刺激组/非刺激组。2. 5细胞因子的诱生将上述分离培养的脾细胞加入24孔圆底培养板(0. 5mL/孔)，每组小鼠脾细胞做 3个复孔，25mg/L TB-PPD刺激72h后，3000rpm离心5分钟收集培养液上清，-70°C冻存备 用，按ELISA检测试剂盒说明书测定IFN-Y和IL-4水平。根据标准品各孔的OD值及其 所对应的标准品含量绘制标准曲线，然后根据待测样品孔OD值从标准曲线上求出样本中 IFN-Y和IL-4的含量。采用方差分析对各组的测得值进行差异显著性分析，P < 0. 05为 具有统计学意义。2. 6流式细胞术检测T淋巴细胞⑶4+及⑶8+细胞亚群将上述分离培养的小鼠脾淋巴细胞转入6孔板，每组做3个复孔(ImL/孔)，同时 加入25mg/L TB-PPD刺激，培养72h后，3000rpm离心5分钟收集细胞，用PBS洗涤2次，细 胞悬液加入PE荧光素标记的抗小鼠⑶/和FITC标记的OT8+抗小鼠一抗，4°C避光30min，再 用 PBS-BSA-NaN3 (含 2 % BSA 和 0. 5 % NaN3 的 PBS)洗涤 2 次，再加入 400 μ L PBS-BSA-NaN3, 流式细胞仪检测T淋巴细胞表面⑶/及⑶/细胞亚群所占比例。
3 结果3. 1血清特异性抗体滴度测定rBCG:361组和卡介苗组各时间点血清抗体滴度相差不明显(P > 0.05)，而 rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6组免疫小鼠的抗体滴度明显高于rBCG:361组和卡介苗组，在第 8周达到高峰，然后逐渐降低，但仍然高于卡介苗组和rBCG:361组(P < 0. 05)(见图6)。 BCG组和rBCG:361组血清IgG2a/IgGl比值在各时间点变化趋势基本一致，6周时IgG2a/ IgGl比值较大，8-10周降低，然后又逐渐增大，rBCG:361组高于BCG组。rBCG:GCE组6周 时IgG2a/IgGl比值较低，8周时升高，10周出现回落，至12周IgG2a/IgGl显著增大升高， 且明显高于rBCG: 361和BCG组(见图7)。3. 2特异性淋巴细胞增殖实验各组经皮下免疫小鼠后，脾淋巴细胞增殖活性均较PBST组明显升高，且有增高 的趋势，并在第10周时达到最高；其中，rBCG:361组和卡介苗组比较，刺激指数差异不显 著(P > 0. 05)，而rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6组脾淋巴细胞增殖活性显著高于卡介苗组和 rBCG:361 组(P < 0. 05)(见图 8)。3. 3细胞因子的诱生各免疫小鼠IFN-Y水平均较PBST明显升高，且有增高的趋势，在免疫后10周 达到高峰；其中，rBCG: 361组和卡介苗组比较，IFN-γ产生差别不大(P > 0. 05)，而 rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6 组 IFN-Y 含量显著高于卡介苗组和 rBCG: 361 组(P < 0. 05)(见 图9)。各组细胞因子IL-4在各时间点产生均不明显，未达到试剂盒检测的最低浓度，OD值 维持在0.015左右。3. 4免疫小鼠脾淋巴细胞亚群的变化卡介苗组、rBCG 361组和重组BCG GMCSF-CFP 10-ESAT6组小鼠脾淋巴细胞CD4+T细 胞与PBST组相比均有增高的趋势，在免疫后10周达到最高；其中，卡介苗组和rBCG: 361组 ω4+Τ细胞的比例相当；而重组卡介苗rBCG:GMCSF-CFP 10-ESAT6组细胞比例明显高于 PBST 组、卡介苗组 rBCG:361 组(P < 0. 05)(见图 10) ；BCGGMCSF-CFP 10-ESAT6 组小鼠脾 淋巴细胞CD8+T细胞比例也显著高于其它组，10周时达高峰，至12周有所回落(P < 0. 05) (见图 11，12)。4 结论共表达人GMCSF和结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 rBCG:GMCSF-CFP10-ESAT6免疫原性优于传统卡介苗，为研制具有特异性抗结核杆菌免疫保 护和佐剂增强双重效应的新型重组BCG疫苗奠定了基础。
权利要求
一种重组卡介苗rBCGGMCSF-CFP10-ESAT6，其特征在于，能够稳定的表达GMCSF-CFP 10-ESAT6嵌合蛋白。
2.如权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，免疫原性强于传统卡介苗。
3.如权利要求1所述的重组卡介苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下几个步骤(1)hGM-CSF基因的扩增、结核分枝杆菌CFPlO基因和ESAT6基因的扩增；(2)CFP10-ESAT6融合基因的扩增；(3)GMCSF-CFP 10-ESAT6嵌合基因的扩增；(4)将GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合基因插入至大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361 中，构建 rpMV361GMCSF-CFP 10-ESAT6 ；(5)将(4)中的重组质粒电转化入卡介苗。
4.如权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，通过抗生素筛选、提取基因组、PCR及 诱导表达后进行 Western-blot 鉴定，得到 rBCG :GMCSF-CFP10_ESAT6。
5.一种重组质粒，其特征在于，将人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)序列和结 核分枝杆菌CFPlO基因和ESAT6基因序列共同插入大肠杆菌_结核分枝杆菌穿梭质粒序列 中。
6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，大肠杆菌_结核分枝杆菌穿梭质粒为 PMV361。
7.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，将hGM-CSF基因序列和结核分枝杆菌融 合基因CFP10-ESAT6序列连接后插入大肠杆菌_结核分枝杆菌穿梭质粒的多克隆位点处。
8.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，用PCR、酶切和测序鉴定，得到重组质粒 rpMV361GMCSF-CFP 10-ESAT6。
9.如权利要求1所述的重组卡介苗，其特征在于，将如权利要求5所述的重组质粒电转 化入卡介苗，得到 rBCG :GMCSF-CFP10-ESAT6。
全文摘要
本发明涉及一种人GM-CSF基因与结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因嵌合表达GMCSF-CFP10-ESAT6蛋白重组卡介苗的构建及其免疫原性研究，即利用基因工程技术将人GM-CSF基因和结核分枝杆菌CFP10基因和ESAT6基因序列插入到同一大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361的序列中，构建重组穿梭质粒rpMV361GMCSF-CFP10-ESAT6。然后采用电穿孔的方法将上述载体导入卡介苗，构建重组卡介苗rBCGGMCSF-CFP10-ESAT6。本发明构建的重组卡介苗可以稳定的表达GMCSF-CFP10-ESAT6嵌合蛋白，其免疫原性优于传统卡介苗。本发明提供了一种重组卡介苗的制备过程，并研究了其免疫性，属于基因工程领域和结核疫苗领域。本发明将更有效的预防结核病的发生及传播。
文档编号A61K39/04GK101822829SQ20101014037
公开日2010年9月8日 申请日期2010年4月7日 优先权日2010年4月7日
发明者杨晓玲, 邓仪昊, 鲍朗 申请人:四川大学