专利名称：：黄紫堇总生物碱及其制备方法及其药物用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药领域。
背景技术：
：罂粟科紫堇属植物全世界约有350种，分布于北温带地区。我国有290种左右，各地均产，以西南地区为多。紫堇属植物治疗疾病的历史悠久，中医多用于清热解毒、除湿止痛，治疗感冒发热、疮疡痈肿、溃烂等症；藏医用于治疗感冒发烧、肝炎、水肿、胃炎、胆囊炎、高血压等多种疾病。从目前对该属植物的化学成分研究结果来看，本属植物主要含异喹啉类生物碱，该属植物及其提取物大多具有广泛的药理活性，如调节心血管系统、抗肿瘤、抗菌等。随着研究的不断深入，紫堇属植物或其提取物在国外也越来越广泛地应用于医疗保健。黄紫堇，罂粟科紫堇属植物，拉丁名CorydalisochotensisTurcz.主要分布黑龙江、吉林等地。生于向阳的林内陡壁旁、杂木林下、溪流两旁、采伐迹地等，在长白山地区拥有丰富的资源。与本属其它植物相比，未见其化学成分及生物活性的研究报道。老年性痴呆症，是老年人常见的一种慢性进行性精神衰退性疾病。其临床表现为意识糊、记忆缺损、行为和语言障碍、抑郁等。随着人类社会年龄结构老龄化，老年性痴呆症发病率日益上升，已成为仅次于心脑血管病症和肿瘤的第三大健康杀手。老年性痴呆症大致可分为老年性痴呆阿尔茨海默病Alzheimer'sdisease，AD、血管性痴呆Vasculardementia,VD和混合型痴呆等，以AD为常见。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白沉积，神经原纤维缠结，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑的形成。目前尚无特效治疗或逆转疾病进展的治疗药物。
发明内容本发明提供一种黄紫堇总生物碱及其制备方法及其药物用途，用于改善记忆、治疗老年性痴呆症。本发明采取的技术方案是，黄紫堇总生物碱的制备方法包括下列步骤a.黄紫堇粉碎成粗粉，粒度0.120mm，加310倍量0.1-5%硫酸溶液、盐酸溶液或磷酸溶液浸泡124小时，b.用1020倍0.1-5%硫酸溶液、盐酸溶液或磷酸溶液渗漉提取，至渗漉液无生物碱反应，c.渗漉液用NaOH溶液、KOH溶液或NH4OH调至pH值为58，上大孔树脂柱AB-8、DlOUDA201中的一种，用1-10%NaOH或KOH溶液洗脱至流出液近无色，然后用水洗至pH值为7-9，用40%乙醇洗脱至流出液近无色后，用80-95%乙醇洗脱至无生物碱反应，洗脱液回收乙醇，干燥。一种由上述制备方法得到的黄紫堇总生物碱，所得提取物总生物碱含量50%-85%。黄紫堇总生物碱在制备改善记忆功能、治疗老年性痴呆症的药物中的应用。本发明的黄紫堇总生物碱具有一定的还原力，在所测定的浓度范围内，黄紫堇总生物碱的还原能力与样品浓度成正的量效关系；黄紫堇总生物碱有明显的清除DPPH自由基的能力；黄紫堇总生物碱清除羟自由基的作用较弱；黄紫堇总生物碱具有较强的清除超氧离子自由基作用，并且在0.55mg/ml范围内抗氧化效果呈现明显的剂量依赖性，可用于治疗老年性痴呆症；通过动物实验还表明，黄紫堇总生物碱可明显改善痴呆大鼠学习记忆功能。本发明药物的用法用量是口服一次3-6mg，一日3次。黄紫堇是我国长白山地区常见药材，资源丰富、蕴藏量较大，对它加以开发利用有着积极的意义。图1是黄紫堇总生物碱抗氧化活性试验中还原能力的测定图；图2是黄紫堇总生物碱抗氧化活性试验中清除DPPH自由基的测定图；图3是黄紫堇总生物碱抗氧化活性试验中清除羟自由基的测定图；图4是黄紫堇总生物碱抗氧化活性试验中抑制超氧离子自由基的测定曲线图。具体实施例方式实施例1a.黄紫堇粉碎成粗粉，粒度0.1mm，加3倍量0.盐酸溶液浸泡1小时，b.用10倍0.盐酸溶液渗漉提取，至渗漉液无生物碱反应，c.渗漉液用K0H溶液调至pH值为5，上大孔树脂柱AB-8，用1%K0H溶液洗脱至流出液近无色，然后用水洗至PH值为8，用40%乙醇洗脱至流出液近无色后，用80%乙醇洗脱至无生物碱反应，洗脱液回收乙醇，干燥。实施例2a.黄紫堇粉碎成粗粉，粒度10mm，加6倍量2.5%硫酸溶液浸泡12小时，b.用15倍2.5%硫酸溶液渗漉提取，至渗漉液无生物碱反应，c.渗漉液用NaOH溶液调至pH值为7，上大孔树脂柱D101，用5%NaOH溶液洗脱至流出液近无色，然后用水洗至pH值为7，用40%乙醇洗脱至流出液近无色后，用90%乙醇洗脱至无生物碱反应，洗脱液回收乙醇，干燥。实施例3a.黄紫堇粉碎成粗粉，粒度20mm，加10倍量5%磷酸溶液浸泡24小时，b.用20倍5%磷酸溶液渗漉提取，至渗漉液无生物碱反应，c.渗漉液用NH40H溶液调至pH值为8，上大孔树脂柱DA201，用10%NaOH溶液洗脱至流出液近无色，然后用水洗至pH值为9，用40%乙醇洗脱至流出液近无色后，用95%乙醇洗脱至无生物碱反应，洗脱液回收乙醇，干燥。下面结合药效学实验进一步验证本发明药物的效果。实验例1黄紫堇总生物碱抗氧化活性试验实验仪器S.HH.W21-G三用电热恒温水箱北京长安科学仪器厂722可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司800B离心机上海安亭科学仪器厂pHS-3C型精密pH计上海雷磁仪器厂B204-E分析天平MadeinSwiterland(1)黄紫堇总生物碱还原能力的测定分别取0.2mg/ml5.Omg/ml不同浓度的样品溶液1.Oml，依次加入0.2mol/LpH6.6的磷酸盐缓冲液和1%的k3Fe(CN)6溶液各2.5ml，混合均勻，混合液置50°C保温20min,放至室温，加入2.5ml10%三氯乙酸，混合均勻，静止lOmin，取混合液2.5ml，加2.5ml蒸馏水和0.5ml0.1%的FeCL3,混合均勻，IOmin放置，在700nm处测定吸光度。由图1可知，黄紫堇总生物碱具有一定的还原力，在所测定的浓度范围内，黄紫堇总生物碱的还原能力与样品浓度成正的量效关系。(2)黄紫堇总生物碱清除DPPH自由基的测定精密量取0.02mmol/L、0.04mmol/L、0.06mmol/L、0.08mmol/L、0.lmmol/L不同浓度DPPH溶液2.00ml，加入2.OOml相应样品溶剂，在波长为517nm下测定吸光度并记录吸光值为Ase，即空白对照。精密量取2.OOml的0.lmg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、lmg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml浓度的样品溶液于IOml试管中，加入2.OOmlDPPH溶液，使总体积为4.OOml，摇勻，室温避光放置30min后倒入比色杯，在波长为517nm下测定吸光度并记录吸光值为A样品。清除率计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>由图2可知，黄紫堇总生物碱清除DPPH自由基的能力与样品浓度成正相关性，当浓度达到2mg/ml时，其清除能力增大趋势近似于平台，最高的清除率达到了71.56%，计算得IC5tl=0.45mg/ml,IC50是指样品清除50%DPPH自由基所需的量，IC50越小，清除能力越强。结果表明，黄紫堇总生物碱有明显的清除DPPH自由基的能力。(3)黄紫堇总生物碱清除羟自由基的测定精密量取1.8mmol/LFeS042ml置IOml比色管中，加入1.8mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.5ml，再加入0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml不同浓度的样品溶液各1ml，最后加入H2O2并启动整个反应，37°C反应0.5h后，2000r/min离心lOmin，然后以蒸馏水作参比，在510nm下测定吸光度。考虑待测溶液本身的吸光值不同，以1.Smmol/LFeSO42ml、1.8mmol/L水杨酸-乙醇1.5ml、待测溶液Iml和蒸馏水Iml作为待测溶液的本底吸收值。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>由图3可知，黄紫堇总生物碱具有一定的清除羟自由基作用，随着浓度的增大，其清除羟自由基作用的增大趋势并不显著，这说明黄紫堇总生物碱清除羟自由基的作用较弱。(4)黄紫堇总生物碱清除超氧阴离子自由基的测定量取pH值8.2的Tris-Hcl-EDTA缓冲液4.5ml置比色管中，加入0.5ml浓度为0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml的样品溶液，于25°C恒温lOmin。再加入25°C恒温的45mmol/L邻苯三酚溶液10ul，混勻后，迅速倒入Icm比色杯中，于325nm波长处测定吸光度值，每30s测一次，共测4min，记录每次测定的吸光度值，计算其自氧化速率ΔA#。同时做样品溶液的空白试验，以排除样品溶液本身的颜色干扰。抑制率计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>由图4可知，黄紫堇总生物碱具有较强的清除超氧离子自由基作用，并且在0.55mg/ml范围内抗氧化效果呈现明显的剂量依赖性，计算IC5tl=4.48mg/ml。结果显示黄紫堇总生物碱具有一定的还原力，在所测定的浓度范围内，黄紫堇总生物碱的还原能力与样品浓度成正的量效关系；黄紫堇总生物碱有明显的清除DPPH自由基的能力；黄紫堇总生物碱清除羟自由基的作用较弱；黄紫堇总生物碱具有较强的清除超氧离子自由基作用，并且在0.55mg/ml范围内抗氧化效果呈现明显的剂量依赖性。实验例2黄紫堇总生物碱对小鼠学习记忆能力的影响1材料与方法1.1材料1.1.1实验仪器JXDT-I型小动物跳台仪(冀星实验仪器有限公司)，1.1.2药品黄紫堇总生物碱，自制；吡拉西坦，宜昌人福药业有限责任公司；D-半乳糖，上海生化试剂二厂。1.1.3实验动物与分组昆明种小鼠50只，体重30士2g(吉林大学实验动物中心)，雌雄各半，随机分成五组，每组10只，分别为正常对照组，为模型对照组，阳性药对照组，黄紫堇总生物碱给药低、高剂量组。1.2方法1.2.1模型建立从实验第1天开始，除空白组外，各组大鼠每天颈部皮下注射1次D-半乳糖0.125g/kg体重，连续40天，建立亚急性衰老模型。造模同时，空白组每日皮下注射等量生理盐水。1.2.2给药方法造模结束后，空白对照、模型对照两组给予生理盐水0.5ml/只灌胃，阳性药对照组给与吡拉西坦0.5g/kg体重灌胃，黄紫堇总生物碱低、高剂量组分别给予黄紫堇总生物碱，剂量分别为2mg/kg、4mg/kg，连续给药15天。1.2.3行为学测试1.2.3.1跳台实验法给药结束后，采用跳台实验法对各组小鼠进行行为学测试。实验时，将小鼠放入装置中适应5min，然后立刻通以40V交流电，小鼠受电击后，其正常反应是跳到安全台躲避电击，记录通电后其跳至安全台上的时间，作为反应期；观察5min内受电击的次数为错误次数，以反应期和错误次数作为其学习成绩。24h后重复试验，将小鼠置于安全台上，即刻通电，观察5min内小鼠从台上跳至铜栅上的时间为潜伏期，受电击次数为错误次数，以潜伏期和错误次数为记忆成绩。测试时小鼠停留在平台上超过5min，其潜伏期以300s计。1.2.3.2明暗箱避暗回避实验法跳台实验法测试后，休息24小时，采用明暗箱避暗回避实验测试小鼠学习记忆能力。明暗箱的明箱和暗箱之间有一拱形小门相通，两箱底均为铜栅，先将小鼠放置在明箱中，适应5min，打开小门，小鼠从明箱进入暗箱的时间即潜伏期。小鼠进入暗箱，暗箱底通以交流电刺激，小鼠随即逃出暗室，5min之内小鼠进入暗箱受电击的次数即错误次数，测量其潜伏期和错误次数。2结果与分析2.1跳台实验法2.1.1跳台实验法测试结果各组小鼠的学习、记忆成绩见表1表1跳台实验法小鼠的学习、记忆成绩(X士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>与空白对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05广P<0.012.1.2跳台实验法小鼠的学习、记忆成绩结果表明，模型组的学习记忆成绩与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，反应期明显延长，潜伏期明显缩短，错误次数明显增多，表明造成学习记忆能力下降，造模成功。阳性对照药吡拉西坦给药组、黄紫堇总生物碱低剂量组、黄紫堇总生物碱高剂量组与模型对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，表明给出试验剂量下，吡拉西坦、黄紫堇总生物碱能显著改善AD小鼠的学习记忆成绩。2.2明暗箱避暗回避实验法2.2.1明暗箱避暗回避实验法测试结果各组小鼠的潜伏时间、错误次数见表2表2明暗箱避暗回避实验测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>与空白对照组比较，flflP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05广P<0.012.2.2明暗箱避暗回避实验法测试结果表明，与空白组比较，模型组小鼠学习训练中潜伏时间明显延长，错误次数明显增多，表明小鼠学习记忆功能障碍，造模成功。阳性对照药吡拉西坦给药组、黄紫堇总生物碱低剂量组、黄紫堇总生物碱高剂量组与模型对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，表明给出试验剂量下，吡拉西坦、黄紫堇总生物碱能显著改善AD小鼠的学习记忆功能。实施例1黄紫堇总生物碱的片剂黄紫堇总生物碱3g淀粉IOOg硬脂酸镁5g制成1000片按照以上处方，取黄紫堇总生物碱和淀粉，混勻，制粒，加入硬脂酸镁，混勻，压片，即得。实施例2黄紫堇总生物碱的胶囊剂黄紫堇总生物碱3g淀粉IOOg制成1000粒按照以上处方，取黄紫堇总生物碱和淀粉，混勻，制粒，装入胶囊中，即得。实施例3黄紫堇总生物碱的滴丸剂黄紫堇总生物碱3g聚乙二醇400030g制成1000粒按照以上处方，取聚乙二醇4000，加热熔融后，加入黄紫堇总生物碱细粉，混勻，滴入冷却的甲基硅油或液体石腊中，冷却，即得。权利要求一种黄紫堇总生物碱，其特征在于它是由下列方法制得的a.黄紫堇粉碎成粗粉，粒度0.1～20mm，加3～10倍量0.1-5％硫酸溶液、盐酸溶液或磷酸溶液浸泡1～24小时，b.用10～20倍0.1-5％硫酸溶液、盐酸溶液或磷酸溶液渗漉提取，至渗漉液无生物碱反应，c.渗漉液用NaOH溶液、KOH溶液或NH4OH调至pH值为5～8，上大孔树脂柱AB-8、D101、DA201中的一种，用1-10％NaOH或KOH溶液洗脱至流出液近无色，然后用水洗至pH值为7-9，用40％乙醇洗脱至流出液近无色后，用80-95％乙醇洗脱至无生物碱反应，洗脱液回收乙醇，干燥。2.如权利要求1所述的黄紫堇总生物碱的制备方法。3.如权利要求1所述的黄紫堇总生物碱在制备改善记忆功能、治疗老年性痴呆症的药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种黄紫堇总生物碱及其制备方法及其药物用途，它是由下列方法制得的黄紫堇粉碎成粗粉，加0.1-5％硫酸溶液浸泡，用0.1-5％硫酸溶液渗漉提取，渗漉液用NaOH溶液调pH值为5～8，上大孔树脂柱，用1-10％NaOH溶液洗脱至流出液近无色，然后用水洗至pH值为7-9，用40％乙醇洗脱至流出液近无色后，用80-95％乙醇洗脱至无生物碱反应，洗脱液回收乙醇，干燥。黄紫堇总生物碱在制备改善记忆功能、治疗老年性痴呆症的药物中的应用。黄紫堇是我国长白山地区常见药材，资源丰富、蕴藏量较大，对它加以开发利用有着积极的意义。文档编号A61P25/28GK101829195SQ20101015438公开日2010年9月15日申请日期2010年4月26日优先权日2010年4月26日发明者赵春芳申请人:吉林大学