专利名称：黄连素作为制备肿瘤放射治疗增敏药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤放射治疗增敏药物领域，具体涉及黄连素作为制备肿瘤放射治疗增敏药物中的应用。
背景技术：
现有技术中，常用的放疗增敏药物包括(I)MISO(Misonodaxole) :MIS0是一个在临床实验阶段得到充分肯定的乏氧细胞 增敏剂。(2)康莱特是从传统中药薏苡仁中提取制成的注射液。该药已经广泛应用于治 疗各种恶性肿瘤，同时也是一种放射增敏剂。(3) SR-2508 (Etanidacole) :SR_2508为硝基咪唑的酰胺衍生物，其增敏效价与 MISO相近，但毒性较低，最大可耐受总剂量约为MISO的3倍。SR-2508对化疗药也有增敏作用。(4)AK-2123 :AK_2123为硝基咪唑类化合物，是一种亲电子性的放射增敏剂，口服 或肿瘤内注射。它的增敏效应与MISO相近，而毒性却低得多。另外，动物实验研究均提示 使用AK-2123对热疗和化疗亦有增敏作用。(5)912 :912是从中药地龙(蚯蚓)提取的一种抗癌药，离体实验和整体实验均有 一定的放射增敏作用。临床试验结果表明，912无毒副作用。(6)毛冬青毛冬青是一种冬青科植物，具有活血化瘀、清热解毒等功效。临床研 究表明，它对鼻咽癌患者有一定的放射增敏作用；颈淋巴结消失时的平均放射剂是量也明 显低于单纯放射组；能提高鼻咽癌患者的生存率。毛冬青联合放疗是安全的，不但不会增加 皮肤和胃肠道反应，而且对口咽粘膜反应还有一定的减轻作用。(7)枸杞多糖枸杞多糖是从中药枸杞中提取的主要成分，对机体无毒性作用。枸 杞多糖单独应用对肿瘤无明显抑制作用，但动物实验及临床观察表明，枸杞多糖与放射治 疗联合应用有增敏效果。临床研究表明，枸杞多糖合并放疗对原发性肺癌的近期疗效有所 提尚。(8)汉防已甲素汉防已甲素是从中药汉防已中提取出来的。上海第一医学肿瘤 医院高令山报道，采用汉防已甲素合用小剂是量放射线对97例晚期肺癌进行了观察，结果 放射量为1500 2000rad(常规量为6000rad)肺部肿瘤不同程度缩小者占61. 9%，表明汉 防已甲素有一定的放射增敏作用。(9)紫杉醇(paclitaxel，商品名taxol)紫杉醇是一种紫杉的树皮中分离出来的 天然产物，为新一代的抗肿瘤药物。研究表明，其对卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、恶性淋 巴瘤等有明显疗效。另外，研究发现当紫杉醇和射线合用时有较好的放射增敏作用，而且增 敏作用随着药物浓度增加而增大。黄连素又名小檗碱是从毛莨科植物黄连、黄柏中提取的一种季胺类化合物，分子 量为317. 8。在中国和印度黄连素是一种非常古老的药物，临床上长期用于临床解热，解毒和抗肠道细菌感染。近年来研究发现黄连素具有包括降血压、抗心肌重构、抗心力衰竭、抗 血管粥样硬化、降血脂、降血糖、介导细胞免疫在内的其它生化和药理学活性。研究也发现 大剂量的黄连素具有抗肿瘤功效，可以抑制结肠癌细胞的增生，抑制食管癌，乳腺癌和前列 腺癌细胞的生长，但是大剂量使用时同时会毒性，虽然减小剂量可以消除毒性，但是剂量小 的时候无法产生抗肿瘤效果。同时目前未见黄连素作为放疗增敏药物的应用报道。
发明内容
本发明目的是提供黄连素的新用途，即黄连素在制备肿瘤放射治疗增敏药物中的 应用。本发明的另一目的是提供一种肿瘤放射治疗增敏药物。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种肿瘤放射治疗增敏药物，所述肿 瘤放射治疗增敏药物活性成分为黄连素。上述技术方案中，所述肿瘤放射治疗增敏药物还包括本领域技术人员公知的辅助 配料，例如，将肿瘤放射治疗增敏药物制成局部注射剂型时，可以添加乙烯基吡咯烷酮水溶 胶以起缓释药物的作用；所述肿瘤放射治疗增敏药物的剂型包括静脉注射剂型，局部注 射剂型，片剂，滴剂等多剂型。对上述技术方案所述肿瘤放射治疗增敏药物的研究发现(1)黄连素处理乳腺癌细胞可以诱导剂量依赖性的GcZG1期细胞阻滞和细胞凋亡 黄连素抑制50% MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的生长的剂量(IC5tl)大约为10 μ mol/L(48 小时)和大约5 μ mol/L(72小时)。(2)黄连素明显降低了细胞周期调节相关蛋白cyclin B和抗细胞凋亡蛋白Bcl_2 的表达水平，而增加了凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达水平。这些为黄连素作为肿瘤放 射治疗增敏药物提供了作用机制。(3)黄连素处理后的乳腺癌细胞明显提高了细胞对放射治疗的敏感性黄连素浓 度5 μ mol/L 24小时处理的MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞辐射增敏比分别为1. 4207禾口 1. 5420。上述研究结果表明，黄连素可以用作制备肿瘤放射治疗增敏剂，并且当肿瘤放射 治疗增敏剂中黄连素浓度低至5 μ mol/L时，对细胞不会产生毒性；并且本领域技术人员公 知，当黄连素浓度低至5 μ mol/L时，对肿瘤细胞进行短时间(不超过24h)的处理无法产生 显著的抗肿瘤作用。因此，优选的技术方案中，肿瘤放射治疗增敏剂中黄连素浓度小于等于5 μ mol/L， 进一步优选的技术方案中，肿瘤放射治疗增敏剂中黄连素浓度为2 μ mol/L 5 μ mol/L。应用上述肿瘤放射治疗增敏药物的方法，包括但不限于以下两种方法(1)在肿瘤病人放射治疗前不同时间(如30分钟)静脉注射不同剂量的黄连素针 剂(如50mg/kg)，然后给予放射治疗，以提高肿瘤的放射治疗疗效。(2)在肿瘤病人放射治疗前不同时间(如60分钟)肿瘤局部注射不同剂量的含黄 连素水溶胶(如100mg/kg)，然后给予放射治疗，以提高肿瘤的放射治疗疗效。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点本发明所述肿瘤放射治疗增敏药物可以提高肿瘤放射治疗的治疗效果，降低肿瘤病人的放射治疗的照射剂量，降低放射治疗所带来的毒副作用，从而提高病人的生存质量。
图1是实施例中细胞存活率和黄连素用量与时间关系图；图2是实施例中黄连素诱导细胞凋亡的Armexin-V/PI染色和流式细胞分析结果 图；图3是实施 例中指数生长的MDA-MB-231和MCF-7细胞培养中加入不同浓度的黄 连素24小时处理后完成Wester blot法测定蛋白表达图；图4是实施例中MCF-7和MDA_MB_231两种细胞(有/无黄连素处理)经不同剂 量辐射的生存曲线图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例(1)材料人乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MCF-7购于美国细胞收藏中心(ATCC)， 并由发明人所在实验室保存和培养；D-MEM培养基干粉，小牛血清，胰酶粉末购自Gibco公 司；标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、IOX转膜 液、30% Acry-Bis、Tris-Hcl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI) 购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMS0)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技 生物工程有限公司；caspase-3，bcl_2、bax、cyclin Dl等抗体购自美国Santa Cruzs生物 技术公司；RNase A 禾口 10 μ g/mL proteinase K 购自美国 Sigma Aldrich 公司。(2)细胞培养MDA-MB-231及MCF-7细胞培养于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100 万U/L青霉素和链霉素的D-EME培养基。细胞置于5% CO2, 37°C培养箱内培养，每2_3天 传代1次，本实施例中取对数生长期细胞用于实验。(3)照射条件细胞置于直线加速器下，射线性质为高能6兆伏X-线，照射野为 IOcmX 10cm，源皮距为100cm，剂量率为200cGy/min。照射时培养皿面上覆盖1. 5cm厚等效 蜡板以调整照射剂量。(4) MTT法观察乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞的生长在药物处理前24小时细 胞(5X104/mL)接种至96孔板中，每个浓度设5个平行孔。加入不同浓度的黄连素继续培 养24，48或72小时。细胞培养液中加入20 μ LMTT (5 μ g/mL)继续培养4小时。吸弃培养 液，每孔加入150 μ L DMSO,摇床轻柔振荡10分钟，最后采用酶标仪(A570nm/A630nm吸光 值)检测光密度，采用细胞存活率=加药组值/对照组值X 100%方式计算细胞存活率。重复三次实验，将三次实验数据处理后得到实验结果(平均值士误差)，绘制细胞 存活率和黄连素用量与时间关系图，结果参见图1 黄连素明显抑制细胞的生长，并显现剂 量_效应和处理时间_效应的关系；黄连素抑制50% MCF-7细胞生长的剂量(IC5tl)在分别 为20· 1“11101/1(24小时)，10.4“11101/1(48小时)和 5. 3 μ mol/L (72 小时)；在另外一乳 腺癌细胞系MDA-MB-231，黄连素IC50分别为10. 3 μ mol/L (48小时)和4. 7 μ mol/L (72小 时)。这些实验结果说明黄连素明显地抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的生长，与黄 连素处理浓度和处理时间成正比，即表现为剂量_依赖和处理时间依赖性。MDA-MB-231细胞比MCF-7细胞对黄连素微敏感一些，但黄连素的IC5tl浓度都在大约10 μ mol/L(48小时) 和大约5 μ mol/L(72小时)，说明黄连素抑制乳腺癌细胞生长可能是细胞系非依赖性的。(5)流式细胞技术分析细胞周期的变化将乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7接种 于IOOmm培养瓶，待贴壁后(待细胞长至60-70%左右)分别加入不同浓度黄连素处理24 小时后收集各组细胞，采用l，800g离心速度离心5分钟。弃去上清，用Ix PBS缓冲液洗涤 细胞1次，1，SOOg离心5分钟，并收集细胞沉淀。细胞放置在冰上预冷的70%乙醇固定4 小时，离心后，以Ix PBS洗涤细胞两次。离心后，悬浮细胞于500 μ L含300 μ g/mL RNase A 和 10μ g/mLproteinase K (美国 Sigma Aldrich 公司)的 PI 溶液中(10 μ g/mL)，3O 分钟 后，经孔径为53μπι的尼龙滤网过滤，FACS-Calibur流式细胞仪上检测分析。分析结果参 见表1 黄连素处理诱导了剂量依赖性的G0/G1期细胞周期阻滞，降低了 S期细胞比例。但 对G2/M期比例并没有产生明显影响。而且，在黄连素处理的MCF-7和MDA-MB-231两种细 胞中都可以观察G0/G1期细胞周期阻滞。这些实验结果说明黄连素可以诱导乳腺癌细胞周 期阻滞。随着黄连素浓度的增加，乳腺癌细胞S期比例下降，同时出现明显的G0/G1期细胞 阻滞。表1.黄连素对MDA-MB-231及MCF-7细胞周期的影响。 MDA-MB-231 细胞MCF-7 细胞
黄连素 -
(Hmol/L)G0/G1SG2/MG0/G1SG2/M
O44.39±2.7234.47±2.3421.15±10.7545.45±2.0434.26±0.9121.08±1.63
551.09±3.53*29.59±6.0619.33±8.4849.96±0.29*28.11±3.5721.23±3.72
1054.00±4.22*27.6ftt6.3418.40±7.6555.51±1.02*27.12±6.1216.71±5.62
2058.35士 1.04*21.28±1.2220.37±11.1159.03±0.43*21.63±3.6817.71±3.99
4063.98±1.11* 18.63±0.91 17.54±9.55 63.10±0.86* 19.04±0.94 18.01±1.14
— \注现已知肿瘤细胞主要是由于细胞周期破坏而导致了细胞的失控性生长，细胞 周期阻滞是乳腺癌许多化疗药物和放射治疗的重要作用机理之一。< 0. 05 (与对照组 相比)。(6)磷脂酰丝氨酸外翻分析细胞凋亡(Armexin V和PI双染法，采用Armexin-V/ PI染色和流式细胞分析方法可以将细胞分成4种属性，其中Dl象限(Annexin-V7Pr)为 坏死细胞象限；D2象限(Armexin-VVPI+)为晚期凋亡细胞；D3象限(Armexin-V7Pr)为 未损伤正常细胞；D4象限(Armexin-VVPr)为早期凋亡细胞。)将对照组细胞和不同浓 度黄连素处理后的细胞用采用PBS洗2次，加入100 μ 1 binding buffer和FITC标记的 Annexin-V (20 μ g/ml) 10 μ 1，并室温避光30分钟。细胞再加入PI (50 μ g/ml) 5 μ 1，避光静 置5分钟后，最后加入400 μ 1 binding buffer，并立即用流式细胞仪定量检测。以不加 ArmexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照，分析结果参见图2。从图2的结果可以看出，在未处理的乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞处于IV 象限的细胞数量非常少，即分别5. 2%和3. 4%，而处在I和II象限的细胞几乎是检测不 至IJ。黄连素24小时处理的乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞凋亡及死亡细胞比例均增高， 在 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞分别 51. 2% 和 23. 3% (10ymol/L)以及 86. 6 % 和 66. 6 %(40μπιΟ1/ ，即IV象限的早期凋亡细胞数量随着黄连素的浓度增高而呈明显增加。而且 黄连素液使得处在I和II象限的细胞数量也明显增多。这些实验结果说明大剂量黄连素 可以诱导乳腺癌细胞的凋亡。
(7) Western-blot法分析黄连素对细胞周期和凋亡相关蛋白的影响收集细胞并 转至于1. 5ml的Eppendorf管中离心(2500转/分)5分钟，弃上清，并加入100 μ 1 IP裂 解液，置于冰上2小时。4°C离心5分钟(2，500转/分钟)，转移上清液至新的Eppendorf 管，并采用分光光度计检测样品蛋白含量。加入蛋白上样缓冲液(5X)混勻，置于恒温混勻 器上，100°C 5分钟，蛋白电泳后转至醋酸纤维膜上。膜采用封闭液(5%脱脂奶粉，IXT-BST 缓冲液)封闭lh。洗涤，并加入一抗β-Actind 1000稀释)，Bax(l 1000稀释)， Bcl-2(1 500 稀释)，Caspase 3(1 1000 稀释)，Cyclin B(1 500 稀释)，Cyclin DKl 500稀释)经封闭液处理的醋酸纤维膜室温抚育1小时。T-BST缓冲液洗膜3次， 加入二抗(1 1000稀释)抚育1小时。T-BST缓冲液洗膜3次，最后加ECL发光剂，显影、 定影，胶片洗涤和干燥后，扫描分析。分析结果参见图3。如图3所示，黄连素24小时处理后，Bax蛋白表达在MDA_MB_231及MCF-7两种细 胞中都显现剂量依赖性的明显增加。同样，Caspase-3蛋白表达水平也表现出剂量依赖性 的明显提高。相反，Bcl-2和Cyclin Bl两种蛋白的表达均出现降低，在5 μ mol/L处理后 就可见明显的下降，且随黄连素浓度的增加而降低。而黄连素并不影响Cyclin Dl蛋白表 达水平。(8)细胞克隆形成法5 μ mol/L黄连素处理4小时的细胞接受不同剂量的x -辐 射照射，然后接种到IOOmm培养皿。连续培养三周后，采用甲醇固定，加姬姆萨液染色30分 钟，流水洗净，最后观察和记录含有>50细胞的克隆个数。采用克隆形成率(PE)=(对照 组克隆数/实验组细胞数)X 100%公式计算克隆形成率，采用存活分数=实验组克隆形成 率/对照组克隆形成率公式计算存活分数。计算放射增敏比SER =对照组DO/实验组DO。重复三次实验，取三次实验结果的平均值(所有数据误差都在5%以下)，采用单 靶多击模型完成拟合生存曲线，结果参见图4。由图4可知，与没有用黄连素处理的细胞相比，黄连素处理后的MCF-7和 MDA-MB-231两种细胞出现生存曲线无肩，成一直线。单靶多击模型曲线回归检测后计算黄 连素浓度5 μ mol/L24小时处理的MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞辐射增敏比分别为1. 4207 和1.5420。这些实验结果说明黄连素增加乳腺癌细胞的放射敏感性。注，本实施例中，所有实验均重复3-5次，取平均值，结果用歹± S表示。采用SAS 统计软件对相关数据进行t检验，以P < 0. 5为有显著性差异。克隆形成实验中细胞存活 曲线及回归方程采用SigmaPlot 9. 0分析。本实施例证明，黄连素通过抑制肿瘤细胞周期进程和影响细胞周期进程和细胞凋 亡相关蛋白的表达，从而增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。因此，本发明在黄连素在包括 乳腺癌在内的各种肿瘤放射治疗前给药和放射治疗同时给药可以提高肿瘤放射治疗增敏 性，从而提高放射治疗的治疗效果。
权利要求
黄连素在制备肿瘤放射治疗增敏药物中的应用。
2. 一种肿瘤放射治疗增敏药物，其特征在于，所述肿瘤放射治疗增敏药物活性成分为黄连素。
3.根据权利要求2所述肿瘤放射治疗增敏药物，其特征在于，肿瘤放射治疗增敏剂中 黄连素浓度小于等于5 μ mol/L。
4.根据权利要求3所述肿瘤放射治疗增敏药物，其特征在于，肿瘤放射治疗增敏剂中 黄连素浓度为2 μ mol/L 5 μ mol/L。
全文摘要
本发明公开了一种肿瘤放射治疗增敏药物，所述肿瘤放射治疗增敏药物活性成分为黄连素。研究发现(1)黄连素处理乳腺癌细胞可以诱导剂量依赖性的G0/G1期细胞阻滞和细胞凋亡。(2)黄连素明显降低了细胞周期调节相关蛋白cyclin B和抗细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，而增加了凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达水平。(3)黄连素处理后的乳腺癌细胞明显提高了细胞对放射治疗的敏感性。本发明所述肿瘤放射治疗增敏药物可以提高肿瘤放射治疗的治疗效果，降低肿瘤病人的放射治疗的照射剂量，降低放射治疗所带来的毒副作用，从而提高病人的生存质量。
文档编号A61K31/4375GK101816653SQ201010158998
公开日2010年9月1日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者樊赛军 申请人:苏州基莫夫药物开发有限公司