专利名称：Ace2激活用于治疗心脏、肺和肾脏疾病及高血压的制作方法
技术领域：
本发明提供了用于诊断和治疗包括高血压、冠心病、心脏和肾衰竭、肺水肿和肺损 伤(如中毒性休克或人工通气下的肺损伤)的心脏、肺和肾脏疾病的组合物和方法。
背景技术：
心血管疾病将成为21世纪健康护理的最主要负担，预测到2020年时将成为世界 范围内最常见的死因。高血压是心脏疾病的一个主要危险因素。高血压是一种既受遗传因 素又受环境因素控制的多因子数量性状。虽然已知许多关于能导致高血压的环境因素，如 饮食和体力活动，但是关于造成心血管疾病的遗传因素知道很少。尽管证明了一些与动物 模型中高血压相关的推定的数量性状遗传位点(QTL)，但这些位点没有被翻译成基因。因 而，导致高血压和其他心血管疾病的分子和遗传机制在很大程度上仍然不清楚。血压稳态的一个关键调节剂是肾素_血管紧张素系统(RAS)。蛋白酶肾素切割血 管紧张素原形成非活化的十肽(decamericp印tide)血管紧张素I (Ang I)。接着血管紧张 素转化酶能催化切割Ang I形成活化的八肽血管紧张素II (Ang II)，其通过引起血管平滑 肌收缩和肾小管钠重吸收作用导致高血压。ACE突变小鼠显示了自发性低血压、部分雄性不 育和肾畸形。在人类中，ACE多态性与肾和心血管功能的决定因素相关，并且ACE与Ang II 受体的药理学抑制能有效地降低血管压力和减少肾脏疾病。此外，ACE和Ang II受体的抑 制对心力衰竭具有有益作用。近来，一个ACE同系物，称为ACE2，已被证实主要在肾脏和心脏的血管内皮细胞中 表达。有趣地是，两个ACE同系物也存在于蝇中。不像ACE，ACE2具有羧肽酶功能，从Ang I上切割单个残基，产生Angl-9，和从Ang II上切割单个残基产生Angl_7。这些体外生化 数据暗示ACE2调节RAS并因此可能在血管压力调节中扮演一个角色。ACE2在心血管系统 和RAS中的体内角色未知。Acton等在美国专利6，194，556中描述了 ACE2在诊断和治疗ACE2相关病症中的 应用。该专利陈述了高血压中ACE2表达水平增加，和ACE2活性的拮抗剂或抑制剂可被用 于治疗增加的血管压力或相关病症。加拿大第2，372，387号专利申请提供了 ACE2抑制剂 的具体例子，其有望被用于治疗心脏疾病，如高血压。其再一次强调了需要抑制，而不是增 加ACE2的活性。这些仅仅基于体外试验数据的参考文献教导需要抑制ACE2活性。它们没 有提供体内数据，如敲除的哺乳动物数据，来表征ACE2。迄今为止，没有一种ACE2抑制剂被 批准可作为药物用于治疗高血压。而且，ACE2在心血管系统和RAS中的体内角色在很大程 度上仍然未知。为了能设计合适的诊断测试剂和用于治疗心脏和肾脏疾病的药物，因此需 要表征ACE2的功能。发明简述本发明提供了一种用于调节肾素-血管紧张素系统的新范例和显示了一种完全新的和预料不到的ACE2用法，其不同于基于体外数据的预测(Acton专利)并在现有技术 中预料不到，即ACE2作为一种心功能和血压控制必需的RAS的关键的负调节物。ACE2的激 活是用于治疗和预防心脏、肺和肾脏疾病的关键。本发明第一次证明了给动物施用ACE2激 活剂能预防和治疗高血压和心脏和肾脏疾病，和肺损伤。附图简述本发明优选实施方案将结合下列附图描述，其中
图1.大鼠ACE2的序列和染色体定位。a.大鼠、小鼠和人ACE2与小鼠和人睾丸-ACE (T-ACE)的蛋白比对。黑影表示氨基 酸同一性，灰影表示氨基酸相似性的程度。b.ACE和ACE2结构域示意图。注意ACE2仅含 有一个ACE结构域，其带有一致锌结合位点HEMGH。黑色表示催化中心，灰色表示信号肽， 阴影线表示跨膜结构域。c.小鼠和大鼠ACE2基因在不同成人组织和不同胚胎发育日(E7 =胚胎期第7天)中的表达模式。注意在小鼠中ACE2存在两种同种型，但在大鼠或人中不 存在(未显示)，类似于在ACE中所见到的现象15。d.与在Sabra盐敏感性动物(SS-X)、 SHRSP(BP3)和SHR大鼠(BB. Xs)中鉴定的QTL定位相比，大鼠ACE2放射性杂交定位的结 果。多态性标记的名字显示在表意符号的左侧。显示了与ACE2连锁的标记的LOD得分和 θ值。cR=厘拉德。图2.高血压大鼠模型中ACE2表达水平。a.来自Sabra SBH/y和SBN/y大鼠肾脏的ACE2 mRNA的RNA印迹分析。上图显示 了以肌动蛋白作为对照水平的RNA印迹图谱。下图显示了对于肌动蛋白水平标准化的ace2 信使的相对水平。b.来自Sabra SBH/y和它们的对照SBN/y大鼠以及SHR和SHRSP和它们 的对照WKY大鼠的肾脏的ACE2蛋白水平的蛋白质印迹分析。上图显示了代表性蛋白质印迹 图谱。显示了每种Sabra大鼠的收缩血压(BP)，用mmHg表示。下图显示了对于肌动蛋白进 行校正的ACE2蛋白相对水平。竖条显示了平均值+/-SEM，* = ρ < 0. 05，** = ρ < 0. 01。 (对于所有组，η = 4)。图3.通过同源重组对小鼠ACE2的靶向破坏a.基因靶向策略。显示了鼠ace2野生型位点的一部分(上)。黑框表示外显子。 设计靶向载体，从而以置于反义方向的新霉素(neo)抗性基因盒置换编码锌结合催化结构 域外的显子9。胸苷激酶(TK)被用作负选择。阴影线框表示用于DNA印迹分析的3’和5’ 侧翼探针。b. ce+/y和ace+ ES细胞的DNA印迹分析。用EcoR I消化基因组DNA并与(a) 中显示的3’和5’侧翼探针杂交。c. ace2+/y和acd*小鼠肾脏中ACE2蛋白表达的蛋白质 印迹分析。抗-ACE2抗体与被删除的N-端的区域反应。d. ce2+/y和acd^小鼠心脏和肾 脏中ACE mRNA表达的RT-PCR分析。显示了用于线性扩增的不同的PCR循环和作为对照的 GAPDH mRNA 水平。图4.正常的血压和肾功能a.在不存在(左栏)或存在ACE阻断剂卡托普利条件下，3个月大小的aCe2+Ar(n =8)和acd+Oi = 8)小鼠的血压测量结果。使用尾套测定血压并显示了平均值+/-SD。 如“方法”部分所述，在进行血压测量前给小鼠施用卡托普利2周。使用侵入性血液动力学 和Langendorf测量法证实上述血压值(未显示)。在卡托普利处理的aCe2Vy和acd^小 鼠中的差异是明显地不同于它们分别未处理的组Cp <0.01)。b.在6个月大小的ace2v7和ace〗+小鼠中观察到正常的肾脏组织学结果。箭头表示肾小球。图5.心脏形态学a.分离自6个月大小的ace2+Ar和aCe2_"小鼠的心脏H&E染色切片。在ace2_"小 鼠中观察到扩张的左心室(LV)和右心室(RV)。但是，两种基因型之间的总的心脏尺寸是 相当的，且目视检查或在分离的心肌细胞中，没有证据表明心脏肥大。b.来自6个月大小 的ace2+Ar(n = 8)和acdAfc = 8)小鼠的心脏/身体重量比值的测定值作为心脏肥大的 指标。应注意在所有被分析的年龄的不同遗传组中，身体重量、心脏重量、胫骨长度和心脏 重量/胫骨长度比值也没有改变(未显示)。c. d.在ace〗+小鼠中不存在间质性纤维化。 扩张性心肌病的一个标志性特征是间质性纤维化。但是，在aCe2+Ar(n = 8)和acd^Oi = 8)小鼠之间心脏的间质性纤维化是相当的。(c)显示了单个心脏的PSR染色。在野生型和 突变动物中，注意到正常的血管周围纤维化被染成红色。(d)在间质中纤维化改变的定量表
7J\ ο图6. ACE2损失导致严重收缩性心力衰竭a，在一只6个月大小的ace2+Ar和两只acd^小鼠中心脏收缩的超声心动图测量 结果。波峰和波谷表示每一次心博的心脏收缩和心脏舒张。箭头表示收缩期收缩(LVESD) 和舒张期松弛(LVEDD)之间的距离，测定分数缩短的百分比(％ FS)。注意在acd^小鼠中 增加的舒张和收缩大小表示心脏扩张。实验数据见表1。b.在6个月大小的ace2+Ar(n = 8)和aceZAOi = 8)小鼠和6个月大小的ace2"_(n = 5)和ace2+(n = 5)雌性小鼠中，观 察了两个心脏收缩的标志性参数即分数缩短百分数和纤维鞘(circumferetial fiber)缩 短速率。通过超声心动描记术测定数值。显示了平均值+/-SD。在遗传组之间』< 0.05 和< O-Ol0实验数据见表1。c，在6个月大小的ace2+Ar(n = 8)和acd^Oi = 8)雄 性小鼠和6个月大小的ace2v-(n = 5)雌性小鼠和ace2+(n = 5)雌性小鼠中的血压测量 值。显示了平均值+/-SD。使用侵入性血液动力学测量法证实血压值，见表2，》p< 0.05。图7.在不存在ACE2条件下，组织缺氧标记的增量调节和增加的血管紧张素II水 平a，b，6个月大小的雄性ace2+Ar (η = 5)和acd+ (η = 5)小鼠中两个组织缺氧诱导 型基因即ΒΝΙΡ3和PAI-I mRNA表达水平的RNA印迹分析。(a)显示了每个RNA印迹的数据， 和(b)对gapdh对照水平进行标准后化的BNIP3和PAI-I mRNA的相对水平。< 0.01oc，在6个月大小的雄性ace2Vy(n = 8)和ace2-"(n = 8)同窝出生小鼠的心脏和 肾脏中，血管紧张素I(AngI)和血管紧张素II(AngII)肽水平。通过放射性免疫测定法测 定AngI和AngII组织水平。显示了平均肽水平+/-SD。01。图8. ACE-ACE2双突变小鼠不发展心力衰竭。a，在 6 个月大小的雄性 ace2+/y (η = 8)，ace+ (η = 8)，和 ace+ace〗—"双突变(η =6)小鼠中测量血压。显示了平均值+/-SD。使用侵入性血液动力学测量法证实血压。与 野生型小鼠比较，突变体的材ρ < O. Ol。b，在6个月大小的雄性ace2+/y (η = 8), ace2Vy (η =8)，％一_01 = 8)，和％一、(^2+双突变(η = 6)同窝出生小鼠中分数缩短百分数和纤 维鞘缩短速率。通过超声心动描记术测定数值。显示了平均值+/-SD。在遗传组之间
< 0. 01。实验数据见表3。c，在6个月大小的雄性ace2"y，ace2"y，ace+，和ace+ace〗^ 双突变同窝出生小鼠中心脏收缩的超声心动图测量值。如图6a所示分析并标记超声心动图。注意在ace2空背景中完全除去ACE拯救了在acd*单突变小鼠中观察到的收缩性心 脏缺陷。图9.计算一定时间内偏离基线的弹性(elastance)变化百分数。通过将气管峰 值压力除以体积从而计算肺弹性。图 10. a，人 ACE2 DNA (SEQ ID NO :1)。b，人 ACE2 多肽(SEQ IDNO 2)。图 11. a.小鼠 ACE2 DNA(SEQ ID NO :3)。b.小鼠 ACE2 多肽(SEQ IDNO 4)。图12. ACE2核苷酸多态性和序列。发明详述本发明提供了一种用于RAS系统调节的新范例，并且显示了 ACE2是心功能和心血 管功能、肾功能和肺损伤所必需的RAS的一种关键负调节物。在治疗和预防心脏和肾脏疾 病和高血压及肺损伤中，ACE2的激活是关键。本发明第一次教导了给动物施用ACE2激活 剂预防和治疗心力衰竭和高血压、肾脏疾病以及肺损伤。鉴于现有技术的参考文献，如上述的美国专利6，194，556和加拿大第2，372，387 号专利申请，教导应该抑制ACE2活性来治疗心脏疾病，因此本发明结果是完全预料不到 的。因此令人惊奇的是，通过激活ACE2表达和/或活性实际治疗了心脏疾病。本发明包括激活剂，该激活剂包括但不限于ACE2功能和/或ACE2mRNA和ACE2蛋 白表达的激活剂，本发明也包括含有该激活剂的药物组合物。本发明也包括心脏疾病、肺病 和肾病及高血压的医学治疗方法，通过施用有效量的激活剂予需要治疗的动物而实现。肺 病包括但不限于慢性阻塞性肺部疾病、肺炎、哮喘、慢性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、间 质性肺病、原发性肺动脉高压、肺栓塞、肺结节病(pulmonary sarcodosis)、结核和肺癌。本发明也包括用于检测ACE2激活剂的筛选检测法，该激活剂可被用于治疗心脏 疾病和肾病和高血压及肺病。这些检测法是体外或体内的。在一个优选的实施方案中，本 发明包括一种内皮、肾、肺或心脏细胞检测法，用于评估候选化合物是否能增加ACE2表达 或活性。在存在至少一种其激活表达或活性的能力需要被测定的化合物的条件下培养细 胞，和测量该细胞的ACE2表达水平是否增加。本发明的另一个方面包括一种用于鉴定可克 服ACE2损失的影响的化合物的ACE2敲除小鼠。在这些检测法中多肽和小的有机分子被测 试。本发明包括所有通过本发明的筛选方法被鉴定并适于以药物组合物的形式施用给动物 的化合物。本发明的另一个方面是心脏和/或肾脏疾病和/或高血压和/或肺病的发作或风 险的诊断。可通过测量心脏、血清或肾脏或其他组织中的ACE2水平诊断。ACE2水平少于野 生型水平表示“ACE2减少状态”，本发明显示该状态与心脏和/或肾脏疾病和/或高血压、 和/或肺病、或疾病风险直接相关。对于本领域的技术人员而言，ACE2的野生型水平和减 少的水平是显而易见的。ACE2减少状态也可通过如下所述的ACE2a-ACE2m多态性来指示。 本发明对于治疗和诊断与减少的ACE2表达或活性相关的疾病是有用的。通过与ACE2减少 状态相关的在ACE2基因中及其上游和下游的多态性的分析，诊断也可选地被完成。根据于 此所述的方法，区分多态性的核苷酸的检测所需要的所有试剂可被提供于一个单一的试剂 盒中，用于分离自动物基因组DNA的分析。为了提供用于诊断疾病的风险或发作的基因分 型和表型分型，该试剂盒可含有可区分ACE2多态性的标记探针。多态性特异的探针可被适 当地标记并在退火条件下加入到产生的DNA片段中，从而只有一个多态性特异的探针杂交
8并能被检测，因此鉴定特异的ACE2多态性。治疗方法如上文所述，本发明人已经证明了在高血压、心脏和肾脏疾病中ACE2基因表达是 减量调节的。因此，本发明提供了一种治疗或预防高血压、心脏疾病、肺或肾脏疾病的方法， 包含给由此需要的动物施用有效量的能增加ACE2表达的试剂。于此使用的术语“能增加ACE2表达的试剂”指与在不存在该试剂下在相同类型的 细胞中ACE2基因或蛋白的水平或活性相比，能增加ACE2基因或蛋白的水平或活性的任何 试剂。该试剂可以是任何类型的物质，包括但不限于，核酸分子(包括ACE2或其片段)，蛋 白(包括Ace2或其片段)，肽，糖类，小分子，或有机化合物。本领域技术人员使用已知的 方法包括蛋白质印迹SDS-PAGE，免疫化学，RT-PCR，RNA印迹和原位杂交可容易地测定ACE2 基因是否增加。于此使用的术语“动物”包括动物界的所有成员。该动物优选为人。于此使用的术语“有效量”指在增加ACE2水平必需的剂量和时间方面有效的量。于此使用的术语“治疗”指一种用于获得有益的或想要的结果包括临床结果的方 法。有益的或想要的临床结果可包括，但不限于，一或更多种症状或病症的缓和或改善，疾 病程度的减小，疾病的稳定状态(即，不恶化)，预防疾病的扩散，延缓或减慢疾病的进展， 疾病状态的改善或减轻，和症状缓解(无论部分的或全部的)，无论可检测的或不可检测 的。“治疗”也可指与不接受治疗的预期存活相比延长的存活。ACE2核酸分子的施用在一个实施方案中，通过施用包含ACE2基因或其部分的核酸，而增加ACE2基因的 表达。在另一个实施方案中，通过施用增加ACE2基因表达的试剂，包括使用本申请中的 筛选检测法而被鉴定的任何试剂，ACE2基因的表达可被增加。因为可通过ACE2的增量调节治疗动物患病，失调或异常身体状态，所以增加ACE2 表达的基因治疗有助于减轻心或肾或肺疾病的发展/进行本发明包括用于提供ACE2基因治疗的方法和组合物，用于治疗以减少的ACE2表 达或ACE2多肽活性水平为特征的疾病，失调或异常身体状态。本发明包括用于提供编码ACE2的核酸分子或功能等价核酸分子给动物的细胞的 方法和组合物，使得在所述细胞中ACE2的表达给那些细胞提供了 ACE2多肽的生物学活性 或表型。足够量的核酸分子被施用且以足够水平表达以给所述细胞提供ACE2多肽的生物 学活性或表型。例如，所述方法可优选包括递送编码ACE2的核酸分子到患有心血管、肾脏 或肺疾病的动物的细胞的方法，包含施用于患者包含编码ACE2的DNA的载体。所述方法也 可涉及一种通过施用编码ACE2的DNA于患有心血管或肾脏、或肺疾病的动物提供生物活性 的ACE2多肽的方法。所述方法可在体内或离体进行(如，用心、肺、内皮或肾干细胞、祖细 胞或其他要被移植的细胞)。用于施用ACE2(包括在基因治疗中)到分离的细胞或动物中 的方法和组合物被阐述于，例如美国专利第5，672，344，5，645，829，5，741，486，5，656，465， 5，547，932,5，529，774,5，436，146,5，399，346,5，670，488,5，240，84,6，322，536, 6，306，830和6，071，890号和美国专利申请第20010029040号，他们全文在此一并引入作为 参考。
所述方法也涉及一种通过产生适合于基因治疗的包含编码ACE2的DNA的病毒而 产生重组病毒品系的方法。所述方法优选包括转染可用于病毒复制的细胞(所述病毒含有 所述核酸分子)和收集产生的病毒。所述方法和组合物可用于体内或体外。本发明也包括组合物(优选用于基因治疗 的药物组合物)。所述组合物包括含有ACE2的载体。所述载体可以是药学上的载体或包括 该载体的宿主细胞转化体。本领域已知的载体包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺伴随病 毒(AAV)、疱疹病毒载体，如牛痘病毒载体，HIV和基于慢病毒的载体、或质粒。本发明也包 括产生所述载体所需要的包装和辅助细胞系。产生所述载体的方法和使用所述载体的基因 治疗的方法也包括在本发明中。本发明也包括含有所述载体和所述重组ACE2核酸分子序列的转化细胞。ACE2变体-多肽序列修饰的用途ACE2变体可被用于本发明的方法中。产生化学上等价的或化学上相似的氨基酸序 列的改变也被包括在本发明的范围内。具有与ACE2受体序列同一性的多肽被测试以确保 他们适合用于本发明的方法中。本发明多肽的变体可自然地产生，例如，通过突变，或可被 制得，例如，用多肽工程技术如定向诱变，其在本领域中众所周知用于氨基酸的取代。例如， 疏水残基如甘氨酸可被用于取代另外的疏水残基如丙氨酸。丙氨酸残基可被更疏水的残基 如亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸取代。负电荷氨基酸如天冬氨酸可取代谷氨酸。正电荷氨基 酸如赖氨酸可取代另一种正电荷氨基酸如精氨酸。因此，本发明包括了在氨基酸序列中具有保守改变或取代的多肽。保守取代插入 一个或多个具有与被置换的氨基酸相似的化学性质的氨基酸。本发明包括其中产生的保守 取代不破坏化合物活性的序列。包含一或多个d-氨基酸的多肽被考虑于本发明中。也考虑的是其中一或多个氨 基酸在N-末端被乙酰化的多肽。本领域技术人员可意识到大量技术可被用于构建多肽模 拟物，其具有与本发明相应的多肽化合物相同或相似的期望的化合物活性，但与所述多肽 在溶解性、稳定性和/或对水解和蛋白酶解易感性方面具有更良好的活性。参见，例如， Morgan 和 Gainor, Ann. Rep. Med. Chem.，24 :243_252 (1989)。多肽模拟物的例子描述于美 国专利第5，643，873号。其他描述如何制造和使用模拟物的专利包括，例如，5，786，322， 5，767，075,5，763，571,5，753，226,5，683，983,5，677，280,5，672，584,5，668，110, 5，654，276，5，643，873。也可根据本领域公知的其他技术制造本发明多肽的模拟物。例如， 通过将本发明的多肽和一种试剂反应，该试剂通过将氢基团转变为其他基团如羟基或氨基 基团而以化学方法改变侧链基团。模拟物优选包括完全由氨基酸制成的序列或包括氨基酸 和修饰的氨基酸或其他有机分子杂合序列。本发明也包括杂合体和多肽，例如其中一个核苷酸序列与另一个序列结合。本发明也包括使用ACE2多肽片段的方法，如果该片段保持活性，其可被用于赋予 化合物活性。本发明也包括多肽和本发明多肽的片段，其可被用作一种研究工具来表征所 述多肽或其活性。这样的多肽优选由至少5个氨基酸组成。在优选的实施方案中，他们可 由 6 至 10，11 至 15，16 至 25，26 至 50，51 至 75，76 至 100 或 101 至 250 或 250 至 500 个氨 基酸组成。片段可包括具有一或多个氨基酸缺失的序列，例如，在化合物序列中C-末端氨 基酸缺失。
ACE2多肽活性的增强通过进行选择性定点诱变增加或减少ACE2的活性。含有所述核酸分子或具有序 列同一性的核酸分子的DNA质粒或表达载体被优选用于使用来自Pharmacia Biotech的 U. S. E (单一位点消除)诱变试剂盒或其他的可商业上获得的诱变试剂盒，或使用PCR的这 些研究。一旦突变形成及通过DNA序列分析被证实，使用表达系统表达该突变多肽并监测 其活性。本发明也包括使用多肽的方法，该多肽与人或小鼠ACE2 (或他们的部分序列)具 有至少约> 20%，> 25%，> 28%，> 30%，> 35%，> 40%，> 50%，> 60%，> 70%，> 80%或> 90%，更优选至少约> 95%，> 99%或> 99. 5%的序列一致性。修饰的多肽分子 讨论如下。优选约1，2，3，4，5，6至10，10至25，26至50或51至100，或101至250个核
苷酸或氨基酸被修饰。根据本领域公知的方法计算同一性。序列同一性最优选通过BLAST 2. 1版程序高 级搜索(参数如上)估算。BLAST是一系列的稈序，其可在httD://www, ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST 在线获得。高级 BLAST 搜索(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/blast/blast. cgi ？ Jform = 1)设置为默认参数(即矩阵BL0SUM62 ；缺口罚分(Gap existence cost) 11 ；每一 残基缺口罚分(Per residue gap cost) 1 ； λ比值0.85，默认值)。关于BLAST 检索的参考文献是Altschul，S. F.，Gish, W.，Miller, W.，Myers, Ε· W. &Lipman，D. J. (1990)"基本局部比对检索工具"J. Mol. Biol. 215 403-410 ；Gish, W. &States, D. J. (1993)“通过数据库相似性搜索鉴定蛋白编码区域〃 Nature Genet. 3 266-272 ；Madden, Τ. L.，Tatusov, R. L. &Zhang，J. (1996)“网络 BLAST 服务器的应 用“Meth. Enzymol. 266 131-141 ；Altschul, S. F. , Madden, Τ. L. , Schaffer, Α. Α., Zhang, J.，Zhang, Ζ.，Miller, W. &Lipman，D. J. (1997) “ Gapped BLAST 和 PSI—BLAST 新 一代蛋白质数据库检索程序〃 Nucleic Acids Res. 25 3389-3402 ；Zhang, J. Madden, T.L. (1997) “ PowerBLAST:—种新的应用于交互式或自动序列分析和注释的网络 BLAST" Genome Res. 7 :649_656。优选地约1，2，3，4，5，6至 10，10 至 25，26 至 50 或 51 至 100，或 101 至 250 个核
苷酸或氨基酸被修饰。本发明包括具有导致在不涉及提供活性的多肽的部分中的氨基酸改 变或在涉及提供活性的多肽的部分中的氨基酸改变的突变，使得该突变增加或减少多肽的 活性。筛选ACE2激活剂小的有机分子被筛选以确定他们是否增加ACE2表达或活性。ACE2的多肽片段和 具有与ACE2序列一致性的多肽也被测试以确定他们在体外检测和在体内细胞系是否增加 ACE2活性。激活剂优选作用于ACE2的特定结构域以增加ACE2的激活作用。为获得特异 性，激活剂应以ACE2的独特序列作为靶标。本发明也包括能增加ACE2表达的物质的分离。特别是可分离能结合ACE2基因或 蛋白的配体或物质。对于能结合ACE2基因或蛋白的物质如蛋白，可测试生物学样本和商业 上可得到的文库。例如，ACE2蛋白的氨基酸序列可用于探查多肽文库，而编码ACE2的核苷 酸序列可用于探查核苷酸文库。此外，制备的ACE2的抗体可被用于分离其他与ACE2具有 亲合性的多肽。例如，标记抗体可被用于探查噬菌体展示文库或生物学样本。
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根据一些因素，如物质和ACE2基因或蛋白的特性和数量，可以选择允许该物质和 ACE2基因或蛋白形成复合物的条件。物质_蛋白或物质_基因复合物，游离的物质或非复 合的物质可通过常规的分离技术被分离，例如，盐析、层析、电泳、凝胶过滤、分级、吸收、聚 丙烯酰胺凝胶电泳、凝集或其组合。为便于成分的检测，抗ACE2或该物质的抗体，或标记的 蛋白，或标记的物质可被使用。如果合适，抗体、蛋白或物质可用如下所述的可检测的物质 标记。—旦潜在的结合配偶体被分离，可设计筛选方法以测定结合ACE2基因或蛋白的 该物质是否可用于本发明方法中以在细胞中提高ACE2的表达并因此在疾病治疗中是有用 的。因此，本发明也提供了用于鉴定能结合ACE2基因或蛋白的物质的方法。特别是， 该方法可被用于鉴定能结合和增加或提高ACE2的表达的物质。因此，本发明提供了一种鉴 定能结合ACE2基因或蛋白的物质的方法，包含步骤(a)在允许形成复合物的条件下，将测试物质和ACE2基因或蛋白(优选固定化 的)进行反应，和(b)对复合物、游离的物质和非复合的基因或蛋白进行检测分析。任何检测蛋白_蛋白相互作用的检测系统或测试方法可被使用，包括共免疫沉 淀、交联和通过梯度或色谱柱共纯化。此外，X-射线结晶学研究可被用作评估物质和分子相 互作用的手段。例如，当以适合的形式结晶时，本发明复合物中的纯化的重组分子适于通过 X-射线结晶学检测分子内的相互作用。光谱学也可被用于检测相互作用和特别是，Q-TOF 装置可被使用。生物学样本和商业上可获得的文库可被用于ACE2结合肽的测试。另外， 抗ACE2的抗体可被用于分离其他具有ACE2结合亲和力的肽。例如，标记抗体可被用于探 查噬菌体展示文库或生物学样本。在这方面，肽可使用生物学表达系统而被开发。这些系 统的使用允许随机肽序列大文库的产生和对这些文库筛选结合特定蛋白的肽序列。文库可 通过将编码随机肽序列的合成DNA克隆入合适的表达载体中而被产生。(参见，Christian 等· 1992，J. Mol. Biol. 227 -Jll ；Devlin 等，1990 Science 249 404 ；Cwirla 等· 1990， Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 87 6378)。文库也可通过重叠肽的并行合成而被构建(参见，美国专利第4，708，871号)。在高血压、心脏或肾脏疾病动物 模型中测试激活剂。在一个实施方案中，本发明包括一种用于评估候选化合物是否能增加ACE2表达 或活性的检测法，其通过下列来实现在存在至少一种其激活表达或活性的能力需要被测 定的化合物的条件下，培养细胞(优选肾脏或心脏细胞)，其后监测细胞中ACE2表达水平和 /或活性的增加。增加的ACE2表达和/或活性表明该候选化合物可用于治疗心脏或/肾脏 疾病或高血压。可以在本领域公知的易于患心脏疾病或肾脏疾病的哺乳动物上进行相似的筛选 检测法。候选化合物被施用于哺乳动物和ACE2表达和/或活性被测量。增加的ACE2表达 和/或活性表明该候选化合物可用于治疗心脏或肾脏疾病。—种检测候选化合物是否增加ACE2活性(和用于治疗心血管疾病和/或肾脏疾 病和/或肺、和/或高血压)的方法也包括a)将(i)ACE2、ACE2的片段或前述任一的衍生物和(ii)ACE2的底物在存在候选化合物的条件下接触；和b)测定ACE2作用于底物的活性是否增加，从而指示该化合物增加了 ACE2的活性。 增加的ACE2活性表明该化合物可用于治疗列于本申请中的心脏疾病或肾脏或肺病或高血 压。ACE2活性增加的测定优选包括测定该化合物是否增加了 ACE2蛋白水解活性(增加的 底物水解)。在本发明的一个变体中，本发明的检测法受限于下列条件候选化合物不是卤 化钠盐或卤化钾盐，并且该检测法不测量增加的离子浓度对ACE2蛋白质水解的影响。ACE2 底物包括AngI，AngII, des-Ang，AngIIapelin-13，强啡肽13，β -酪啡肽和神经降压素。用于产生ACE2的方法描述于CA2，372，387。用于ACE2激活的体外检测法的实例显 示于Vickers等，通过人血管紧张素转变酶相关的羧肽酶水解生物肽，J Biol. Chem. 2002， 277(17) :14838。其他的检测法(以及上述检测法的变体)从本发明和那些描述于美国专 利第5，851，788，5，736，337和5，767，075号中的技术中是显而易见的，其全文在此一并引 入作为参考。敲除的哺乳动物ACE2小鼠的克隆和ACE2敲除小鼠的指导性实例描述于如下实施例中。术语“敲 除”指哺乳动物的单个细胞、被选择的细胞或所有细胞的ACE2基因编码的多肽的至少一部 分的表达被部分或完全减少。该哺乳动物可以是一种“杂合敲除”，其中内源基因的一个等 位基因被破坏但另一个等位基因仍然存在。ACE2位于X染色体上，因此雌性可以是杂合的。 在雄性中，只有一个等位基因，因此雄性是纯合的。可选择地，哺乳动物可以是一种“纯合敲 除”，其中内源基因的两个等位基因都被破坏。术语“敲除构建体”指核苷酸序列，其被设计成减少或抑制哺乳动物一个或多个细 胞中内源基因编码的多肽的表达。被用作敲除构建体的核苷酸序列通常由下列组成(1) 来自待抑制的内源基因某一部分(一或多个外显子序列、内含子序列和/或启动子序列) 的DNA;和(2)用于检测细胞中敲除构建体存在的标记序列。该敲除构建体被插入到含有 要被敲除的内源基因的细胞中。接着该敲除构建体能整合入一或两个内源ACE2基因的等 位基因中，和该ACE2敲除构建体的整合能阻止或打断全长内源ACE2基因的转录。一般借 助于同源重组，ACE2敲除构建体整合入细胞染色体DNA中(即，当该敲除构建体被插入到 该细胞中时，与内源ACE2 DNA序列同源或互补的ACE2敲除构建体区域可互相杂交；这些区 域接着被重组使得该敲除构建体被整合入内源DNA的相应位置)。典型地，该敲除构建体被插入到称为胚胎干细胞(ES细胞)的未分化的细胞中。ES 细胞通常源自胚胎或胚泡，该胚泡与其所要导入的发育胚胎属于相同物种，如下所讨论的。术语“基因的破坏”、“基因破坏”、“抑制表达”和“基因抑制”指ACE2核苷酸序列 敲除构建体插入到内源ACE2基因的编码区(通常含有一或多个外显子)和/或该基因的 启动子区的同源区中，以减少或阻止细胞中全长ACE2分子的表达。插入通常通过同源重组 来完成。作为实例，核苷酸序列敲除构建体可制备如下将包含抗生素抗性基因的核苷酸序 列插入到要被破坏的编码ACE2的分离的核苷酸序列的一部分中。当该敲除构建体接着被 插入到胚胎干细胞(“ES细胞”)中时，该构建体可整合入至少一个ACE2等位基因的基因 组DNA中。因而，至少在一些细胞中，许多细胞后代将不再表达ACE2，或以减少的水平和/ 或以截短的形式表达，因为ACE2内源编码区的至少一部分被抗生素抗性基因破坏。术语“标记序列”指一段核苷酸序列，其(1)被用作更大的用来破坏ACE2表达的核苷酸序列构建体(即，“敲除构建体”)的一部分；和(2)被用作鉴定那些已经整合ACE2 敲除构建体到染色体DNA中的细胞的手段。该标记序列可以是任何适合这些目的的序列， 尽管典型地其是一种编码蛋白的序列，该蛋白赋予细胞可检测的特性，如抗生素抗性基因 或在该细胞中天然不出现的可检测的酶。该标记序列也典型地含有调节其表达的同源或异 源启动子。包括在本发明的范围中的是这样一种哺乳动物，其中一或两个ACE2等位基因，及 一或两个其他基因的等位基因已经被敲除。这样的一种哺乳动物可产生如下重复于此提 出的用于产生ACE2敲除哺乳动物的方法但使用其他基因，或使两种哺乳动物互相杂交，一 种哺乳动物中一或两个ACE2等位基因被敲除，和另一种哺乳动物中一或两个第二基因的 等位基因被敲除，接着筛选那些具有双敲除基因型的后代(双杂合的或双纯合的敲除基因 型，或其变体)。可使用类似的技术制造其他敲除动物和细胞。药物组合物在一种药物组合物中，ACE2表达和活性的激活剂优选组合其他成分，如载体。这 些组合物可以可溶的形式被施用于动物，优选人，来预防或治疗心脏疾病、肾脏疾病或高血 压。心脏疾病包括慢性心力衰竭、左心室肥大、急性心力衰竭、心肌梗塞和心肌病。肾脏疾 病包括肾衰竭。ACE2激活剂可用于调节血压和动脉高血压。正常血压具有小于85mm Hg 的舒张压。高的正常血压具有85至89mm Hg之间的舒张血压。轻度高血压相应于90至 104mm Hg之间的舒张血压。中度高血压具有105至114mm Hg之间的舒张血压。重度高 血压具有高于115mm Hg的舒张血压。也通过收缩血压测定异常的血压(当舒张压低于 90mm Hg时)。正常血压具有小于140mm Hg的收缩血压。临界收缩期高血压显示了在140 至159mm Hg之间的收缩血压。单纯收缩期高血压具有高于160mm Hg的收缩血压(Cecil Essentials ofMeidcine,第三版,AndreoIi 等· W. B. Saunders Company (1993))。在大于 18 岁的成年人中如果在至少两次就诊中，两次或更多次血压测量值的平均值是90mm Hg或更 高的舒张压或140mm Hg收缩压，则被诊断为高血压。儿童和孕妇具有更低的血压，所以血 压超过120/80 (即，120mm Hg收缩血压/80mm Hg舒张血压)表示为高血压。通过不同的方法包括，但不限于局部给药、口服、气溶胶给药、气管内滴注、腹膜内 注射、和静脉内注射，药物组合物可被施用于人或动物。给药的剂量依赖于患者的需要、期 望的效果和选择的给药途径。使用体内递送载体如但不陷限于脂质体，多肽可被导入细胞 中。该药物组合物可通过已知用于药学上可接受的可被施用于患者的组合物的 制备方法而被制备，使得有效量的核酸分子或多肽与药学上可接受的载体混合为混合 物。适合的载体被描述于，例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Remington’ s PharmaceuticalSciences, Mack 出片反公司，Easton，Pa.，USA)。于此基础上，该药物组合物可包括活性化合物或物质，如核酸分子或多肽，其结合 有一或多种药学上可接受的载体或稀释剂，并包含于具有合适的PH的缓冲溶液中，用生理 溶液等渗。将活性分子与载体组合或将他们与稀释剂组合的方法对于本领域技术人员而言 是众所周知的。该组合物可包括用于递送活性化合物到组织内特定部位的靶向试剂。ACE2的异源性过表达
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表达载体可用于提供高水平的ACE2表达。用本发明的核酸分子转化的细胞培养 物可用作研究工具，特别是用于研究ACE2减少的状态。本发明包括载体，其选择性作用于 通常产生ACE2的心脏细胞和肾脏细胞，优选内皮细胞。本发明也包括包含这些载体的转 染细胞。适合于心脏和肾脏细胞的载体的实例被描述于，例如Rosengart等，美国专利第 6，322，536号；March等.美国专利第6，224，584号；Hammond等，美国专利第6，174，871号； ffolfgang-M. Franz等.通过含有心脏特异性启动子的重组腺病毒进行组织特异性基因递 送的分析。Cardiovascular Research 35(1997)560-566 ；Rothmann Τ.等，使用复制缺陷 型重组腺病毒表达心肌特异性基因。Gene Ther 19960ct ；3 (10) 919-26 ；Phillips MI等， Vigilant载体用于心脏保护的腺伴随病毒载体中的心脏特异性启动子。Hypertension 2002, Feb ；39 (2 Pt 2) :651_5 ；Herold BC等.作为模式载体系统用于肾病基因治疗的单纯 疱疹病毒。Kidney Int 2002 Jan ；61 Suppl 1 3-8 ；Figlin RA 等.技术评估白介素 _2 基因治疗用于治疗肾细胞癌。CurrOpin Mol Ther 1999 Apr ； 1 (2) 271-8 ；Varda-Bloom N等·定向于肿瘤血管发生的组织特异性基因治疗。Gene Ther 2001Jun ；8 (11) 819-27 ； Scott-Taylor TH等..腺病毒有助于亲嗜性逆转录病毒感染人细胞。Gene Ther 1998May ； 5(5) 621-9 ；Langer JC等.腺伴随病毒基因转移入肾脏细胞潜在地用于体内基因递送。 ExpNephrol 1998 May-Jun ； 6 (3) 189-94 ；Lien YH 等.肾病的基因治疗。Kidney Int Suppl 1997 Oct ；61 :S85_8 ；和Ohno K等.展示了蛋白A的IgG结合域的辛德比斯病毒载 体的细胞特异性靶向。NatBiotechnol 1997 Aug ； 15 (8) :763_7。根据本领域公知的众多技术，细胞培养物，优选心脏和肾脏细胞培养物和内皮细 胞培养物，可用于过表达和研究。例如，细胞系(永生化细胞培养物或原代细胞培养物)可 被含有ACE2核酸分子(或具有序列同一性的分子)的载体转染以测量该核酸分子的表达 水平及该核酸分子和多肽的活性。该细胞也可用于鉴定能结合并激活该多肽的化合物。测定ACE2活性和/或表达的诊断试剂盒ACE2表达或活性的测定也被用于i)心脏或肾脏疾病、肺病和/或高血压的诊断， )在疾病发作前鉴定处于该疾病发作风险中的患者，iii)测量患有心脏疾病如冠心病、 慢性心力衰竭或肾脏疾病和/或高血压和/或肺损伤的患者的治疗反应和iv)测量在处于 风险的这类患者中干预性疾病预防策略的成功率。本发明包括一种用于评估动物中ACE2 水平的方法，包含如下步骤(a)从动物标本制备心脏或肾脏或肺样本；(b)测试在该样本 中ACE2的存在；和(c)使样本中的ACE2水平或存在与动物中的疾病如心脏或肾脏或肺病 的存在(或风险)建立相关性。ACE2水平比正常低或者低的ACE2活性表明存在或处于疾 病的风险中。基于ACE2单核苷酸多态性的诊断试剂盒本发明也显示了减少的人ACE2表达产生自控制ACE2基因表达的多态性。大鼠中 的QTL作图显示了减少的ACE2表达水平与高血压和心血管和肾脏疾病100%相关。在ACE2 编码区中没有发现任何如下所述的多态性。所有如下所述的多态性都在ACE2编码区的上 游或下游。先前并不知道这些多态性或他们在心血管疾病、肾脏疾病、肺病和高血压中的角 色。一种特定的SNP单元型与增加的疾病风险相关。该单元型是一种用于评估疾病风险和 用于确定适合的医学治疗方法的重要诊断工具。多态性如下所示
SNP 名称 SNP 描述
ACE2a
rs879922
ACE2b
rs757066
ACE2c
rs714205
ACE2d
rs329442
ACE2e
rs233574
ACE2f
rsl978124
ACE2g
rsl514282
ACE2h
rsl514282
ACE2i
rsl514281
ACE2j
-2
C(C/G) T(C/T) C(C/G) C(A/C) C(C/T) C(C/T) A(A/G) A(A/G) A(A/G) A(A/G)
70 20 70 20
O O
UflM S Oooo yv @ O 15 15 th tea- ^ O O O O O O TTTRfE_"s6 1 7 5 8 9
亚洲人
白种人对照
100 100 50 90 100 100 100 30 100 50
70 70 80 90 60 50 rsl514281-2
A (A/G) 失败 100 70
A A A A A
C T C
A/C
C
C
ACE2k rsl514279
ACEIC (C/T) 80 100 80 C
2rsl514280
ACE2mC (C/T) 100 100 50 C
rs233575
描述于前述表格和图11中的控制ACE2基因表达的多态性的核苷酸数目可被本领 域技术人员容易地测定。该表格显示了表格中3种种群(非洲裔美国人、白种人、亚洲人)的每一种中发现 的对照碱基的百分数。例如，对于SNP rs233574,预期的SNP是C/T，对照峰为C。在这种情 况下，非洲裔美国人等位基因频率是80% C ；亚洲人等位基因频率是100% C(换句话说，单 态标记)；和白种人等位基因频率是60% C。本发明提供了多核苷酸探针，其可被用于测定动物基因型，即人是否对于一种或 其他多态性是纯合的，或是否对于这些多态性是杂合的，以及进一步推出人的表型。该表型 指示了在人细胞中ACE2表达的量。进一步地，本发明提供了在上述的基因型和表型测定
16中使用上述多核苷酸的方法。根据本领域公知的技术(例如，见美国专利第5，792，851和 5，851，788号)，本发明的该寡核苷酸可被用作探针来检测核酸分子。例如，通过使用洋地黄毒苷-11-脱氧尿苷三磷酸末端标记，本发明的多核苷酸可 被改造为探针。使用碱性磷酸酶缀合的多克隆绵羊抗洋地黄毒苷F (ab)片段和作为显色底 物的具有5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的氮蓝四唑，上述探针可被免疫检测。因而，根据本发明的一个方面，提供了选择性地杂交到ACE上游或下游序列的一 部分上的多核苷酸探针。探针可被设计为在严紧条件下杂交到一种ACE2多态性上而不杂 交到其它的多态性上以区分一种特定的多态性。本发明的多态性特异的多核苷酸杂交探针可包含，例如，基因组DNA或合成DNA。 上述的寡核苷酸探针可通过自动合成法被合成和优选含有约10-30个碱基，尽管在寡核苷 酸探针杂交分析领域可理解，8至约50个核苷酸也是有用的，其依赖于在探针中与靶序列 可能的错配所处的位置，探针上的标记可能干扰杂交的程度，和探针和靶序列的杂交进行 的物理条件(如，温度、PH、离子强度)。根据常规的方法，根据本发明的多核苷酸探针的设 计优选包含调节探针的长度以适合杂交条件(温度、离子强度、暴露时间)，同时保证多态 性特异性。根据本发明的另一方面，提供了一种用于基因分型的测试试剂盒，包含(a)用于扩增核酸的手段，该核酸包含ACE2 5’或3’区域的至少一部分，其中所述 部分包括相应于ACE2a-ACE2m之一的核苷酸；和(b)本发明的多核苷酸探针，用于区分ACE2多态性与其他多态性。本领域技术人员可容易地理解，“用于扩增的手段”依赖于要被使用的扩增方法。 因而，例如，如果通过PCR方法进行扩增，这些手段可以包括适合的引物，适合的DNA聚合 酶，和四种2' _脱氧核糖核苷三磷酸(dA，dC，dG，dT)。在其他的实施例中，如果该扩增通 过依赖于转录的方法如3SR法进行，该手段将包括两种引物(当形成双链时，其中的至少一 种将提供启动子)，能从该启动子转录的RNA聚合酶，在引物起始的DNA指导的和RNA指导 的DNA聚合反应中起作用的反转录酶(也可能参与RNA的RNAse H降解以将DNA链从RNA/ RNA杂交体中释放出来)，四种核糖核苷三磷酸(A，C，G和U)，和四种2’ -脱氧核糖核苷 三磷酸。在另一个实施例中，如果通过连接酶链反应进行扩增，该手段将包括两种寡核苷酸 (DNAs)和适合的DNA连接酶，其中如果靶标(在该靶标上所述两种寡核苷酸能以可连接的 方向互相邻接并与靶标杂交)存在，则该DNA连接酶将所述两种寡核苷酸连接。本发明的寡核苷酸探针优选被标记。该标记可以是任何本领域中可用于该探针的 各种标记，包括但不限于32P ；35S ；生物素(在其上可以复合信号发生部分，该信号发生部分 结合到或复合到抗生物素蛋白上)；荧光部分；酶如碱性磷酸酶(其能催化显色反应)；如 上所述的洋地黄毒苷；等。RFLP分析，电泳SSCP分析或测序分析也可用于检测ACE2多态性。根据本发明的另一个方面，这里也提供了一种在来自动物的ACE2核酸中对ACE2 多态性特异靶序列进行分型的方法，包含如下步骤，(a)通过对来自心脏或肾脏的DNA进行靶核酸扩增方法，获得可检测量的扩增的 核酸，该核酸具有ACE2的上游或下游区域的亚序列(或亚序列的互补链)，所述亚序列包括 其中ACE2多态性可能出现的核苷酸；和(b)分析(如，在使用根据本发明的多核苷酸探针的核酸探针杂交检测法中)获得
17自步骤(a)的扩增的核酸分子以测定多态性位点的碱基。在本发明的分型方法的一种应用中，所述方法被用于个体以测定该个体是否处于 发展心脏或肾脏疾病的风险中。患有冠心病和/或接着进行外科分流术的病人具有心脏组织缺氧。其也已知为心 脏抑顿(cardiac stunning)或心脏冬眠。这些患者显示了在心脏中很少的结构改变但具 有降低的心功能。在缺少结构改变的条件下具有改变的心功能是十分罕见的。在心脏抑顿 或缺氧的小鼠模型中，该动物具有非常类似于ACE2小鼠的表型。另外，我们已经证实了在 ACE2缺陷小鼠中缺氧标记被诱导。综合我们的数据证明了由于长期的缺氧这些小鼠具有降 低的心功能，因此它们是冠心病模型。因而，多态性和/或减少的ACE2表达或活性可被用 于诊断人类中的这种状态。另一个实施例是要测试在患有扩张性心肌病患者心脏中是否具 有这种机能和是否显示了该病症的结果与ACE2多态性相关。增加的ACE2表达和活性可被 用于治疗该症状。ACE2作为RAS负调节物的表征在3种高血压大鼠模型中ACE2定位于与高血压相关的QTL，且在所有这些高血压 大鼠品系中ACE2水平是减少的。在小鼠中，使用同源重组对ACE2的遗传失活导致了在组 织中增加的AngII肽水平，在心脏中缺氧基因的增量调节，和严重的心功能障碍。在ace2 缺陷背景上ACE表达的除去完全消除了 ace2单敲除小鼠的心力衰竭表型。这些数据提供 了用于RAS调节的新范例，并鉴定ACE2为控制心功能的RAS的负调节物。ACE2和血压控制大多数心血管疾病是既受遗传因素又受环境因素控制的多因子数量性状。对于心 血管疾病而言一个主要的因素是RAS。与广泛表达的ACE形成对比，近来鉴定的ACE2显示 了组织特异性的表达。通过与ACE竞争其AngI底物和/或通过切割AngII产生Angl_7， ACE2调节内源AngII水平。在本发明之前，没有人知道心血管系统中ACE2在体内的角色。 ACE2调节内源AngII水平。其也行使RAS负调节物的功能。在三种不同的自发性或饮食诱导的高血压和心血管疾病的大鼠品系中，ACE2定位 在X染色体上的确定的QTL中。在所有这些高血压易感的大鼠品系中，ACE2 mRNA和蛋白 水平是减量调节的。在Sabra大鼠的QTL分析中鉴定的SS-X基因座也被鉴定为一种对盐 负荷赋予抗性的基因座。在盐敏感品系中ACE2的减少和在抗性品系中其表达缺乏任何改 变显示了 ACE2对饮食诱导的血压改变赋予了抗性。作图定位和减少的表达显示了 ACE2是对X染色体上的高血压QTL起作用的基因。 而且，在ace2基因敲除小鼠中增加的AngI和AngII表达证实了 ACE2是一种RAS系统的体 内调节物。然而，在我们小鼠中ACE2的丢失并不导致血压任何直接的改变，即使当ACE功 能被阻断时。血压改变仅仅发生在当深度心脏机能障碍存在于年长的雄性小鼠中时。对高 血压起作用的遗传因素自身不改变血压。反而，这些QTL定义了血压的单一决定因素，其与 其他的遗传多态性一样促进了血压的改变。我们鉴定了人群中ACE2多态性和高血压之间 的关系。重要地是，我们的数据显示了 ACE2作为一种增加的血压的负调节物的功能。ACE2和心功能的控制出乎意料地，小鼠中ACE2的丢失导致了深度收缩性机能障碍，引起在年长的小鼠 中全身血压的剧烈减少。重要地是，通过破坏ACE，该心脏机能障碍完全地逆转了，暗示在缺乏ACE2的条件下ACE的催化产物引发了收缩损伤。因为这些收缩损伤能发生在缺乏肥大 或任何可检测到的血压改变的条件下，我们的数据也提供了遗传学证据，即RAS调节的心 脏疾病表型能在遗传学上与其对血压和心脏肥大的作用分开。ACE抑制剂和AngII受体阻断剂已被证实在人心力衰竭中具有一种心脏保护的作 用，因此暗示了 AngII与心脏疾病相关。在我们的ace/ace〗双突变小鼠中心脏机能障碍的 完全消失证明了 RAS直接控制心功能和ACE2是一种关键的抗RAS和心力衰竭的负调节物。 我们的遗传拯救实验强烈地显示，事实上是ACE的产物导致心力衰竭，即，在ace2基因敲除 小鼠的心脏中看到的AngII的增加是导致心脏机能障碍的原因。AngII受体的药理学抑制 作用是否拯救了 ace2突变小鼠的心脏表型则需要被测定。令人感兴趣地是，我们在苍蝇中 的结果显示了与ACE同系物ACER相关的P-因子突变导致了心脏形态发生的严重和致命的 缺陷(数据未显示)，表明在心脏中ACE/ACE2的功能在进化中是保守的。ace2突变心脏中的缺陷其特征为严重的收缩性机能障碍，组织缺氧调节的基因 的增量调节(在年长的小鼠中只具有轻微的重构)，没有肥大和没有肌细胞损失的证据。 ace2突变小鼠中衰竭心脏的这些表型和分子参数不同于肥大和扩张性心肌病。更引起兴 趣的是，ace2突变心脏类似于在人冠心病病例中和在外科分流术情况下发现的心脏抑顿和 冬眠。在这些心脏抑顿/冬眠的人类疾病和动物模型中，慢性缺氧状况导致了肌细胞新陈 代谢中补偿性的改变，缺氧诱导基因的增量调节，和心功能的降低。因为在血管内皮细胞中 ACE2被表达，和在心肌细胞中不表达，所以很可能ACE2的作用被限制在脉管系统中。例如， AngII的局部增加能导致血管收缩，产生血流灌注不足和缺氧。通过诱导氧化应激，AngII 也被证实能导致内皮机能障碍。ACE2的损失能导致缺氧诱导基因的增量调节的机制需要被 测定。重要地是，我们的数据表明了 ACE2多态性导致人冠心病的病理学。实施例在3种高血压大鼠品系中ACE2定位于X染色体上的QTL在自然界中高血压和许多心血管疾病是多因子的且疾病发病机理受多个遗传易 感性位点的影响。在不同的重组大鼠模型中，高血压的多个QTL已被鉴定。因为在人类中 ACE2定位于X染色体及在一些高血压大鼠模型中QTL已定位于X染色体，并且其至今没有 候选基因，所以ACE2应该是该QTL的一个候选基因。为便于大鼠ACE2的染色体定位，通过 筛选大鼠肾脏cDNA文库克隆了全长的大鼠ACE2 cDNA。大鼠ACE2与人ACE2高度同源，且 与人和小鼠ACE具有32%同一性和42%相似性(图la)。类似于人ACE2，大鼠基因由带有 保守的锌结合位点的单ACE结构域，信号肽和跨膜结构域构成(图lb)。类似于人，小鼠和 大鼠中ACE2主要表达于肾脏和心脏中，在肺和肝脏中弱表达(图Ic)。放射杂交图谱显示了大鼠ACE2基因定位于X染色体上，与标记DXRat9，DXWox 14， DXffox 15和DXRat42具有显著的LOD分值，将ace2置于DXRat9和DXRat42之间(图Id)。 比较图谱显示了 ace2图谱位置与在Sabra盐敏感性大鼠中对高血压鉴定的QTL间隔区交 迭，该间隔区发现位于标记DXMghl2和DXRat8 (SS-X)之间。此外，染色体的ace2区域定位 于中风易感性自发性高血压大鼠(SHRSP)中定义的BP3QTL间隔区，和通过同类系分析先前 鉴定于自发性高血压大鼠(SHR)的X染色体上的高血压BB. Xs QTL(图Id)。因而，在3种 独立的自发性和饮食诱导的高血压模型中，ACE2定位于大鼠X染色体上的QTL。在高血压 大鼠中ACE2表达的减量调节
因为肾脏是血压调节的一个主要场所，所以测定了这3种高血压大鼠品系的肾脏 中的ACE2的表达水平。最初，测量了盐敏感型Sabra高血压(SBH/y)大鼠和对照的抗盐型 Sabra正常血压(SBN/y)大鼠肾脏中ACE2的mRNA水平。在血压正常的SBN/y大鼠中，盐负 荷(D0CA盐)不影响ACE2 mRNA的表达。令人兴趣地，在SBH/y大鼠中，盐负荷和高血压的 发展与和血压正常的SBN/y大鼠相比的ACE2mRNA表达明显减少相关(图2a)。注意的是， 当与喂以常规饮食的SBN/y对照相比时，喂以常规饮食的SBH/y的ACE2 mRNA也更低。后 一发现与在喂以常规饮食的SBH/y和SBN/y大鼠之间观察到的10-20mmHg血压差异是一致 的。为测量ACE2蛋白水平，产生了一种ACE2(小鼠ACE2的aa206_aa225)特异性兔抗 血清，其和大鼠及人ACE2都有交叉反应(未显示)。与减少的ACE2 mRNA表达相一致，在 正常饮食喂养的SBH/y动物中ACE2蛋白表达也明显地减少(图.2b)。在4周的DOCA-盐 的饮食后，SBH/y大鼠血压的增加与ACE2蛋白水平的进一步减少相关(图.2b)。在抗盐型 SBN/y对照大鼠中，盐负荷不引发血压增加也不改变ACE2表达(图.2b)。与他们的WKY对 照相比，自发性高血压SHRSP和SHR动物肾脏中ACE2蛋白水平也明显地减少了(图.2b)。 此外，在高血压SHRSP和SHR大鼠中ACE2 mRNA的水平明显地减少(未显示)。在高血压 大鼠品系中ACE2编码区的克隆和测序没有显示任何序列改变，表明减少的ACE2表达很可 能是由控制ACE2基因表达的多态性导致的。在3个不同的大鼠品系中图谱位置和减少的 ACE2表达表明了，ace2是X染色体上的高血压QTL的强候选基因。此外，在所有3种高血 压大鼠品系中减少的ACE2表达暗示了该酶行使负调节物的功能。克隆小鼠ACE2和ACE2 敲除小鼠的产生为证实ACE2作为QTL候选物的资格和为测试在心血管生理学和心血管疾病的发 病机理中ACE2是否真正是一种必需的角色，克隆了小鼠ACE2基因(图.Ia)。类似于大鼠 和人ACE2，鼠ACE2也定位于X染色体(未显示)，含有单ACE-结构域(图.Ib)，和主要表 达于肾脏和心脏中(图.Ic)。感兴趣地是，在小鼠中两种ACE2的同种型在所有的阳性组织 中被观察到。在COS细胞中鼠ACE2过表达显示了 ACE2切割AngI形成Angl_9 (未显示)， 表明鼠ACE2与人ACE2具有同样的生物化学特异性。为测定ACE2的体内角色，在小鼠中 ace2基因被破坏，即用新霉素抗性基因取代了外显子9，有效地删除了锌结合催化结构域 (参见方法部分和图.3a)。两种在ace2基因座突变的ES细胞系被用于产生嵌合小鼠，其 与C57BL/6回交以获得种系转移(germtransmission)。这两种小鼠品系显示了相同的表 型。通过DNA印迹分析证实了 ace2突变的转移(图.3b)。通过在RNA印迹(未显示)和 蛋白质印迹分析(图.3c)中ace2 mRNA转录产物和蛋白质的缺失，证实了 ace2基因的完 全突变。ace2突变小鼠中，肾脏和心脏的ACEmRNA表达没有改变(图3d)。因为ACE2基因定位于X染色体，所有的雄性后代不是完全敲除突变型(acd—")就 是ACE2野生型(ace2Vy)，而就ace2突变而言，雌性不是野生型(aCe2v+)、杂合子(aCe2+勺 就是纯合子(ace2+)。应注意的是在所有下述试验中，ace2v_雌性的表现类似于aCe2v+雌 性和ace2+"雄性，表明了 ace2杂合性没有产生明显的作用。ACE2无效敲除小鼠以预期的 孟德尔比率出生，看起来健康，并在所有被分析的器官中不显示任何可检测到的总的改变。 此外，与ace+雄性小鼠(其显示了明显减少的生育力)相反，雄性和雌性ace2完全敲除 小鼠都是能育的。
ace2突变小鼠的血压先前已经证实了 ace2突变小鼠显示减少的血压和肾脏病变。因此，首先测试ACE2 表达的损失是否影响血压稳态和/或肾脏发育或功能。引起兴趣的是，与他们的对照同窝 小鼠相比，在3个月大小的acd*雄性(图.4a)或ace2+雌性小鼠(未显示)中ACE2 的损失不导致血压的改变。由于可能是ACE能补偿ACE2的损失，我们用能阻断ACE但不阻 断ACE2功能的卡托普利处理了 ace2缺陷型小鼠。然而，用卡托普利体内抑制ACE减少了 ace*雄性小鼠的血压，其减少的程度与在卡托普利处理的野生型同窝小鼠中观察到的程 度相似(图.4a)。因而，即使在ACE抑制的情况下，在此定义的小鼠背景中ACE2的损失没 有明显地直接影响血压稳态。基于我们的RAS QTL数据，我们将我们的突变小鼠和其他背 景小鼠回交，显示了 ACE2在血压控制中的角色类似于在人类中的遗传背景。ace2突变小鼠的受损的肾功能因为ACE2在肾脏中高表达，我们研究了肾脏形态学和功能。所有的3个月大小和 6个月大小的acd—A雄性和ace2+雌性小鼠显示了正常的肾脏形态学，并且在任何的肾脏 超微结构中没有明显的改变(图4b)。通过使用连续切片形态测定法也证实了正常的细胞 结构和导管系统和肾小球的肾脏结构。使用光学(PAS-染色)和电子显微镜(TEM)检测了来自3和12月大小的ace2缺 陷型小鼠和年龄相一致的同窝对照小鼠的肾脏。在双盲方式(blinded manner)对每一个 肾小球硬化症的严重程度从0至4+进行分级如下0代表没有病灶、1+代表< 25%的肾小 球硬化，而2+，3+，和4+分别代表25至50%，50至75%，和> 75%的肾小球硬化。在3个 月大小时，在来自ace2缺陷型小鼠的肾脏中没有明显的病理变化。然而在12个月大小时， 光学显微镜揭示了增加的肾小球硬化/损伤1.45士0.2对0. 25士0. 06 ;n = 6 ；ρ <0.01。 电子显微镜显示了在肾血管系膜中增加的胶原纤维的沉积及增厚的基底膜。慢性接触提高 的AngII水平引发了 ace2缺陷型小鼠肾脏中的缺氧和氧化应激。蛋白质印迹分析揭示了 ace2缺陷型小鼠肾脏中增加的缺氧诱导因子-Ia (HIFl-α)和血管内皮生长因子(VEGF) 的表达。脂质过氧化反应产物的测定显示了在6个月大小的ace2缺陷型小鼠中氧化应激 程度的增加己醛(1001 士 161 对 115士 13nmol/g ；η = 5 ;p < 0.01)和丙二醛(48士6. 4 对 24. 3 士 2. 8nmol/g ；η = 5 ;p < 0. 01)。这些结果证明了 ACE2的损失导致了以组织特异性方式增强的血管紧张素II信号 传导，最终在ace2缺陷型小鼠肾脏中介导了有害效应。减少的ACE2表达在肾病中扮演了 一个重要的病理学角色。ACE2的损失导致心功能严重缺陷ACE或AngII受体的药理学抑制暗示了 RAS在心功能和心脏肥大的调节中的角 色。然而，ace完全敲除小鼠或血管紧张素原完全敲除小鼠都不发展明显的心脏疾病。因 为ACE2在心脏血管系统的高度表达，所以分析了 ace2缺陷型小鼠的心脏。ace2突变小鼠 的心脏显示了左心室壁轻微变薄及增加的室维度(图5a)。在ace2缺陷型心脏中左心室 前壁(AW)变薄和左心室舒张末期维度(LVEDD)的增加也可通过超声心动描记术观察(表 1)。这些结构的改变主要在6个月大小的雄性小鼠中观察到。然而，在年龄匹配的3个月 大小(未显示)和6个月大小的acd^和ace2+Ar小鼠之间心脏/身体重量比值是相当的 (图5a，b)。超声心动描记术也显示了左心室质量(LVM)和LVM/身体重量比值是正常的
21(表1)。没有观察到扩张性心肌病的特性性结构和生物化学改变，因为没有间质性心脏纤 维化的迹象(图5c，d)，在ANF，BNP, a-MHC, b-MHC,和骨骼肌肌动蛋白基因表达中也没有原 型改变(未显示)。另外，ACE2无效敲除小鼠个体心肌细胞没有显示肥大的证据，并且当通 过TUNEL染色检测(未显示)时我们在ACE2无效敲除小鼠中没有观察到任何心肌细胞凋 亡改变的证据。因此，尽管在6个月大小的ACE2无效敲除小鼠中心脏轻微地扩张，但是没 有心脏肥大或扩张性心肌病的证据。有趣地是，通过超声心动描记术评估心功能揭示了所有的acd—"雄性和 ace2+雌性小鼠(通过减少的分数缩短(FS)和减少的纤维鞘收缩速度(表1和图6a，b)来 确定)显示了严重的收缩性心力衰竭。与年龄匹配的3个月大小的小鼠相比，在6个月大小 的雄性和雌性小鼠中发现功能减少更剧烈，暗示了表型的进展(表1)。与减少的心脏 收缩 性一致的是，6个月大小的acd—A小鼠显示了降低的血压(图6c)，在年龄匹配的ace2+雌 性和3个月大小的雄性中没有发现该特征，暗示了血压的降低可能是严重的心脏机能障碍 所致，而不是ACE2损失对全身血压的直接效果。这些令人惊奇的结果表明ACE2是一种关 键的心脏收缩的负调节物。为确证在心功能中超声心动图缺陷，在ace2无效敲除小鼠中进行侵入性血液动 力学测定。重要地是，侵入性血液动力学测定显示了在ace2突变小鼠中dP/dT-max和dP/ dT-min都明显地减少(表2)，表明了心脏收缩功能的严重损伤。ACE2的损失也导致了主动 脉压和心室压的明显减少，与所观察到的心脏收缩性减少是一致的(表2)。引人注目地，该 数据证实了 ace2突变小鼠的心脏收缩性的缺陷发生在不存在任何明显的心脏肥大的条件 下，并且可以与血压改变在遗传学上分离。在ace2无效敲除的小鼠中缺氧诱导基因的增量调节ace2无效敲除小鼠中在不存在肥大或心脏纤维化下的严重的收缩机能障碍和轻 微扩张类似于在人和动物模型中的心脏抑顿/冬眠。心脏抑顿和冬眠是对慢性缺氧如冠心 病或其后的外科分流术的适应性反应。因为ACE2在血管内皮细胞中高表达，但收缩性是通 过心肌细胞控制，所以推测ACE2的损失能导致心脏缺氧。因此通过RNA印迹分析了缺氧诱 导基因如BNIP325和PAI-I的表达水平的变化。与他们的野生型同窝鼠相比，在所有被分析 的ace2无效敲除小鼠的心脏中BNIP3和PAI-I的mRNA表达明显地被增量调节(图7a)。 因此，ACE2的损失产生了缺氧调节基因表达模式的诱导。ace2无效敲除小鼠的组织中增加的血管紧张素II水平由于ACE2具有羧肽酶的功能，从AngI上切割下单个残基产生Angl_9，和从AngII 上切割下单个残基产生Angl-7，因此假设ACE2通过与ACE竞争底物AngI和/或切割并失 活Angll，而作为一种RAS的负调节物。如果该假设是正确的，则ACE2的损失可增加体内 AngII水平。使用放射性免疫测定法，在ace2突变小鼠肾脏和心脏中确实发现AngII水平 明显地增加(图7b)。此外，也观察到了 AngI的增加(图7b)，这与AngI在体内是ACE2作 用的底物相一致。与对照相比在ace2突变小鼠的心脏和肾脏中ACE mRNA水平没有发现有 差异，表明了增加的AngII组织水平并不是由于ACE表达的增加(图3d)。这些数据表明了 ACE2作为一种RAS的负调节物并控制AngII的内源性水平。在ace2-缺陷型小鼠中除去ACE表达拯救了心力衰竭如果ace2突变小鼠心脏中的表型是由于AngII水平的增加，那么在遗传学上除去ACE并破坏ACE2可能减少AngII水平并拯救在ACE2突变小鼠中观察到的表型。为检验这 种观点，产生aCe/aCe2双突变小鼠。这些双突变小鼠以预期的孟德尔比率出生，并看起来 健康。在该aCe-aCe2无效双敲除小鼠中血压(图8)和肾脏缺陷(未显示)类似于ace单 突变小鼠。ace-ace〗双突变小鼠的生育力没有被论述。因此，除在ace单突变小鼠中看到 疾病的外，ACE和ACE2的损失也不能导致任何明显的其它疾病。
因为先前没有报道ACE敲除小鼠的心功能，因此在这些小鼠中的心脏参数首次被 分析。在ace+小鼠中，心脏在组织学上是正常的(未显示)，在6个月年龄时没有可被检 测到的心功能缺陷(图8b，c)。重要地是，ace2突变背景中ACE表达的除去完全地消除了 ace2单敲除小鼠的心力衰竭表型(图8b，C)。此外，使用超声心动描记术，6个月大小的， 年龄匹配的ace-ace〗双突变小鼠与他们的ace单突变和野生型同窝鼠的所有心功能(表 1)都是相当的。雄性和雌性ace-ace2双突变小鼠中都出现心功能的恢复。这些遗传学的 数据显示了 ACE表达是必需的，在不存在ACE2的情况下是引发收缩性心力衰竭必需的。重 要地是，在ace和aCe/aCe2敲除小鼠之间血压也没有差异(图8a)，进一步暗示了在年长的 雄性ace2小鼠中降低的血压是由于心功能的急剧降低。ACE2对肺损伤的负控制 成人呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种严重的急性肺损伤，以及即使进行精心护理， 仍具有40-70%的死亡率。创伤、严重的脓毒症(全身性感染)、弥漫型肺炎和休克是引发 ARDS的最主要原因，在他们中酸诱导的肺损伤是最普遍的原因之一。导致酸吸入相关的肺 损伤的潜在机理包括HCl诱导的对肺泡-毛细血管膜的损伤，和多形核中性粒细胞(PMN) 粘附、激活和隔离，它们导致了肺水肿和气体交换的衰退。ARDS的疗法包括机械通气和沉淀 性疾病或损伤的持续疗法。使用新药(保护肺免受进一步的肺泡-毛细血管膜损伤)的支 持性疗法将保留ARDS病人的肺功能以便治疗该沉淀性疾病或损伤，使得ARDS的死亡率降 低。因为ACE2在肺中表达，我们评估了在急性肺损伤中ACE2的损失是否扮演某种角 色。图9显示了在HCl处理和对照小鼠中3小时后肺弹性(EL)的变化。施用HCl后，野生 型小鼠存活超过4个小时，而ACE2敲除小鼠在2-3小时内死亡。ACE2敲除小鼠显示了比野 生型小鼠明显更严重的肺弹性响应，反映了生存率的不同。因此，ACE2在保护肺免受急性 酸诱导损伤中扮演了一个重要角色。因此，增强ACE2功能和/或表达是一种用于治疗ARDS 和肺病的新的和出乎意料的目标。方法克隆小鼠和大鼠ACE2及染饩体QTL定位。鼠ACE2被克隆自一个非免费的EST数 据库。使用小鼠ACE2探针，我们筛选大鼠肾脏cDNAdnvitrogen)以获得全长的大鼠cDNA， 其通过DNA序列分析而确定。为进行染色体定位，大鼠ACE2 cDNA特异性探针被用于筛选 大鼠PAC文库(RPCI-31，Research Genetics)，鉴定出两种阳性克隆(6M6和125K9)。测定 这些克隆的末端序列并设计大鼠特异性引物(mc2L :5，-TCAATTTACTGCTGAGGGGG-3’，mc2R 5，-GAGGGATAACCCAGTGCAAA-3，)，通过筛选放射性杂交组(RH07. 5，Research Genetics)以 确定大鼠中ACE2的染色体图谱位置。SHR和对照WKY大鼠获得自Harlan，并根据研究所 的指导方针饲养在Ontario癌症研究所动物实验室中。SHRSP大鼠组织是由德国Detlev Ganten博士友情提供的。繁殖抗盐型和盐敏感型Sabra大鼠并饲养在以色列Ben-GurionUniversity Barzilai Medical Center的动物实验室中。Doca-盐处理如前所述。表汰分析。使用tri-reagent制备大鼠肾脏总RNA。20毫克RNA在0. 8%甲酰胺凝 胶上进行分析。转印到尼龙膜(Amer sham)，并用部分大鼠ACE2 cDNA克隆进行探查(9_1)。 β-肌动蛋白探针和MultipleTissure Northern Blots购自Clontech。为进行蛋白质印 迹分析，肾脏被勻浆于补充有“Complete”蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和lmMNa3V04的裂 解缓冲液(50mM Tris-HCl, pH 7. 4,20mM EDTA，和 triton-X 100)中。通过 SDS-PAGE 于8% tris-甘氨酸凝胶中分 析100毫克蛋白质。ACE2免疫血清获得自用小鼠特异性ACE2 肽DYEAEGADGYNYNRNQLIED免疫的兔中。血清通过使用sulpho_link试剂盒(Pierce)用所 述免疫肽亲和纯化。商业上可获得的β-肌动蛋白抗体被用作为上样对照(Santa Cruz) 0ACE2 突变小鼠的产牛。使用 pKO Scrambler NTKV-1907 载体(Stratagene)构建 靶向载体(短臂559个碱基对，长臂8. 1千个碱基对)。用新霉素抗性盒以反义方向置换含 有核苷酸+1069至+1299的ace2基因组DNA部分。该靶向构建体被电穿孔入E14K ES细 胞，并通过杂交有5，和3，侧翼探针的EcoRI消化的基因组DNA的DNA印迹进行阳性同源 重组ES克隆的筛选。两种独立的ace* ES细胞株被注射到C57BL/6起源的胚泡中以产生 嵌合小鼠，其与C57BL/6小鼠回交。两种ES细胞株进行独立的种系遗传。在该手稿中报道 的数据在两种突变小鼠系之间是一致的。通过RT-PCR、RNA印迹和蛋白质印迹分析证实了 ACE2表达的消除。只有同窝出生鼠被用于所有的试验中。所有组织的组织学、细胞凋亡分 析、血清学和肾脏形态测量学按所描述的进行31。完全ACE突变小鼠已在先前被描述8，并 获得自Jackson实验室。根据研究所的指导方针，小鼠饲养在Ontario Cancer Institute 动物实验室中。心脏形态测定法，超声心动描记术，血液动力学和血压测量方法。为进行心脏形态 测定法，心脏用10%缓冲的福尔马林在60mmHg下灌注并随后埋入石蜡中。通过使用了减色 电脑辅助图象分析定量形态测定法测定心肌间质性纤维化，其中使用了 Image Processing Tool Kit2. 5版和Photoshop 6. 0软件。Picro-Sirius红染色切片被用于计算间质纤维 化，以阳性PSR染色的面积与完整视野的比值表示。按照描述的方法32，使用野生型和突变 同窝出生鼠进行超声心动描记术评估。小鼠用异氟烷/氧气进行麻醉，并通过使用装备有 15MHz线性传感器的ACUSOn Sequoia C256的经胸壁超声心动描记术进行检查。FS被 计算如下FS = [(EDD-ESD)/EDD]*100。Vcfc被计算为对心率经过校正的FS/射血时间。 血液动力学测量描述如下。简单地说，小鼠被麻醉，右侧颈动脉被分离并插入连接到放大器 (TCP-500, Millar Inc.)的 1· 4 French Millar 导管(Millar Inc.，Houston)。在导管插 入到颈动脉后，导管被推进到主动脉中并接着推进到左心室中以记录主动脉压和心室压。 测量和分析的参数是心率、主动脉压、左心室(LV)收缩压、LV舒张压和LV压一次导数的最 大值和最小值(分别是+dP/dtmax 和 dP/dtmax)。使用了 Visitech Systems (Apex,NC)制 造的Visitech BP-2000血压分析系统进行尾套血压测量。为进行卡托普利处理，在血压测 量前饮用水被添加有400mg/L卡托普利(Sigma)达两周。组织血管紧张素肽水平。心脏和肾脏在冰上于含有如前所沭的肽酶抑制剂包括苯 甲基磺酰氟(PMSF，100 μ Μ)的80%乙醇/0. IN HCl中被均浆化。蛋白勻浆在30，OOOg下 离心20分钟，轻轻倒出上清液，并用1% (ν/ν)七氟丁酸(HFBA, Pierce, Rockford，IL)酸 化。在Savant真空离心机(Savant，Farmingdale，NY)中该上清液被浓缩到5ml，且浓缩的抽提物被加到活化的S印-Paks上，用O. 1 % HFBA洗涤，并用5ml 80%甲醇/0. 1 % HFBA洗 脱。进行了来自心脏和肾脏组织的抽提物中血管紧张素肽内容物的放射性免疫测定分析。 AngII和AngIRIAS的检测限度分别是0. 5fmol/管和AngI 5fmol/管。 急件肺损伤樽型。ACE2敲除小鼠和他们的同窝出牛小鼠(8-12周大)被用于本研 究中。在吸入刺激前1分钟，进行两口深吸气(3倍潮气体积)以使体积史标准化，并进行 测量以作为基线。在麻醉和机械通气小鼠气管内注入2mL/kg HCl(pH= 1.5)，接着推注空 气。在对照组中，小鼠注射生理盐水或不进行注射。在所有组中，测量以30分钟间隔进行 持续3小时。为评估生理性肺损伤，通过测量气管峰值压力、流量和体积来评估肺弹性(EL ； 肺顺应性的倒数)。通过将气管峰值压力除以体积计算EL。EL的改变反映了肺薄壁组织的 改变和肺硬化。本发明已被详细描述并结合参考文献描述了优选的实施方案；然而，本领域普通 技术人员可以理解可进行不背离本发明精神和范围的改变。例如，当本申请涉及蛋白质时， 很清楚肽和多肽通常也可被使用。同样地，在描述基因时，很清楚核酸分子或基因片段通常 也可被使用。所有的出版物(包括Genbank条目)，专利和专利申请都以其整体引入作为参考， 如同每一个独立的出版物，专利或专利申请被明确地和单独地指出全文引入作为参考一样。参考文献Yusuf, S.，Reddy, S.，Ounpuu, S.，Mnand, S.心血管疾病的全球负担，第 1 卷 总则，流行病学过渡，危险因素，和城市化的影响。Global burden of cardiovascular diseases Part I General consi derations, the epidemiologic transition, risk factors, and impact of urbanization. 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权利要求
一种治疗ACE2减少状态的方法，包含给具有该状态的哺乳动物施用治疗有效量的ACE2激动剂。
2.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
3.权利要求1或2的方法，其中减少的ACE2状态与选自高血压、充血性心力衰竭、慢性 心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、动脉粥样硬化和肾衰竭及肺疾病的病症相关。
4.一种ACE2减少状态的基因治疗方法，包含递送有效量的转基因编码区到器官。
5.根据权利要求4的方法，其中受影响的器官是心脏或肾脏或肺或血管。
6.权利要求4或5的方法，其中ACE2转基因以基因治疗载体的形式被施用于患者。
7.权利要求6的方法，其中基因治疗载体包含病毒载体。
8.权利要求4-7任一项的方法，其中患者是人。
9.权利要求4-8任一项的方法，其中ACE2减少状态与选自高血压、充血性心力衰竭、慢 性心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、动脉粥样硬化和肾衰竭及肺疾病的病症相关。
10.一种包含ACE2基因的非人哺乳动物，其中该基因的一个等位基因已经被破坏。
11.一种包含编码ACE2的基因的非人哺乳动物，其中该基因的两个等位基因都已经被 破坏。
12.一种包含破坏型ACE2突变的非人哺乳动物，其中破坏导致编码ACE2的基因的无效突变。
13.权利要求10到12任一项的非人哺乳动物，其是啮齿类动物。
14.权利要求13的非人哺乳动物，其是小鼠。
15.权利要求10到14的非人哺乳动物，其特征在于高血压或心收缩缺陷或肾缺陷或对 肺损伤增加的敏感性。
16.一种包含ACE2敲除构建体的核酸。
17.一种包含权利要求16的核酸的载体。
18.—种包含权利要求17的核酸的鼠胚胎干细胞系。
19.一种筛选调节高血压、心脏收缩及肾衰竭和肺损伤的化合物的方法，包含将化合物 引入权利要求11到14任一项的非人哺乳动物中，并测定血压和/或心脏收缩和/或肾功 能和/或肺感染的增加或减少。
20.一种筛选是ACE2活性的激动剂的化合物的方法，包含a.提供i)包含ACE2的纯化的制剂，ii)底物，和iii)测试化合物；b.在所述ACE2能作用于所述底物以产生产物的条件下混合所述ACE2和所述底物，其 中所述混合在存在和不存在所述测试化合物的条件下进行；和c.直接或间接测量在存在或不存在所述测试化合物的条件下产生的所述产物的量。
21.权利要求20的方法，其中所述底物是血管紧张素I或血管紧张素II。
22.权利要求20的方法，其中所述产物包含Angl-9或Angl-7。
23.根据权利要求20到22分离的化合物。
24.ACE2激活剂的作为药物的应用。
25.ACE2激动剂用于治疗心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病的应用。
26.ACE2激动剂用于制备治疗心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病的药物的应用。
27.哺乳动物中心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病的医学治疗方法，包含对需要治疗的哺乳动物施用有效量的ACE2激动剂。
28.权利要求27的方法，其中ACE2激动剂与ACE抑制剂共同施用。
29.一种分离的编码ACE2多肽的核酸分子，所述核酸分子包含ACE2核酸编码区上游或 下游的核苷酸多态性，其中相对于野生型ACE2，所述多态性减少了 ACE2的表达量。
30.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中所述多态性选自ACE2a-ACE2m中的至少一个。
31.一种检测动物中ACE2减少状态的方法，包括从所述动物获得DNA样本和在所述 DNA样本中鉴定权利要求29或30的核酸。
32.—种在动物中用于诊断ACE2减少状态为特征的疾病或疾病倾向的方法，包括在来 自所述动物的DNA样本中鉴定权利要求29或30的核酸。
33.根据权利要求31或32的方法，包括测定所述动物对于所述核苷酸多态性是纯合还 或杂合的。
34.权利要求31到33任一项的方法，其中所述ACE2减少状态与选自高血压、充血性心 力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、动脉粥样硬化和肾衰竭的心血管疾病或 肾脏疾病或肺疾病相关。
35.一种多核苷酸，包含特异性结合(i)ACE2核酸编码区的上游或下游区域的序列，其 中所述区域紧接减少ACE2表达的核苷酸多态性。
36.权利要求35的多核苷酸，包含8至10，8至15，8至20，8至25，25，25至50，50至 75，50 至 100，100 至 200，200 至 500 或 500 至 1000 个核苷酸。
37.权利要求35或36的多核苷酸，其中所述核酸在高度严紧杂交条件下特异性结合紧 接 ACE2a-ACE2m 之一的。
38.权利要求37的多核苷酸，其中所述严紧杂交条件包含0.1XSSC，0. SDS，在 65 "C。
39.权利要求35的多核苷酸，包含与ACE2多态性互补的序列。
40.权利要求39的多核苷酸，包含选自下面的序列a.紧接核苷酸多态性的ACE2上游或下游区域的8-50个核苷酸，其中所述序列包括 ACE2a-ACE2m之一并包含图11中所示序列之一的全部或部分b.与(a)中所述的序列互补的序列；和c.与(a)或(b)中的序列具有至少70%序列一致性的序列，其中所述具有一致性的序 列在高度严紧杂交条件下能和ACE2杂交。
41.权利要求35的多核苷酸，其中所述核酸在杂交检测法中能作为探针。
42.权利要求41的多核苷酸，其中所述核酸序列被可检测地标记。
43.权利要求42的多核苷酸，其中所述可检测的标记包括a.荧光染料；和/或b.生物素化修饰；和/或c.放射性标记。
44.一种ACE2基因分型试剂盒，包含用于检测来自动物的核酸样本中的ACE2多态性存 在的检测试剂。
45.权利要求44的试剂盒，其中所述检测试剂包含核酸和/或限制性内切酶。
46.权利要求44的试剂盒，进一步包含用于容纳所述检测试剂的生物样品容器。
47.权利要求44的试剂盒，进一步包含具有多孔的平板，该平板上结合有探针，所述探 针具有特异性结合包括ACE2多态性的ACE2序列的核酸序列。
48.权利要求44的试剂盒，进一步包含用于扩增所述核酸的扩增试剂。
49.权利要求48的试剂盒，其中所述扩增试剂扩增紧接选自ACE2a-ACE2m的ACE2单核 苷酸多态性的ACE2核苷酸区域。
50.权利要求48的试剂盒，其中所述扩增试剂包含引物组，其中每一引物是特异性结 合紧接ACE2a-ACE2m之一的位置的核酸，和/或使延伸穿过ACE2a-ACE2m之一的核酸。
51.权利要求144的试剂盒，用于检测动物患有或处于ACE2减少状态的疾病的风险中。
52.权利要求51的试剂盒，其中所述疾病包括心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病或影响 血管。
53.权利要求52的试剂盒，其中所述疾病选自高血压，充血性和扩张性慢性心力衰竭， 急性心力衰竭，心肌梗塞，冠心病，动脉粥样硬化，和肾衰竭及肺疾病。
54.一种对动物进行ACE2基因分型的方法，包括a.获得来自所述动物的ACE2核酸样本，该ACE2核酸样本包含ACE2编码区的上游和下 游区域；和b.检测包含ACE2单核苷酸多态性的ACE2核酸的区域。
55.权利要求54的方法，其中所述核苷酸多态性选择ACE2a-ACE2m。
56.权利要求55的方法，包括确定所述动物对于ACE2多态性是纯合的还或杂合的。
57.权利要求56的方法，其中所述动物是人，并且所述ACE2基因型被用于确定所述动 物是否患有ACE2减少状态的疾病或处于ACE2减少状态的疾病的风险中。
58.权利要求57的方法，其中所述疾病包含心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病或影响血管。
59.权利要求54的方法，其中通过扩增来自动物的核酸来获得所述核酸。
60.权利要求59的方法，其中通过用权利要求7到15任一项的多核苷酸的全部或部分 进行扩增来获得所述核酸。
61.权利要求54的方法，其中所述检测步骤包括确定ACE2核酸的核苷酸序列。
62.权利要求54的方法，其中所述检测步骤包括在高度严紧条件下使所述核酸和权利 要求7到15任一项的多核苷酸接触。
63.权利要求62的方法，其中所述多核苷酸选择地与紧接(i)包含不同于ACE2多态性 的单多态性的ACE2核酸区域的位置选择性杂交。
64.权利要求54的方法，其中所述检测步骤包括a.进行所述核酸的限制性内切酶消化，从而提供核酸消化物；和b.将消化物与所述多核苷酸接触。
65.权利要求64的方法，其中杂交发生在PCR扩增中或之后，并且通过“实时”PCR分 析或荧光测定分析进行所述分析。
66.权利要求64的方法，其中所述检测步骤包括核酸的大小分析。
全文摘要
本发明涉及用于预防和治疗心血管疾病、肾脏疾病、肺疾病和高血压的ACE2激活化合物。本发明也包括通过测量ACE2表达或核苷酸多态性分析诊断心血管疾病、肾脏疾病、肺疾病和高血压的方法。
文档编号A61P9/10GK101961493SQ201010165678
公开日2011年2月2日 申请日期2003年6月19日 优先权日2002年6月19日
发明者J·M·彭宁格尔, M·A·克拉科维尔 申请人:大学保健网