专利名称：人参皂甙Rg1在医疗保健品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及人参皂甙Rgl在制备预防和治疗甲醛对 机体的损伤的产品中的应用，以及在制备与氧化应激损伤相关的保健品中的应用。
背景技术：
硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)是一种普遍存在于原核生物和真核生物中的小 分子蛋白质，它与NAPDH和硫氧还蛋白还原酶组成细胞内主要的氧化还原系统。根据表达 部位的不同，硫氧还蛋白分为3类Trx-1、Trx-2和spTrx。到目前为止，人类疾病中有关 Trx的研究大都集中在Trx-1。Trx-1是生物体所必须的基因，如果选择性地敲除小鼠的 Trx-1基因，小鼠则早期胚胎致死，不能存活(Matsui M.，Oshima M.，Oshima H.，Takaku K. , Maruyama T. , Yodoi J. , andTaketo M. M. Early embryonic lethality caused by targeted disruption ofthe mouse thioredoxin gene. Dev. Biol. 1996,178 :179-185)。 Trx-1是细胞内一种有效的抗氧化剂，能保护细胞、减轻氧化应激所致的损伤。Trx-1能 抑制P38MAPK和凋亡信号调节激酶1相关的凋亡信号传导途径，增强细胞的抗凋亡能力 (Saito M. , Nishitoh, H. , Fujii, M. , Takeda, K. , Tobiume, K. , Sawada, Y. , Kawabata, M. , Miyazono, K. , and Ichijyo, H. Mammalian thioredoxin is adirect inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase(ASK)1. EMB0,1998,17 :2596_2606 ；Hashimoto S., Matsumoto K. , Gon Y. , Furuichi S. , MaruokaS. , Takeshita I. , Hirota K. , Yodoi J., and Horie T. Thioredoxin negativelyregulates p38 MAP kinase act ivation and IL-6 production by tumor necrosisfactor-alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999,258 443-447.)。同时，硫氧还蛋白在神经生长因子调节的信号传导和神经突起生长中起着重要作 用，是神经生长因子的一个重要候补要素(Bai J.，Nakamura H.，Kwon Y. ff.，Hattori I.， Yamaguchi Y. , Kim Y. C. , Kondo N. , Oka S. , Ueda S. , MasutaniH. , and Yodoi J. Critical roles of thioredoxin in nerve growthfactor-mediated signal transduction and neurite outgrowth in PC12 cells. J. Neurosci, 2003,23:503-509.)。与对照组小鼠相 比，硫氧还蛋白高表达小鼠的寿命增加了 30% (Mitsui A，Hamuro J,Nakamura H,Kondo N, Hirabayashi Y,Ishizaki—Koizumi S, Hirakawa T,Inoue T,Yodoi J. Overexpression of humanthioredoxin in transgenic mice controls oxidative stress and life span. Antioxid Redox Signal. 2002，(4) =693-6.) 0随着研究的深入，硫氧还蛋白在人类各种疾 病中的作用越来越受到人们的重视，并成为药物治疗的重要靶点。甲醛(HCH0)会强烈刺激眼睛、皮肤、呼吸道黏膜等，造成免疫功能异常、肝损伤及 神经毒害，会导致胎儿畸形、白血病、慢性呼吸道疾病、女性月经紊乱、急性精神抑郁症、鼻 咽癌等疾病。同时其也是导致心血管疾病的一个潜在危险因素。目前，人造板、家具、塑料 壁纸和涂料等大量使用的粘合剂的使用十分广泛，而一旦家装家具遇热、变潮，甲醛就会从 这些材料中挥发出来，损害人类的健康。寻找和研发增强机体抵抗甲醛损伤的医药保健用品显得越来越迫切。人参皂甙Rgl是一种存在于许多植物如人参中的已知化学单体，药理作用广泛， 如具有抗疲劳、抗衰老、降血脂、抗癌、提高机体免疫功能、清除自由基、抗炎、抗氧化等药理 作用。但是到目前为止，人参皂甙Rgl具有诱导细胞内硫氧还蛋白表达增加的作用，以及可 以预防和治疗甲醛对机体的损伤却未见报道。
发明内容
本发明旨在寻找硫氧还蛋白诱导物以用于防治甲醛对机体的损伤。本发明旨在提 供人参皂甙Rgl在医疗保健品中的应用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案人参皂甙Rgl在制备预防和治疗甲醛对机体的损伤的产品中的应用。人参皂甙Rgl在制备预防和治疗甲醛对机体的损伤的医疗保健品中的应用。人参皂甙Rgl在制备与氧化应激损伤相关的保健品中的应用。
图1是人参皂甙Rgl对PC12细胞中Trx-1含量的影响；图2是人参皂甙Rgl对甲醛(HCH0)诱导PC12细胞增殖降低的拮抗作用；图3是人参皂甙Rgl减弱甲醛(HCH0)引起的内质网应激；图4是人参皂甙Rgl减弱甲醛(HCH0)对caspase-12的激活作用。
具体实施例方式本发明通过下列实施方式证明了人参皂甙Rgl诱导硫氧还蛋白表达的增加并能 用于防治甲醛对细胞的损伤作用，但是本发明的内容不局限于此。实施例1 一、使用的试剂和仪器1.细胞PC12细胞大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，购自中国科学院昆明动物所。2.药品及主要试剂甲醛，购自成都市科龙化工试剂厂；人参皂甙Rgl，由昆明制药集团股份有 限公司提供；一抗Anti-mouse Trx由日本京都大学淀井溶司教授提供；一抗CHOP和 pro-caspasel2,购自 Santa 公司；Protein Marker,购自 Fermentas 公司；RPMIMedium 1640，购自 Invitrogen corporation ；蛋白质定量试剂盒,购自 R&D 公司；Chemiluminesent substrate，购自生物晶美公司；PVDF膜，购自Millipore公司；TRIS Base，购自N0V0N公 司；Acrylamide,购自 Solarbio 公司；十二烧基硫酸钠，购自 xiamen sanland chemicals company limited；Aprotimin、 PMSF 禾口 NP-40,均购自 Sanland-chem International InC ；TEMED,购自HUALVYUANB10TECHN0L0GY ；X射线胶片，购自中国乐凯胶片集团公司； 二 抗 affinitypurified antibody peroxidase labled goat anti-mouse lgG(H+L) HSA liquidconjugate 禾口 affinity purified antibody peroxidase labled goat anti-rabbitlgG(H+L)HSA liquid conjugate,购自美国 Kirkegaard & laboratories。四噻唑蓝(MTT)，购自美国Promega公司。3.主要实验仪器BHC-1300II A/B3生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司生产；TDL-40B台式离 心机，上海安亭科学仪器厂生产；TS-1脱色摇床，金纭市杰瑞尔电器有限公司生产；电子分 析天平，北京塞多利斯仪器系统有限公司生产；旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有 限公司生产；BYY-6C双稳定时电泳仪，北京六一仪器有限公司生产；TS100生物倒置相差 显微镜，日本NIKON公司生产；DYCP-31D水平电泳槽，北京六一仪器有限公司生产；C02培 养箱，美国NBS公司生产；酶标仪，美国MD公司生产J-25离心机，美国贝克曼公司生产； BG-transBLOT转移芯，北京百晶生物技术有限公司生产；XJX-IIX射线摄影暗匣，上海跃进 医用光学器械厂生产。二、人参皂甙Rgl可作为唯一活性成分按常规药用剂型制成各种药剂，也可利用 人参皂甙Rgl抵抗甲醛对机体的损伤作用的活性与其他活性成分配合使用按常规药用剂 型制成各种医疗用剂型，制成各种预防和治疗甲醛对机体的损伤的产品，用于预防和治疗 甲醛对机体的损伤。在本发明中这些常规药用剂型就不再一一举例说明。三、人参皂甙Rgl诱导细胞内硫氧还蛋白表达的增加试验(一 )细胞株培养和人参皂甙Rgl刺激处理PC12细胞用含10%马血清、5%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 i g/mL链霉素的 1640培养基，于37°C、5% C02和95%湿度下进行贴壁培养。每2_3天更换培养基一次，细 胞达约70% 80%融合时，传代或用于实验。将细胞接种于平板中，培养过夜后，人参皂甙Rgl处理细胞。分组处理方式如下 对照组不加药；实验组分别加0. 1 y M，1 y M，10 y M的人参皂甙Rgl。上述处理后，置于37°C 和5% C02培养箱中培养24小时，然后收集细胞，提取蛋白离心lOOOrpmXIOmin收获细 胞，分别加入 80ul 细胞裂解液(150mM NaCl，0. 5% NP-40，10mM Tris-HCl, pH 7. 2,0. ImM PMSF，2ug/ml aprotinin，200ug/mlNaN3)，充分混悬后于冰浴下放置裂解40min (中间振荡 2 3次)，4°C下15000rpm离心15min，转上清至新离心管中，-80°C保存。( 二 )免疫印迹1.蛋白含量的测定用BCA试剂盒测定将10ul标准品或待测样本与200ulWR工作溶液混合，37°C孵 育30min，将反应管温度冷却至室温。测定562nm光密度值，绘制标准曲线，并计算蛋白浓度。2.蛋白免疫印迹总蛋白加样量为7 u g(Trx)和 20 u g(CH0P 和 pro-caspasel2)，与 2XSDS 凝胶加 样缓冲液混合后，95°C热变性5min，用15%的SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白条带用电转 移到PVDF膜上，用10%脱脂牛奶4°C封闭过夜；取出PVDF膜，用含0. 1 % Tween-20的TPBS 冲洗后，加入2000倍稀释的一抗室温孵育60min ；用含0. 1% Tween-20的TPBS冲洗，加入 5000倍稀释的二抗室温孵育60min ；用含0. 1 % Tween-20的TPBS冲洗，将PVDF膜浸入发 光底物溶液中反应lmin，X射线胶片曝光。结果显示人参皂甙Rgl在PC12细胞中能诱导硫氧还蛋白表达的增加(见图1)。四、人参皂甙Rgl保护细胞免于甲醛的损伤试验
(一 )实验分组和处理细胞的初始密度为5X104Cell/Well。根据不同实验要求，分为以下各组①空 白对照组在细胞培养体系中未加任何药物；②甲醛处理组在细胞培养体系中只加入 100 i! M甲醛；③人参皂甙Rgl预处理组先加入人参皂甙Rgl (10 u M)预处理8h后，再加入 100 ii M甲醛；④人参皂甙Rgl单独处理组在细胞培养体系中只加入10 ii M人参皂甙Rgl。 上述各组细胞继续培养24h后，按不同实验要求处理细胞。( 二)检测方法1.四噻唑蓝(MTT)试验取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10ul，继续孵育4h后，每 孔加入lOOul的0. 04N盐酸的异丙醇溶液，混勻吹打20 30次后，用酶标仪在波长570nm 处测定吸光度值(见图2)。2.免疫印迹(1)人参皂甙Rgl减弱甲醛(HCH0)引起的内质网应激①空白对照组在细胞培 养体系中未加任何药物；②甲醛处理组在细胞培养体系中只加入lOOyM甲醛；③人参皂 甙Rgl预处理组先加入人参皂甙Rgl (10 yM)预处理8h后，再加入lOOiiM甲醛；④人参皂 甙Rgl单独处理组在细胞培养体系中只加入10 y M人参皂甙Rgl。上述各组细胞继续培 养24h后，然后收集细胞，提取蛋白，做蛋白免疫印迹。详细实验方法见前(见图3)。(2)人参皂甙Rgl减弱甲醛(HCH0)对caspase-12的激活作用①空白对照组在 细胞培养体系中未加任何药物；②甲醛处理组在细胞培养体系中只加入100yM甲醛；③ 人参皂甙Rgl预处理组先加入人参皂甙Rgl (10 u M)预处理8h后，再加入100 y M甲醛；④ 人参皂甙Rgl单独处理组在细胞培养体系中只加入10 yM人参皂甙Rgl。上述各组细胞继 续培养24h后，然后收集细胞，提取蛋白，做蛋白免疫印迹。详细实验方法见前(见图4)。上述试验结果显示甲醛引起PC12细胞的活力下降，而人参皂甙Rgl的预处理能 减弱甲醛对PC12细胞的损伤(图2，图3和图4)。这说明人参皂甙Rgl能诱导硫氧还蛋白 表达的增加，可用于预防和治疗甲醛对机体的损伤。人参是药用价值极高的传统名贵药材，传统中医学认为人参具有大补元气、补脾 益肺、生津止渴、安神益智、补气生血的作用。提示本发明对来源于人参的成分人参皂甙Rgl 是否能诱导硫氧还蛋白表达的增加进行探索，以拓宽人参皂甙Rgl的药用保健领域。结果 表明人参皂甙Rgl在PC12细胞中能诱导硫氧还蛋白表达的增加(图1)；甲醛引起PC12 细胞的活力下降，而人参皂甙Rgl的预处理能减弱甲醛对PC12细胞的损伤(图2，图3和图 4)。这说明人参皂甙Rgl能诱导硫氧还蛋白表达的增加，可用于预防和治疗甲醛对机体的 损伤。由于人参皂甙Rgl诱导硫氧还蛋白表达的增加及其在防治甲醛对细胞的损伤中 的应用是本发明的首次发现，因此，无论是人参皂甙Rgl单独使用为活性成分制成的药剂， 还是利用人参皂甙Rgl抵抗甲醛对机体的损伤作用与其他活性成分配合使用制成的药剂， 均应理解为未超出本发明的范围。
权利要求
人参皂甙Rg1在制备预防和治疗甲醛对机体的损伤的产品中的应用。
2.人参皂甙Rgl在制备预防和治疗甲醛对机体的损伤的医疗保健品中的应用。
3.人参皂甙Rgl在制备与氧化应激损伤相关的保健品中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域。本发明公开了人参皂甙Rg1具有诱导细胞内硫氧还蛋白表达增加的作用，提出人参皂甙Rg1能用于预防和治疗甲醛对机体的损伤。提供人参皂甙Rg1在制备预防和治疗甲醛对机体的损伤的产品特别是医疗保健品中的应用，以及人参皂甙Rg1在制备与氧化应激损伤相关的保健品中的应用。
文档编号A61P39/06GK101829131SQ20101017246
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者杨兆祥, 王晟东, 白洁, 罗富成 申请人:昆明理工大学