异荭草苷作为制备抗呼吸道合胞病毒的药物的用途的制作方法

专利名称：异荭草苷作为制备抗呼吸道合胞病毒的药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，特别涉及异荭草苷(isoorientin)作为制备抗呼吸道 合胞病毒的药物的用途。
背景技术：
异荭草苷(isoorientin)是一个天然来源的黄酮6位碳苷类化合物，不少药用 植物中都含有该化合物。在国家知识产权局、中国期刊网和Scifinder Scholar的检索 结果显示，有关异荭草苷的公开发明专利有三个①白花败酱草中几种高纯度药用物质 的快速制备方法(专利号200410068016. 2)；②藏茵陈提取物及其制备方法、药物组合物 和用途(专利号200710163097. 8)；③从含羞草中分离纯化黄酮苷单体的方法(专利号 200910096967. 3)。分别为异荭草苷从白花败酱草、藏茵陈和含羞草中分离、纯化的制备方 法。有关异荭草苷的研究论文大致可分为三类①异荭草苷的分离和结构鉴定从淡竹叶、 竹叶、含羞草、白花败醬草、金莲花、广金钱草、大青叶、鸭跖草、某些龙胆属植物等中都曾分 离得到异荭草苷；②异荭草苷在植物中的含量分析淡竹叶、竹叶、金莲花、线叶龙胆中的 异荭草苷含量测定研究；③异荭草苷的生物活性研究只有异荭草苷的抗菌活性研究，结 果显示，该化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黄曲霉有一定的抑制活性。未发现从植物 中分离得到的异荭草苷或其它来源的异荭草苷在抗呼吸道合胞病毒方面的专利和文献。本发明中的异荭草苷从中药淡竹叶中分离得到。中药淡竹叶为禾本科淡竹叶属植 物淡竹叶(Lophatherum gracile Brongn.)的干燥茎叶，1977年以来的历版《中华人民共 和国药典》对淡竹叶均有收载。淡竹叶性寒，味甘、淡，具清热、除烦、利尿的功效，民间多用 于热病心烦、口渴、口舌生疮、牙龈肿痛、尿路炎症、小便热痛等症的治疗。现代药理学研究 表明，淡竹叶具解热利尿、抗菌、抗肿瘤、升高血糖等作用。有资料提及淡竹叶有抗病毒作 用，但却没见任何活性成分和抗病毒活性研究数据。呼吸道病毒感染是严重危害人类健康的传染性疾病之一。呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus,RSV)属副粘病毒科肺病毒属，它所引起的呼吸道感染、喉 炎、气管炎、支气管炎和肺炎等是临床上的常见病与多发病，易感人群为小孩和老人。血清 学统计表明，100%的儿童成年以前都感染过RSV。迄今为止，对RSV感染尚无有效的特异性 防治措施，核苷类药物病毒唑(ribavirin)是唯一被FDA批准治疗RSV感染的化学药物，但 由于其疗效有限、毒副作用大，临床应用效果并不理想。另外，RSV抗体类药物(如RSV单 克隆抗体Synagis)虽然疗效较好，但使用周期长、费用高，尚未广泛应用于临床。因此，亟 需寻找和开发使用安全、特异性强的高效抗RSV感染药物。

发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供异荭草苷 (isoorientin)作为制备抗呼吸道合胞病毒的药物的用途。本发明的目的通过下述技术方案来实现异荭草苷作为制备抗呼吸道合胞病毒的药物的用途。所述抗呼吸道合胞病毒的药物含有治疗有效量的异荭草苷和药学上可接受的载 体。所述抗呼吸道合胞病毒的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注 射剂。所述抗呼吸道合胞病毒的药物可与临床上应用的抗病毒药物病毒唑组合，制备成 预防和治疗由呼吸道合胞病毒感染引起疾病的药物。所述异荭草苷分子结构如下 本发明所述异荭草苷可由淡竹叶或其它植物中分离得到，也可由其它途径(如从 SIGMA等公司购买)获得，纯度大于或等于98%时，活性更好。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果本发明针对目前呼吸道病 毒治疗领域急需解决的问题，寻找出新的高效、低毒的抗呼吸道病毒药物资源；本发明提供 的异荭草苷是天然来源的单体化合物，具有很强的抗呼吸道合胞病毒活性，且对宿主细胞 的毒性小。另外，体外抗病毒实验表明，异荭草苷与临床上常用的抗病毒药物病毒唑联合应 用时，具协同增效作用。因此，异荭草苷的抗病毒的活性具有高效、低毒、作用机理新颖的特 点，有很好的应用前景。


图1是异荭草苷和病毒唑联合应用时的抗呼吸道合胞病毒(RSV)活性照片图，其 中a为正常喉癌Ofep-2)细胞照片，b为RSV感染的H印-2细胞照片，c为加入5. 7 μ g/mL 的异荭草苷后的RSV感染的!fep-2细胞照片，d为加入5. 7 μ g/mL的异荭草苷和2. 9 μ g/mL 病毒唑混合物后的RSV感染的H印-2细胞照片。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1 异荭草苷体外抗呼吸道合胞病毒活性(1)细胞、病毒和实验材料呼吸道合胞病毒(RSV，Long strain)，宿主细胞为喉 癌细胞(Hep-2细胞)；阳性对照药为病毒唑(ribavirin)；细胞生长在质量百分比浓度为 10 %的小牛血清(FBS)的MEM培养基中；维持液是含有质量百分比浓度1 %的FBS的MEM培养基。(2)样品溶液的配制分别将异荭草苷样品(购买于SIGMA公司)和病毒唑样品 用二甲基亚砜(DMSO)配成浓度为40mg/mL的溶液，再用维持液分别将样品配制成400 μ g/ mL和25 μ g/mL的样品溶液，分别用作细胞毒性和抗病毒活性实验。
(3)用四唑盐(MTT)比色法测定化合物的细胞毒性将Hep-2细胞培养在96孔培养板中，等单层细胞长好后，加入用维持液倍半稀释 的系列浓度(浓度为400 12. 5μ g/mL)样品溶液，在37°C，5 % C02培养箱中培养3天； 加入10 μ L MTT溶液(5mg/mL，用缓冲溶液配置)，继续培养4小时。吸出样品溶液，加入二 甲亚砜，室温下，将96孔板置于微空孔板振荡器中振荡10分钟。用酶标仪测定各孔的OD 值，测量波长为570nm，参比波长为630nm，计算样品对细胞的半数致死毒性浓度(CC5tl)。每 组设4个平衡孔，每组实验重复3次。计算结果，画出曲线，求出半数毒性浓度(CC5tl)。(4)通过观察样品对细胞病变效应的抑制程度(cytopathic effect reductionassay) IlJ定抗病毒 舌个生
将Hep-2细胞培养在96孔培养板中，等单层细胞长好后，加入用维持液稀释好的 100倍半数感染量(IOOTCID5ci)的病毒液，再加入用维持液倍半稀释的系列浓度(浓度为 25 0.8 μ g/mL)样品溶液，在37°C，5 % C02培养箱中培养3 4天。每天于倒置显微镜 下观察细胞病变效应(CPE)的程度，并记录-表示无CPE ；+表示0 25%细胞有CPE ；2+ 表示25 50%细胞有CPE ；3+表示50 70%细胞有CPE ；4+表示75 100%细胞有CPE。 最后估计出半数抑制浓度(IC5tl)。选择性指数(Si) = CC50/IC50O实验结果异荭草苷体外抑制呼吸道合胞病毒的IC5tl = 5. 7 士0. 8 μ g/mL, CC50 = 362. 6 士0. 7 μ g/mL, SI = 63. 6。病毒唑体外抑制呼吸道合胞病毒的IC5tl = 2. 9 士0. 2 μ g/mL, CC50 = 62. 6 + 3. 2 μ g/mL, SI = 21. 6。可见，异荭草苷抑制RSV的SI值(Si = CC5(1/IC5(1)高于阳性对照药病毒唑，其抗病 毒的活性具有高效、低毒的特点。实施例2 异荭草苷与病毒唑联合用药的体外抗呼吸道合胞病毒活性测定(1)细胞、病毒和实验材料呼吸道合胞病毒(RSV，Long strain)，宿主细胞为喉 癌细胞(Hep-2细胞)；阳性对照药为病毒唑(ribavirin)；细胞生长在质量百分比浓度为 10%的小牛血清(FBS)的MEM培养基中；维持液是质量百分比浓度为1 %的FBS的MEM培养基。(2)样品溶液的配制分别将异荭草苷样品(购买于SIGMA公司)和病毒唑样品 用二甲基亚砜(DMSO)配成浓度为40mg/mL的溶液，用维持液分别将异荭草苷和病毒唑配制 成5. 7 μ g/mL和3. 0 μ g/mL的溶液，再将两者按体积比1 1混合成待测样品溶液。(3)采用细胞病变抑制法(cytopathic effect reduction assay)测定异荭草苷 和病毒唑联合应用的抗病毒活性将Hep-2细胞培养在96孔培养板中，等单层细胞长好后，加入用维持液稀释好的 100倍半数感染量(IOOTCID5ci)的病毒液，再加入待测样品溶液，在37°C，5 % C02培养箱中 培养3 4天。每天于倒置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)的程度，并记录_表示无 CPE ；+表示0 25%细胞有CPE ；2+表示25 50%细胞有CPE ；3+表示50 70%细胞有 CPE ；4+表示75 100%细胞有CPE。最后用数码相机照相。实验结果如图1所示，在异荭草苷和病毒唑的半数抑制浓度(IC5tl分别为5.7 μ g/ mL和3. 0 μ g/mL)时，两者联合应用能100%抑制由RSV引起的细胞病变，说明两者具有协同作用。实施例3 异荭草苷体内抗呼吸道合胞病毒活性(1)动物昆明种雄性或雌性小白鼠(18 22g)。(2)动物实验采用小鼠RSV感染模型，测定异荭草苷内抗呼吸道合胞病毒(抗 RSV)活性。选用BALB/C小鼠60只，雄雌各半，随机分成6组，分别为异荭草苷高剂量组 (40. Omg/ (kg ·(!))、中剂量组(20. Omg/ (kg -d))、低剂量组(10. Omg/ (kg -d))、病毒唑 IOmg/ (kg · d)、病毒阳性和生理盐水阴性对照组，每组10只。灌胃给药，阳性和阴性对照组灌胃 生理盐水。三天后，经鼻滴入RSV悬液(TCID5tl为I(T66Ail)，继续灌胃给药7天，观察小鼠 存活情况。最后给药40min后处死小鼠，无菌取肺组织，勻浆、用维持液吹打悬浮、离心、稀 释，接种在Hep-2细胞上，采用细胞病变效应抑制法测定病毒滴度，计算病毒抑制率。实验结果如表1所示，可见异荭草苷在体内能抑制抗呼吸道合胞病毒，且具有剂 量依赖性。表1异荭草苷体内抗呼吸道合胞病毒结果 *χ2检验，与病毒对照组比较ρ < 0. 05实施例4 异荭草苷片剂的制备取异荭草苷Ig与微晶纤维素27g及硬脂酸镁2g混合，混合物用单冲压片机打成 直径6mm，重量300mg的片。本片剂中每片含异荭草苷10mg。实施例5 异荭草苷胶囊剂的制备取异荭草苷Ig与乳糖27g、硬脂酸镁2g混合，以每300mg填充胶囊。本胶囊剂中， 每个胶囊含异荭草苷10mg。实施例6 异荭草苷散剂的制备取异荭草苷5g与淀粉25g混合，加水制成软材，过12目筛进行造粒，干燥后得到 散剂。本散剂中，每300mg中含异荭草苷50mg。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明 的保护范围之内。
权利要求
异荭草苷作为制备抗呼吸道合胞病毒的药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗呼吸道合胞病毒的药物含有治疗 有效量的异荭草苷和药学上可接受的载体。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述抗呼吸道合胞病毒的药物制成散剂、 丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。
全文摘要
本发明公开了异荭草苷作为制备抗呼吸道合胞病毒的药物的用途。所述抗呼吸道合胞病毒的药物含有治疗有效量的异荭草苷和药学上可接受的载体。所述抗呼吸道合胞病毒的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。本发明针对目前呼吸道病毒治疗领域急需解决的问题，寻找出新的高效、低毒的抗呼吸道病毒药物资源；本发明提供的异荭草苷是天然来源的单体化合物，具有很强的抗呼吸道合胞病毒活性，且对宿主细胞的毒性小；另外，体外抗病毒实验表明，异荭草苷与临床上常用的抗病毒药物病毒唑联合应用时，具协同增效作用。因此，异荭草苷的抗病毒的活性具有高效、低毒、作用机理新颖的特点，有很好的应用前景。
文档编号A61P11/00GK101843612SQ201010178799
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者叶文才, 张晓琦, 李药兰, 王英, 范春林 申请人:暨南大学