专利名称：哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联dna疫苗的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域的疫苗及其制备技术，涉及基因工程及免疫学。具体地 说是哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法和应用。
背景技术：
哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)均为 革兰氏阴性菌，广泛分布于近岸海水环境，能感染海水鱼类、对虾、甲壳类等多种水产动物， 是世界许多国家和地区养殖对虾和鱼类的主要致病菌，每年都给水产养殖业造成重大经济 损失。同时这两种菌也是夏、秋季沿海地区海产品食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。哈 维氏弧菌(Vibrio harveyi)的主要致病因子是寡肽结合蛋白、溶血素、胞外蛋白酶，副溶血 性弧菌的主要致病因子是溶血素、丝氨酸蛋白酶等。目前已制备的哈维氏弧菌和/或副溶血弧菌疫苗，主要有全菌灭活疫苗和重组蛋 白疫苗。灭活疫苗的优点是安全，但其缺点是免疫效果较差。重组蛋白疫苗由于制备过程 中涉及蛋白质提取纯化等步骤而造价昂贵。研究表明，DNA疫苗是一种在重组蛋白疫苗后兴起的新型疫苗，其原理是将疫苗抗 原基因克隆于一真核表达载体中，随后将该重组载体导入所要免疫的动物体内。疫苗抗原 蛋白在动物体细胞内可以持续表达合成，从而刺激机体的免疫系统，达到免疫保护目的。因 此，DNA疫苗具有灭活疫苗和重组蛋白疫苗两者的优点。但是，现有的普通DNA疫苗仍存细 胞毒性、免疫保护率低等不利因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法及 应用，以克服现有技术的不足。本发明的二联DNA疫苗的原理是将针对两个细菌的两个重要致病因子的功能区 域或亚单位蛋白基因融合克隆于同一真核表达载体中，从而实现针对两种细菌的抗原融合 蛋白的表达。将这种二联DNA疫苗导入所要免疫的动物体内，就会产生针对两种细菌的融 合蛋白抗体，其免疫效果优于普通DNA疫苗及两种DNA疫苗的联合免疫，且更加安全、方便、 有效。本发明即是采用这种技术，将哈维氏弧菌和副溶血弧菌的两个主要致病因子的亚单 位蛋白基因融合构建于真核表达载体中，制备成二联DNA疫苗，从而达到双重抵抗哈维氏 弧菌和副溶血弧菌对水产鱼类侵染的目的。—种哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗，其特征在于所述的疫苗为副溶 血弧菌溶血素亚单位基因tdh2，和哈维氏弧菌寡肽结合蛋白基因oppA，通过6个核苷酸 GAATTC相连而成的tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体疫苗，其中tdh2-oppA融合基因 的 DNA 序列为ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAA ACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATAC AACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATT AATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCA AGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGT ATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGT ATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAGTTTT ACGCATGTACAAGAATAAAATCACCAAAGCCCTTCTTCTAGGTGCTGGTCTGGCAGTGGCTGCCTCTTCTACTACTA CCGCTTTCGCTGCTGACGTTCCGGCAGGCATTAAACTAGCTGAAAAACAAGAAATCGTTCGTGGTAACGGAACTGAA GTGGCTACGATTGATCCACATAAGTCGTCTGGAGTACCTGAATCTCATGTGATTCGCGACCTTCTTGAAGGCCTTGT TAACCAAGACGGTGATGGCAATACAATTCCTGGTGTAGCAGAGAGTTGGGAGACAACAGATAACCAGACATTTACTT TTCATTTACGCAAAGATGCAAAGTGGTCTAACGGCGATCCTGTAACAGCACAAGATTTTGTATACAGTTGGCAGCGC TTTGTCGATCCTGCTACAGCCTCTCCATATGCTTGGTACATGGAGTTTACCAAGATGGTCAATGCTAAAGAAATTAT TGAAGGTAAAAAAGAAAAAAGTACTCTGGGTGTTAAGGCGGTAGATGCGCACACACTAGTTGTTGAACTTGAAACTG CTGTGCCTTATTTGTGATGATGGTAGGTCACACTTCAATGAAGCCAGTTCACAAGGCGACGATCGAGAAATACGGTG ATCAATGGACTAAGCCTTGGTCATTTTGTTGGTAACGGTGCTTACGAACTTGATAAGTGGGTCGTAAACGAGCGTAT GGTTCTGAAGCGCAACGTGCAGTACTGGGATAACGACAAGTCTGTGATTGATAAAGTAACGTTCCTTCCGATAGAAA ATCAAAATGCGGAAATGAATCGCTTTTTGTCTGGCGAGATTGACTTCACAGATGATTTGCCGATTGAACACTTTAAG CGCATGCAAAAAGAGCACCCAGAAGATCTGTCCGTTGTTGGCAGTCTGTGTAGTTATTACTACATATTTAACACTAA GAAAAAGCCGTTTAACGACTCTCGTGTTCGCAAAGCAATTTCTTATGCGATTGATCGTGATATCGTAGCGAATGCTA TTATGGGACAAGGACAAAAGCCAGCGTATTTCTTAACACCTGAGATAACAGCCGGCTTTGATCCTGAATTGCCAGCA TATGGTAGGATGACGCAAAAAGAGCGCAACGCAGAAGCCTCCCGACTGCTAGCCGAAGCAGGATATGGTAAAGATAA TCCCTTAGAGTTTACATTCCTGTATAACACAGATGAAAACCACAAAAAACTTGCCGTCGCACTTGGCTCCATGTGGA AAAAGACATTAGGCTTGAAAGTTACTCTAGAAAACCAAGAGTGGAAAACGTACTTATCTTCTACGAAGACTGGTGAT TTTGAGGTAGCCCGTGCGGGATGGTGTGGCGATTACAATGAAGCTTCCACATTTTTGACACTGATGACAAGTGACAA TACGAGCGCTGGTCAGCACTGGGGTAATAATGATTACGATATACTGATCGATAATGCCTTCCACTCAACTTCAGAAG AAGAGCGCACTAAGTTTTATTTAGACGCTGAAAAACTAATGGCAAAAGAAATGCCAATTGCTCCAATTTATCAATAC GTGAAGACTCGTTTACTTAACCCTCACGTTGGTGGCTTCCCTTCCAATAATGCGCAAGAAATGATCTACACCAAAGA TCTTTACATCAAAGCAGACTAA。本发明的哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法即具体步骤如下(1)分别制备副溶血弧菌的溶血素亚单位基因tdh2和哈维氏弧菌的寡肽结合蛋 白基因oppA ；(2)再用DNA连接酶分别将基因tdh2和基因oppA克隆到载体pMD19_T Simple 中；(3)再通过内切酶双酶切技术，依次将基因tdh2和基因oppA克隆到同一个真核表 达载体pEGFP-Nl中，得到所要求的载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体；(4)用常规的方法扩增培养并收获上述tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体， 并制成哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液。一、上述制备基因tdh2和基因oppA的制备方法1、以副溶血弧菌DNA为模板，用引物a进行PCR反应，得到含有XhoI和EcoRI双 酶切位点的基因tdh2 ；引物a为人工设计的DNA片段，其序列如下
5’ CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’5’ CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3’2、以哈维氏弧菌DNA为模板，用引物b进行PCR反应，得到含有EcoRI和BamHI双 酶切位点的基因oppA ；引物b为人工设计的DNA片段，其序列如下5’ CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3’5’ CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3’ ；二、克隆基因tdh2和基因oppA 1、将线性载体pMD19-T Simple与含有XhoI和EcoRI双酶切位点的基因tdh2混 合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载体pMD19-T Simple-tdh2 ；2、将线性载体pMD19-T Simple与含有EcoRI和BamHI双酶切位点的基因oppA混 合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载体pMD19-T Simple-OppA0三、构建tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体1、将真核表达载体pEGFP-Nl用XhoI和EcoRI双酶切，分离后得到线性载体 pEGFP-Nl ；2、将载体pMD19-T Simple_tdh2用XhoI和EcoRI双酶切，分离后得到基因tdh2 ；3、将线性载体pEGFP-Nl与基因tdh2混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到 tdh2基因的真核表达工程载体pEGFP-Nl-tdh2 ；4、将上述真核表达载体pEGFP-Nl_tdh2用EcoRI和BamHI双酶切，分离后得到线 性的载体 pEGFP-Nl-tdh2 ；5、将载体pMD19-T Simple-oppA用EcoRI和BamHI双酶切，分离后得到基因oppA ；6、将线性载体pEGFP-Nl_tdh2与基因oppA混合，加入DNA连接酶进行重组连接， 得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体pEGFP-Nl-tdh2-oppA。四、哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA亚单位疫苗悬液的制备1、将上述所得的tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体转化到大肠杆菌DH5ci 中，进行常规扩增培养，提取得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体，将该载体 溶于0. 05 0. 20mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为200 μ g/ml,即得到哈维氏弧菌和副 溶血弧菌二联疫苗悬液。2、按常规免疫方法，以100 μ 1/尾的剂量对鱼类进行免疫。本发明的哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗应用于鱼类免疫。本发明具有如下优点1、本疫苗制备方法简便，实验可操作性强，重复率高；融合基因真核表达构建的效 率闻；2、使用两种致病菌的致病因子蛋白亚单位基因构建本二联DNA疫苗，专一性更 强，且避免了产生细胞毒性的不利因素；3、本二联DNA疫苗双基因融合蛋白表达，双重免疫保护；应用于鱼类的免疫效果 较灭活疫苗、重组蛋白疫苗及一价DNA疫苗高；免疫保护率高于其他类型的疫苗；且只需一 次免疫操作即可使鱼类获得对哈维氏弧菌和副溶血弧菌的免疫力；4、哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗使用时不会对人体产生毒副作用。
图1 :tdh2-oppA融合基因PCR结果电泳图。其中，Ml核酸 DL2000Marker ；M2 核酸 DL15000Marker ；1:阴性对照；2 用引物a进行PCR扩增得到的基因tdh2 ；3 用引物b进行PCR扩增得到的基因oppA ；4 融合基因 tdh2_oppA图2 :ttdh2-oppA融合基因蛋白表达电泳图。其中，M 蛋白 Marker ；1 基因tdh2单独表达的结果；2 基因oppA单独表达的结果3 :tdh2-oppA融合基因的表达结果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在举例描述，而非以任何 形式对本发明进行限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如 J. Sambrook et al :Molecular Cloning :ALaboratory manual(New York :CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按制造厂商建议的条件。所用载体与试 剂皆可从相关厂商购得。实施例1 制备tdh2_oppA融合基因一、制备基因tdh2和基因oppA 1.制备基因 tdh2 (1)根据GeneBank中所收录的副溶血弧菌的热稳定溶血素亚单位基因tdh2的序 列，设计了一对扩增基因tdh2的引物a，其序列为5’ CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’5' CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3'(2)以副溶血弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR反应，得到570bp的PCR产物；反应条件为94°C预变性5分钟；94°C变性1分钟，58°C退火1分钟，72°C延伸1分 钟；如此反应30个循环；然后72°C延伸10分钟。反应体系为:5μ1 的 Buffer，3 μ 1 的 MgCl2,0. 5 μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶，2 μ 1 的模板DNA，各0. 5 μ 1的引物a，然后用灭菌去离子水补足到50 μ 1 ；(3) PCR产物经的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有570bp的目的片段的凝胶切 下，回收纯化后得到含有XhoI和EcoRI酶切位点的基因tdh2。2.制备基因 oppA (1)根据GeneBank中所收录的的哈维氏弧菌的寡肽结合蛋白基因oppA的序列，设 计了一对扩增基因oppA的引物b，其序列为5’ CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3’5’ CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3’
(2)以哈维氏弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR反应，得到1665bp的PCR产物。反应条件为94 V预变性5分钟；94 V变性1分钟，61°C退火1分钟，72 °C延伸2分 钟；如此反应30个循环；然后72°C延伸10分钟。反应体系为:5μ1 的 Buffer，3 μ 1 的 MgCl2,0. 5 μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶，2 μ 1 的模板DNA，各0.5μ 1的引物b，然后用灭菌去离子水补足到50 μ 1。(3)PCR产物经的琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有1665bp目的片段的凝胶切 下，回收纯化后得到含有EcoRI和BamHI酶切位点的基因oppA。二、克隆基因 tdh2 和 oppA 1.克隆基因 tdh2:(1)取0. 5 μ 1的线性载体pMD19-T Simple，加入4. 5 μ 1纯化的基因tdh2，混合， 再加入5 μ IDNA连接酶，于16°C连接反应16小时，得到基因tdh2连接产物；(2)将基因tdh2连接产物转化到受体大肠杆菌DH5ci中，并于含有氨苄青霉 素、40 μ g/ml X-gal以及、40 μ g/ml IPTG的LB固体培养基上37°C培养12小时；(3)培养后利用常规的蓝白斑筛选方法，挑选白斑接入含氨苄青霉素的LB液体培 养基中，37°C振荡培养12小时后，提取基因tdh2载体DNA ；(4)以提取的基因tdh2载体DNA为模板，以引物a进行PCR反应检测，并且用XhoI 和EcoRI对基因tdh2载体进行双酶切检测，筛选得到含有工程载体pMD 19-T Simple-tdh2 的阳性菌株，并测序确定。2.克隆基因 oppA (1)取0. 5μ 1的载体pMD19_TSimple，加入4· 5μ 1纯化的基因ορρΑ，混合，再加入 5μ 1 DNA连接酶，于16°C连接反应16小时，得到基因oppA连接产物。(2)将上述基因oppA连接产物转化到受体大肠杆菌DH5ci中，并于含有氨苄 青霉素、40 μ g/ml X-gal以及、40 μ g/ml IPTG的LB固体培养基上37°C培养12小时。(3)培养后利用蓝白斑筛选的方法，挑选白斑接入含氨苄青霉素的LB液体培养基 中，37°C振荡培养12小时后，提取基因oppA载体DNA。(4)依提出的上述基因oppA载体DNA为模板，以引物b进行PCR反应检测，并且 用EcoRI和BamHI对基因oppA载体进行双酶切检测，筛选得到含有工程载体pMD 19-T Simple-oppA的阳性菌株，并测序确定。实施例2 构建tdh2_oppA融合基因真核表达载体pEGFP-Nl-tdh2_oppA 1.按实施例1的方法制备带有XhoI和EcoRI双酶切位点的基因tdh2载体DNA ；2.将真核表达载体pEGFP-Nl和基因tdh2载体DNA用XhoI、EcoRI双酶切，分离 后得到线性载体pEGFP-Nl和线性基因tdh2 ；3.取4. 5 μ 1线性基因tdh2，加入0. 5 μ 1线性载体pEGFP-Nl，混合，再加入5 μ 1 DNA连接酶，16°C连接反应16小时，得到基因tdh2连接产物；4.将基因tdh2连接产物转化到大肠杆菌DH5ci中培养，挑取菌落培养后提取载体 DNA,经PCR反应和Xhol、EcoRI双酶切检测后，筛选得到工程载体pEGFP-Nl_tdh2 ；5.按实例1的方法制备带有EcoRI和BamHI双酶切位点的基因oppA载体DNA ；6.将真核表达工程载体pEGFP-Nl_tdh2和基因oppA载体DNA用EcoRI和BamHI 双酶切，得到线性的工程载体pEGFP-Nl-tdh2和线性基因oppA ；
7.取4. 5 μ 1线性基因ορρΑ，加入0. 5 μ 1线性载体pEGFP-Nl_tdh2，混合，再加入 5 μ 1 DNA连接酶，16°C连接反应16小时，得到pEGFP-Nl-tdh2-oppA连接产物；8.将融合基因tdh2-oppA连接产物转化到大肠杆菌DH5 α中培养，挑取菌落培养 后提取载体DNA，经PCR反应和Xhol、BamHI双酶切检测后，筛选得到融合基因真核表达工 程载体 pEGFP-m-tdh2-oppA。9.为了验证构建的真核表达载体pEGFP-Nl-tdh2-oppA中同时包含基因tdh2和基 因oppA，将含有上述真和表达的菌株接入到0. 6%卡那霉素的LB液体培养基中，37°C振荡 培养12小时后提取载体DNA，并经PCR和双酶切检测，用pEGFP-N-5’和pEGFP_N_3’这对引 物进行PCR扩增并测序后，证明融合基因序列片段插入位置正确，且不存在移码突变和提 前终止。PCR检测结果如图1所示。10.为了验证tdh2-oppA融合基因的蛋白能正常表达，分别将基因tdh2、基因oppA 和融合基因tdh2-oppA序列片段连接到原核表达载体pET28a中，再转化到受体大肠杆菌 BL21中，通过异丙基硫代半乳糖苷IPTG进行诱导后，经SDS-PAGE电泳检测，得到了与预想 的分子量大小相同的目的蛋白，证明这些蛋白都能正常表达，结果如图2所示。实施例3 二联DNA亚单位疫苗悬液的制备和使用将上述实施例2所得的pEGFP-Nl-tdh2-oppA工程载体转化到大肠杆 菌DH5ci中，在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养12-18小时后，提取工程载体 pEGFP-Nl-tdh2-oppA，对该载体进行去除内毒素处理后，将载体溶于0. 05mol/L磷酸盐缓 冲液PBS中至浓度为200 μ g/ml,即得到哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA亚单位疫苗悬液。上述疫苗悬液可直接对鱼类进行免疫。以养殖的牙鲆为例进行免疫方法如下免 疫实验前两周购买同一批次的健康牙鲆，室温饲养于水箱中，通气并正常换水、投饵；用制 备的工程载体pEGFP-Nl-tdh2-oppA对实验牙鲆进行肌肉注射免疫，注射部位为靠近背鳍 的肌肉较为厚实的地方，注射剂量为100μ 1/尾。同时设置注射等量灭菌磷酸盐缓冲液PBS 的对照组。接种后不同时间尾静脉取血，制备血清用于抗体检测。当实验牙鲆免疫接种4 5周后，用哈维氏弧菌和副溶血弧菌对其进行肌肉注射攻毒，攻毒后观察并记录实验牙鲆的 死亡情况，计算相对免疫保护率RPS为75%。
权利要求
一种哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗，其特征在于在真核表达载体上连接入副溶血弧菌溶血素亚单位基因tdh2和哈维氏弧菌寡肽结合蛋白基因oppA通过6个核苷酸GAATTC相连而成的tdh2-oppA融合基因，其中tdh2-oppA融合基因的DNA序列为ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAGTTTTACGCATGTACAAGAATAAAATCACCAAAGCCCTTCTTCTAGGTGCTGGTCTGGCAGTGGCTGCCTCTTCTACTACTACCGCTTTCGCTGCTGACGTTCCGGCAGGCATTAAACTAGCTGAAAAACAAGAAATCGTTCGTGGTAACGGAACTGAAGTGGCTACGATTGATCCACATAAGTCGTCTGGAGTACCTGAATCTCATGTGATTCGCGACCTTCTTGAAGGCCTTGTTAACCAAGACGGTGATGGCAATACAATTCCTGGTGTAGCAGAGAGTTGGGAGACAACAGATAACCAGACATTTACTTTTCATTTACGCAAAGATGCAAAGTGGTCTAACGGCGATCCTGTAACAGCACAAGATTTTGTATACAGTTGGCAGCGCTTTGTCGATCCTGCTACAGCCTCTCCATATGCTTGGTACATGGAGTTTACCAAGATGGTCAATGCTAAAGAAATTATTGAAGGTAAAAAAGAAAAAAGTACTCTGGGTGTTAAGGCGGTAGATGCGCACACACTAGTTGTTGAACTTGAAACTGCTGTGCCTTATTTTGTGATGATGGTAGGTCACACTTCAATGAAGCCAGTTCACAAGGCGACGATCGAGAAATACGGTGATCAATGGACTAAGCCTGGTCATTTTGTTGGTAACGGTGCTTACGAACTTGATAAGTGGGTCGTAAACGAGCGTATGGTTCTGAAGCGCAACGTGCAGTACTGGGATAACGACAAGTCTGTGATTGATAAAGTAACGTTCCTTCCGATAGAAAATCAAAATGCGGAAATGAATCGCTTTTTGTCTGGCGAGATTGACTTCACAGATGATTTGCCGATTGAACACTTTAAGCGCATGCAAAAAGAGCACCCAGAAGATCTGTCCGTTGTTGGCAGTCTGTGTAGTTATTACTACATATTTAACACTAAGAAAAAGCCGTTTAACGACTCTCGTGTTCGCAAAGCAATTTCTTATGCGATTGATCGTGATATCGTAGCGAATGCTATTATGGGACAAGGACAAAAGCCAGCGTATTTCTTAACACCTGAGATAACAGCCGGCTTTGATCCTGAATTGCCAGCATATGGTAGGATGACGCAAAAAGAGCGCAACGCAGAAGCCTCCCGACTGCTAGCCGAAGCAGGATATGGTAAAGATAATCCCTTAGAGTTTACATTCCTGTATAACACAGATGAAAACCACAAAAAACTTGCCGTCGCACTTGGCTCCATGTGGAAAAAGACATTAGGCTTGAAAGTTACTCTAGAAAACCAAGAGTGGAAAACGTACTTATCTTCTACGAAGACTGGTGATTTTGAGGTAGCCCGTGCGGGATGGTGTGGCGATTACAATGAAGCTTCCACATTTTTGACACTGATGACAAGTGACAATACGAGCGCTGGTCAGCACTGGGGTAATAATGATTACGATATACTGATCGATAATGCCTTCCACTCAACTTCAGAAGAAGAGCGCACTAAGTTTTATTTAGACGCTGAAAAACTAATGGCAAAAGAAATGCCAATTGCTCCAATTTATCAATACGTGAAGACTCGTTTACTTAACCCTCACGTTGGTGGCTTCCCTTCCAATAATGCGCAAGAAATGATCTACACCAAAGATCTTTACATCAAAGCAGACTAA。
2.哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法，其特征在于(1)分别制备副溶血弧菌的溶血素亚单位基因tdh2和哈维氏弧菌的寡肽结合蛋白基 因 oppA ；(2)用DNA连接酶分别将基因tdh2和基因oppA克隆到载体pMD19_TSimple中，获得 载体 pMD19-T Simple-tdh2 和 pMD19_T Simple-oppA ；(3)利用DNA内切酶双酶切技术分别使pMD19-TSimple_tdh2和pMD19-TSimple_oppA获得粘性末端，再依次将具有粘性末端的基因tdh2和基因oppA克隆到同一个真核表达载 体pEGFP-Nl中，得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体；(4)扩增培养并收获上述tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体，并制成哈维氏弧菌 和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液。
3.如权利要求2所述的哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法，其特征在 于上述tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体的构建方法如下(1)制备基因tdh2和基因oppA以副溶血弧菌DNA为模板，用引物a进行PCR反应，得到含有BamHI和EcoRI双酶切位 点的基因tdh2 ；其引物a序列如下5' CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3' 5’ CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3’ ；以哈维氏弧菌DNA为模板，用引物b进行PCR反应，得到含有EcoRI和XhoI双酶切位 点的基因oppA ；其引物b序列如下5' CGCGAATTCATGGATGCTAATGAAAAACTTGGAG 3' 5' CGCGGATCCCCTTAGTCTGCTTTGATGTAAAGATC 3'；(2)克隆基因tdh2和基因oppA将线性载体PMD19-T Simple与含有XhoI和EcoRI双酶切位点的基因tdh2混合，加入 DNA连接酶进行重组连接，得到载体pMD19-T Simple-tdh2 ；将线性载体PMD19-T Simple与含有EcoRI和BamHI双酶切位点的基因oppA混合，加 入DNA连接酶进行重组连接，得到载体pMD19-T Simple-oppA ；(3)构建tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体将真核表达载体pEGFP-m和pMD19-T Simple_tdh2分别用XhoI和EcoRI双酶切，分 离后得到线性载体pEGFP-Nl和线性基因tdh2，再将线性载体pEGFP-Nl和基因tdh2混合， 加入DNA连接酶进行重组连接，得到工程载体pEGFP-Nl-tdh2 ；将工程载体pEGFP-Nl-tdh2和pMD19_T Simple-oppA分别用EcoRI和BamH双酶切，分 离后得到线性载体pEGFP-Nl-tdh2和基因oppA，再将线性载体pEGFP-Nl_tdh2和基因oppA 混合，加入DNA连接酶进行重组连接，得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体 pEGFP-Nl-tdh2-oppA0
4.如权利要求2所述的哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法，其特征在 于上述步骤(4)中的二联DNA疫苗悬液的制备方法如下将载有tdh2-oppA融合基因真核表达工程载体pEGFP-Nl-tdh2-oppA转化到大 肠杆菌DH5ci中，扩增培养后提取得到载有tdh2-oppA融合基因的真核表达工程载体 pEGFP-Nl-tdh2-oppA,将载体溶于0. 05 0. 20mol/L磷酸盐缓冲液PBS中至浓度为 200 μ g/ml，制成哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液。
5.哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液以50 200μ 1/尾的剂量应用于鱼类 免疫。
全文摘要
本发明涉及哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗的制备方法和应用，其特征是将哈维氏弧菌oppA基因和副溶血弧菌tdh2基因通过6个核苷酸GAATTC相连成的tdh2-oppA融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；其制备方法包括使基因tdh2和oppA克隆到线性载体pMD19-T Simple中；再通过双酶切技术，将该融合基因插入到真核表达载体pEGFP-N1中构建得到pEGFP-N1-tdh2-oppA融合基因蛋白真核表达工程载体疫苗；最后用常规的方法制成哈维氏弧菌和副溶血弧菌二联DNA疫苗悬液，以100μl/尾的剂量对鱼类进行免疫。本发明操作性强重复率高，安全无毒副作用，可对鱼类双重免疫保护，免疫效果较灭活疫苗、重组蛋白疫苗及普通DNA疫苗高。
文档编号A61K48/00GK101879317SQ201010186539
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者何庆芳, 刘瑞, 徐广峰, 陈吉祥 申请人:中国海洋大学