专利名称：一种中药活性筛选方法
技术领域：
本发明涉及药物活性筛选和中空纤维微膜技术，具体为一种中药活性筛选方法。
背景技术：
中药及天然药物药效物质基础的筛选及评价是中药现代化研究的重要组成部分， 人们一直在努力尝试和研究高效、快速、准确的体外中药药物筛选和评价方法。中药化学成 分十分复杂，单味药本身就是复杂混合物，而中药传统大多讲究几味甚至几十味药组成的 复方用药，再加以提取过程中有些化学成分相互作用，中药有效部位往往含有众多性质相 似的化合物。同时中药中各组分间可能存在着药效互补及毒性互消等复杂的相互作用，这 不是单一受体模型可以完成的。因此，中药的多成分、多靶点及整体性使中药药效物质基础 评价研究进展缓慢。近年来，从药物吸收的角度模拟人体细胞膜进行药物活性成分分析是 药效物质基础研究的热点。因为药物在体内的生理过程、药物的活性和毒性等都取决于药 物在膜上的分配状况，绝大多数的药物只有进入人体或透过细胞才能表现出活性，发挥作 用。因此，化合物在细胞膜上的通透性对激发药物活性至关重要，研究化合物对细胞膜的通 透性是筛选和评价药物活性可靠而直接的方法。目前应用较广泛的生物色谱法(biochromatography)是20世纪末发展起来的，由 色谱分离技术与生命科学交叉形成的一种药物活性筛选与评价的色谱技术。它是将生物大 分子(酶、受体、载体蛋白)、活性细胞膜(仿生物膜)固定于载体上作为色谱固定相，当中药 提取液流经生物膜色谱柱时，由于固定相能够特异性地与中药活性成分结合，使色谱柱选 择性地保留活性成分，不同物质与膜作用程度的差别表现出在膜上的不同保留性能，根据 这种差别对药物进行生物参数测定、活性筛选和分离分析。以人血清白蛋白和a-酸性糖 蛋白作为固定相的生物色谱法对中药当归、川芎、茵陈、黄芪、赤芍、银杏叶、丹参等中的活 性成分进行了筛选，测定了活性成分血浆蛋白结合率(毛希琴，邹汉法，罗权舟，孔亮，厉欣， 孙乃昌.卵磷脂涂敷生物膜色谱固定相的制备及其稳定性的考察[J].色谱.2001，19 (5) 433 435，孔亮，邹汉法，汪海林，倪坚毅，张玉奎.以人血清白蛋白为固定相的分子生物色谱 分析几种中药活性成分的研究[J].高等学校化学学报.2000，21(1) 36^40)0生物色谱技术存在以下不足(1)作为一种离体的活性成分分析手段，而且生物 膜与中药提取物作用与色谱过程同时进行，难以同时提供生物体内自然吸收和色谱分离过 程所需的条件。(2)生物膜固定相制备和装柱困难，需要特殊的技术和设备，实验的重现性 和精密度不能保证。(3)生物色谱使用了具有Si-OH活性中心的硅胶作为生物膜载体的色 谱柱，不能排除硅胶活性中心对药物非特异性结合的可能性。
发明内容
本发明的目的是提供一种与现有生物色谱技术操作不同并能克服现有生物色谱 技术存在的不足的活性成分筛选方法，以中空纤维生物膜、仿生物膜或生物大分子微萃取 为核心的，高效、快速、简便的中药活性成分的筛选方法。
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解决以上技术问题，本发明所述的一种中药活性筛选方法，包括以下步骤
(1)制备中药或中药复方提取液a ； (2)在提取液a中加入pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液， 在37°C下恒温并搅拌，得溶液b ;(3)将中空纤维管依次用丙酮、甲醇、酸和/或碱、蒸馏水 分别超声清洗5 10min，并用蒸馏水反复清洗后，吹干，将生物大分子、仿生物膜或生物膜注 入中空纤维管内后，将中空纤维管置于溶液b中进行筛选，(4)筛选结束后收集生物大分 子、仿生物膜或生物膜接收相，将与生物大分子、仿生物膜或生物膜特异性结合的中药活性 成分游离出来，进行色谱或色谱/质谱分析，从而筛选出能与生物大分子、仿生物膜或生物 膜特异性结合的活性成分。本发明中空纤维生物膜微蹄选(hollowfiberbiomembrancemicro-screening， HFBMMS)是在中空纤维液相微萃取(hollowfiberliquidphasemicroextraction，HFLPME) 对中药活性成分分析研究基础上结合分子识别原理建立的一种以中空纤维为仿生物膜、生 物膜或生物大分子载体，简便、快捷、高效研究中药活性成分与生物靶分子相互作用的新技 术。HFBMMS是将活性细胞膜、仿生物膜、生物大分子(酶、受体、载体蛋白)注入中空纤维管 内并将其插到中药提取液或中药复方提取液中，在PH3.4、37°C接近于生物体内自然吸收的 条件下，中空纤维管内的仿生物膜或生物大分子对中药活性成分产生特异性结合。用一定 的溶剂或溶液对与仿生物膜、生物膜或生物大分子结合的中药活性成分解析进行色谱或色 谱/质谱分析。中药活性成分在仿生物膜、生物膜或生物大分子上特异性结合的差异表现 在仿生物膜、生物膜或生物大分子上保留行为的差异，继而表现在色谱峰面积、保留时间或 峰个数的差异。利用HFBMMS结合色谱技术测定中药活性成分与仿生物膜、生物膜或生物大 分子结合参数，研究中药活性成分与生物靶分子之间的相互作用；构建以HFBMMS为核心的 中药活性成分筛选方法，此方法同样适用于以中空纤维为载体的活性细胞膜对中药活性成 分进行筛选。HFBMMS方法的主要作用机理研究(1)空白中空纤维对中药活性成分标准品筛选 前后，中空纤维表面扩散层的能谱图和电镜扫描图没有明显变化；(2)含有仿生物膜、生物 膜或生物大分子中空纤维和空白中空纤维分别对中药活性成分标准品进行筛选，前者解析 液有色谱峰或色谱峰较强，后者解析液没有色谱峰或色谱峰很弱。说明中空纤维活性中心 与中药活性成分之间没有非特异性结合或结合能力很弱，中空纤维在HFBMMS中只起生物 膜载体的作用，没有参与中药活性成分的筛选，解析液中得到的活性分子是生物膜或生物 大分子与活性成分作用的结果，活性成分和生物靶分子之间的作用是HFBMMS方法的主要 机理。生物膜或生物大分子载体一中空纤维的选择中空纤维管不仅可以作为容纳和保 护仿生物膜或生物大分子的载体，而且为HFBMMS方法提供了生物靶分子与活性成分作用 的平台。中空纤维壁上的无数小孔不仅可以使药物小分子自由通行，增加仿生物膜、生物膜 或生物大分子与化学成分接触的表面积，而且对中药提取物起到微过滤和纯化的作用，免 去了其他中药活性筛选方法中耗时和繁琐的样品纯化过程。在HFBMMS中选择(1)空白中 空纤维活性成分筛选前后能谱图和电镜扫描图没有变化的中空纤维；(2)空白中空纤维中 解析液没有色谱峰或色谱峰弱的中空纤维。满足以上条件可以选用不含强活性基团的中空 纤维，本发明优选采用聚丙烯、聚砜、聚偏氟乙烯或聚醚砜中空纤维管。HFBMMS方法的重现性和稳定性HFBMMS的重现性和稳定性是中药或中药复方活性成分筛选结果是否可靠的基础。中空纤维活性中心与中药化学成分之间非特异性结合直 接影响筛选结果的重现性和稳定性，是导致生物活性筛选错误的主要因素。为了解决中空 纤维与中药化学成分之间非特异性结合问题，本发明首先对中空纤维进行去活性的惰性处 理，即将中空纤维管依次用丙酮、甲醇、酸和/或碱、蒸馏水分别超声清洗5 10min，并用蒸 馏水反复清洗，吹干，使中空纤维管本身不与中药中的活性成分发生反应，其中所用的酸和 碱是公知的用于清洗及惰性处理的溶液，如盐酸、硝酸、硫酸、醋酸等酸和氢氧化钠、氨水、 甲醇钠等碱。同时，中空纤维管内的生物膜或生物大分子在其表面产生吸附和固载对中空 纤维活性中心有一定的抑制和包封作用。在一定HFBMME和HPLC条件下，多次平行实验，测 定经HFBMME方法筛选后，活性成分标准品回收率、保留时间和峰面积的日内精密度和日间 精密度(RSD)，证明HFBMME方法的重现性和稳定性。HFBMMS特异性结合有效成分的解析本发明中将中空纤维管内生物大分子、生物 膜、仿生物膜上特异结合的中药有效成分游离出来的方法是针对不同的活性成分和不同生 物大分子、生物膜、仿生物膜选用不同的活性成分用不同溶剂或不同PH、极性、离子强度等 的溶液对生物膜或生物大分子上特异性结合的有效成分解析。解析液用高效液相色谱分 析，色谱峰保留时间、峰面积稳定，且灵敏度高的解析条件为HFBMMS有效成分解析或的条 件。利用HFBMMS方法对中药及中药复方提取液中活性成分进行筛选及结构确定通 过HFBMME筛选后色谱峰的峰面积、保留时间及峰数，确定初步筛选出的中药活性成分的种 类和数量，实验的最佳条件由中药活性成分标准品进行筛选试验后确定。对于色谱图中有 标准品的活性成分，采用与标准品保留时间及光谱图对照的方法，确定生物靶分子上保留 的活性成分。对于没有标准品的有效成分，利用色谱/质谱联用分析和文献对照，结合LC/ MS联用技术对未知活性成分做出结构的准确判定，实现中药活性成分的筛选和评价，对发 现新的活性成分具有重要的意义。在本发明的研究中我们发现HFBMMS方法识别有效成分的检测灵敏度是研究生物 膜或生物大分子与中药活性成分相互作用、高通量筛选的关键。发明组在HFBMME的研究中 发现由于中药或中药复方提取液基质复杂，而且活性成分含量较低，活性成分与生物靶分 子作用后给出的HPLC-UV信号较弱，特别是那些微量活性成分或与生物靶分子结合能力弱 的活性成分信号更弱，甚至于难于检测。为了提高中空纤维微量生物膜或生物大分子对识 别活性成分的检测灵敏度，我们可以(1)根据中药中活性成分的性质选择孔径小、壁厚的中 空纤维以增加中空纤维的净化能力，降低检测限；(2)借鉴现有技术HFLPME中提高相比(中 药提取液体积与有机接收相体积的比值)可以提高富集倍数的性质；(3)对筛选出已知结构 的活性成分使用具有高灵敏度检测器(荧光、电化学等检测器)的色谱仪进行分析，以提高 HFBMMS对中药活性成分识别的检测灵敏度。与现有技术相比本发明具有如下有益效果(1)不必制备生物膜固定相并进行装 柱。因此，不需要特殊的技术和设备，排除了硅胶中Si-OH对药物的非特异性结合，操作简 单，成本低廉，易于掌握。(2)活性筛选和色谱过程分别进行，可满足生物学和色谱学要求的 最适合或最佳条件；中药提取物不经分离直接与生物膜作用，较好的反映中药多成分、多靶 点协同作用的特性，提高和保证了中药活性成分筛选的可靠性和高效性。(3)活性筛选和样 品净化同时完成，免去了其他中药活性筛选法所必需的样品前处理过程，提高了对中药活
5性成分筛选和结构确定的效率。(4)中药提取物不经分离直接与生物膜或生物大分子作用， 能较好的反映中药多成分、多靶点、协同作用的特性，对揭示体内真正起效的中药效应物质 基础具有重要的意义。
图1为中药活性成分筛选装置。图中，1-微量注射器，2-微量注射器，3-玻璃小瓶，4-中空纤维，5-仿生物膜、生物 膜或生物大分子，6-搅拌子，7-恒温搅拌器。图2为HFBMMS研究银杏提取液中黄酮类活性成分与生物膜或生物大分子相互作 用色谱图。图中，A-脂质体中空纤维筛选空白液，A'-牛血清白蛋白中空纤维筛选空白液， B-空白中空纤维筛选样品液，C-脂质体中空纤维筛选样品液，D-牛血清白蛋白中空纤维筛 选样品液
其中，(1)脂质体6_杨梅素，7-槲皮素，8-山柰素，9-异鼠李素；(2)牛血清白蛋白 8-槲皮素，10-山柰素，11-异鼠李素。图3为HFBMMS研究虎杖提取液中蒽醌类活性成分与生物膜或生物大分子相互作 用色谱图。图中，A-脂质体中空纤维筛选空白液，A'-牛血清白蛋白中空纤维筛选空白液， B-空白中空纤维筛选样品液，C-脂质体中空纤维筛选样品液，D-牛血清白蛋白中空纤维筛 选样品液
其中，(1)脂质体3_芦荟大黄素，4-大黄素；(2)牛血清白蛋白3_芦荟大黄素，4-大黄素。图4为HFBMMS研究决明子提取液中蒽醌类活性成分与生物膜或生物大分子相互 作用色谱图。图中，A-脂质体中空纤维筛选空白液，A'-牛血清白蛋白中空纤维筛选空白液， B-空白中空纤维筛选样品液，C-脂质体中空纤维筛选样品液，D-牛血清白蛋白中空纤维筛 选样品液
其中，(1)脂质体1-芦荟大黄素，3-大黄酸，5-大黄酚；(2 )牛血清白蛋白1-芦荟大 黄素，3-大黄酸，5-大黄酚。图5为HFBMMS研究何首乌提取液中蒽醌类活性成分与生物膜或生物大分子相互 作用色谱图。图中，A-脂质体中空纤维筛选空白液，A'-牛血清白蛋白中空纤维筛选空白液， B-空白中空纤维筛选样品液，C-脂质体中空纤维筛选样品液，D-牛血清白蛋白中空纤维筛 选样品液
其中，(1)脂质体2_芦荟大黄素，3-大黄素，4-大黄素甲醚；(2)牛血清白蛋白2_芦 荟大黄素，3-大黄素，4-大黄素甲醚。
具体实施例方式结合下列实验对本发明做进一步说明，其实验方法为材料和试剂中空纤维(天津膜天膜工程技术有限公司)，中药标准对照品(中国药品生 物制品检定所)，牛血清蛋白质(上海天呈科技有限公司)，卵磷脂。实验用水为二次蒸馏水， 其它试剂均为分析纯。仪器AgilentTechnologiesl200Series高效液相色谱仪，自制中空纤维液相 微筛选装置。实验步骤如图1所示，取10ml的玻璃小瓶，加入5ml —定浓度的中药活性成分 标准品或中药提取物PH7. 4的磷酸盐缓冲溶液(供相)，放入搅拌子并固定于磁力搅拌器上， 在37°C下恒温。将一定长度的中空纤维(即中空纤维管)经惰性处理后，洗净、吹干。用微 量注射器将生物大分子(酶、受体、载体蛋白)或仿生物膜注入中空纤维管内并将其弯曲成U 形置于供相小瓶中。在模拟生物膜自然吸收的条件下，仿生物膜或生物大分子与活性成分 标准品或中药提取液中化学成分相互作用，筛选出能与生物膜或生物大分子作用的活性成 分。将生物膜或生物大分子上特异性结合的活性成分解析或将生物膜或生物大分子破碎， 在最佳的色谱条件下进行色谱或色谱/质谱分析。以下实施例为发明组以黄酮类、蒽醌类活性成分标准品为筛选对象，微量牛血清 白蛋白和脂质体仿生物膜为靶分子的HFBMMS方法的稳定性和重现性进行了研究，建立银 杏、槐米、侧柏提取液中黄酮类活性成分，虎杖、决明子、制首乌提取液中蒽醌类活性成分的 HFBMMS筛选方法。实施例1
1.银杏药材中黄酮类化学成分的提取 取干燥药材，研细，过60目筛，精密称取银杏3g，置具塞锥形瓶中加甲醇20ml，称重，浸 泡lOmin，超声提取(功率100W) 30min，放至室温，用甲醇补足减失的重量。再加入25%的 HC15ml，回流30min，放冷，过滤，用甲醇定容至25ml。4°C冰箱保存，待用。2.中空纤维生物膜液相微筛选研究银杏提取液中黄酮类活性成分
吸取银杏中药提取液0. 3ml于2ml洗净吹干的小玻璃管中，再加入pH7. 4的磷酸缓 冲溶液1.2ml，使溶液体积为1.5ml。将三根10cm长的聚偏氟乙烯中空纤维(内径/外径 0. 5/0. 8mm,孔径为0. 2 y m)用丙酮、甲醇、硝酸、氢氧化钠、蒸馏水分别超声清洗5 10min， 并用蒸馏水反复清洗吹干。处理后的中空纤维浸入脂质体溶液(0.01g/ml)或蛋白质溶液 (0. lg/ml)中lmin，待其孔隙充满生物膜后取出，将纤维表面的脂质体溶液或蛋白质溶液 擦干并弯曲为U形，用微量注射器将20 yl脂质体溶液或蛋白质溶液注入中空纤维管内， 将U形中空纤维管浸入样品溶液中。开启磁力搅拌器，在恒温;TC，1500rPm搅拌下，筛选 30min，筛选结束后收集接收相于1ml小EP管中，加入50iU甲醇，在12000转离心20min， 吸取上清液注入HPLC分析。利用HFBMMS-HPLC法对银杏提取液与脂质体和牛血清白蛋白有结合的成分进行 了筛选见图2。由图2发现能与脂质体结合且有明显保留的有9个成分，与牛血清白蛋白结 合且有明显保留的有11个成分。对银杏中有保留的4个已知活性成分杨梅素、槲皮素、山 柰素和异鼠李素通过保留时间对照进行了结构初步鉴定，对于色谱图中出现的没有标准品 的活性成分，可以进行色谱/质谱联用分析和文献对照，确定他们的可能结构。实施例2
1.虎杖药材中蒽醌类化学成分的提取
7将生药虎杖捣碎，精密称定粉末(过三号筛)0. 5g，精密加入三氯甲烷25ml和2. 5mol/L 硫酸溶液20ml，称定重量，置80°C水浴中加入回流2小时，冷却至室温，再称定重量，用三氯 甲烷补足减失的重量，摇勻。分取三氯甲烷液，精密量取20ml，用旋蒸仪在40°C下蒸干，残 渣加甲醇溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，取续滤液，即得。4°C冰箱保存，待用。2.中空纤维生物膜液相微筛选研究虎杖提取液中蒽醌类活性成分
取虎杖提取液2ml于5ml洗净吹干的小玻璃管中，再加入pH7. 4的磷酸缓冲溶液3ml， 使溶液体积为5ml。将三根10cm长的聚砜中空纤维(内径/外径0. 8/1. 2_皿，孔径为 0. 2 u m)用丙酮、甲醇、硝酸、氢氧化钠、蒸馏水分别超声清洗5 10min，并用蒸馏水反复清洗 吹干。处理后的中空纤维浸入脂质体溶液0. 01g/ml或蛋白质溶液0. lg/ml中lmin，待其 孔隙充满生物膜后取出，将纤维表面逸出的脂质体溶液或蛋白质溶液擦干并弯曲为U形， 用微量注射器将20 u 1脂质体溶液或蛋白质溶液注入中空纤维管内，将U形中空纤维管浸 入样品溶液中。开启磁力搅拌器，在恒温37°C，900rpm搅拌下，筛选40min，筛选结束后收 集接收相于1ml小EP管中，加入50iU甲醇，在12000转离心20min，吸取上清液注入HPLC 分析。利用HFBMMS-HPLC法对虎杖提取液与脂质体和牛血清白蛋白有结合的成分进行 了筛选见图3。由图3发现虎杖提取液能与脂质体或牛血清白蛋白结合且有明显保留的有 5个成分。有保留的2个已知活性成分3-芦荟大黄素，4-大黄素通过保留时间对照进行了 结构初步鉴定，对于色谱图中出现的没有标准品的活性成分，可以进行色谱/质谱联用分 析和文献对照，确定他们的可能结构。实施例3
1.决明子药材中蒽醌类化学成分的提取 将生药决明子捣碎，精密称定粉末(过三号筛)0. 5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25ml，称定重量，置水浴上加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇 勻，滤过。精密量取续滤液5ml，加10%盐酸溶液20ml，置水浴上加热回流1小时，立即冷却， 用三氯甲烷提取四次，每次20ml，合并三氯甲烷液，用旋蒸仪在40°C下蒸干，残渣用甲醇溶 解，转移至25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇勻，取续滤液，即得。4°C冰箱保存，待用。2.中空纤维生物膜液相微筛选研究决明子提取液中蒽醌类活性成分
取决明子提取液2ml于5ml洗净吹干的小玻璃管中，再加入pH7. 4的磷酸缓冲溶液 3ml，使溶液体积为5ml。将三根10cm长的聚丙烯中空纤维(内径/外径0. 6/1. Omm，孔径 为0. 2 y m)用丙酮、甲醇、硝酸、氢氧化钠、蒸馏水分别超声清洗5 10min，并用蒸馏水反复 清洗吹干。处理后的中空纤维浸入脂质体溶液0.01g/ml或蛋白质溶液0. lg/ml中lmin， 待其孔隙充满生物膜后取出，将纤维表面逸出的脂质体溶液或蛋白质溶液擦干并弯曲为U 形，用微量注射器将20 yl脂质体溶液或蛋白质溶液注入中空纤维管内，将U形中空纤维管 浸入样品溶液中。开启磁力搅拌器，在恒温37°C，900rpm搅拌下，筛选40min，筛选结束后收 集接收相于1ml小EP管中，加入50iU甲醇，在12000转离心20min，吸取上清液注入HPLC 分析。利用HFBMMS-HPLC法对决明子提取液与脂质体和牛血清白蛋白有结合的成分进 行了筛选见图4。由图4发现决明子提取液能与脂质体结合且有明显保留的有6个成分，与牛血清白蛋白结合且有明显保留的有5个成分。其中有保留的3个已知活性成分1-芦荟大 黄素，3-大黄酸，5-大黄酚通过保留时间对照进行了结构初步鉴定，对于色谱图中出现的 没有标准品的活性成分，可以进行色谱/质谱联用分析和文献对照，确定他们的可能结构。实施例4
1.制首乌药材中蒽醌类化学成分的提取 将生药制首乌捣碎，精密称定制首乌粉末(过三号筛)0. 5g，置具塞锥形瓶中，精密加 入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇勻，滤 过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，用旋蒸仪在40°C下蒸干，加8%盐酸溶液10ml，超声处 理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤 容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取三次，每次10ml，合并三氯 甲烷液，用旋蒸仪在40°C下蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇 勻，取续滤液，即得。4°C冰箱保存，待用。2.中空纤维生物膜液相微筛选研究制首乌提取液中蒽醌类活性成分
取制首乌提取液2ml于5ml洗净吹干的小玻璃管中，再加入pH7. 4的磷酸缓冲溶液 3ml，使溶液体积为5ml。将三根10cm长的聚醚砜中空纤维(内径/外径0. 8/1. 32mm，孔径 为0. 2 y m)用丙酮、甲醇、硝酸、氢氧化钠、蒸馏水分别超声清洗5 10min，并用蒸馏水反复 清洗吹干。处理后的中空纤维浸入脂质体溶液0. 01g/ml或蛋白质溶液0. lg/ml中lmin， 待其孔隙充满生物膜后取出，将纤维表面逸出的脂质体溶液或蛋白质溶液擦干并弯曲为U 形，用微量注射器将20 yl脂质体溶液或蛋白质溶液注入中空纤维管内，将U形中空纤维管 浸入样品溶液中。开启磁力搅拌器，在恒温37°C，900rpm搅拌下，筛选40min，筛选结束后收 集接收相于1ml小EP管中，加入50iU甲醇，在12000转离心20min，吸取上清液注入HPLC 分析。利用HFBMMS-HPLC法对制首乌提取液与脂质体和牛血清白蛋白有结合的成分 进行了筛选见图5。由图5发现制首乌提取液能与脂质体或牛血清白蛋白结合且有明显保 留的有4个成分。其中有保留的3个已知活性成分2-芦荟大黄素，3-大黄素，4-大黄素甲 醚通过保留时间对照进行了结构初步鉴定，对于色谱图中出现的没有标准品的活性成分， 正在进行色谱/质谱联用分析和文献对照，确定他们的可能结构。
权利要求
一种中药活性筛选方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备中药或中药复方提取液a；(2)在提取液a中加入pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，得溶液b；(3)将中空纤维管依次用丙酮、甲醇、酸和/或碱、蒸馏水分别超声清洗5~10min，并用蒸馏水反复清洗后，吹干，将生物大分子、仿生物膜或生物膜注入中空纤维管内后，将中空纤维管置于溶液b中在37℃下恒温并搅拌，进行筛选，(4)筛选结束后收集生物大分子、仿生物膜或生物膜接收相，将与生物大分子、仿生物膜或生物膜特异性结合的中药活性成分游离出来，进行色谱或色谱/质谱分析，从而筛选出能与生物大分子、仿生物膜或生物膜特异性结合的活性成分。
2.根据权利要求1所述的一种中药活性筛选方法，其特征在于所述的中药活性成分 是黄酮类和蒽醌类。
3.根据权利要求2所述的一种中药活性筛选方法，其特征在于步骤(4)中，筛选结 束后将中药活性成分游离出来的方法是收集接收相于Iml小EP管中，加入50μ 1甲醇，在 12000转离心20min，吸取上清液后注入HPLC分析。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种中药活性筛选方法，其特征在于所述的中空 纤维管采用聚偏氟乙烯，聚丙烯、聚砜、聚醚砜中空纤维管。
5.根据权利要求4所述的一种中药活性筛选方法，其特征在于选择的中空纤维管孔 径为0. 2 μ m。
全文摘要
本发明提供一种高效、快速、简便的中药活性筛选方法，首先制备中药或中药复方提取液a，在提取液a中加入pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，在37℃下恒温并搅拌，得溶液b；将中空纤维管进行惰性处理后，将生物大分子、仿生物膜或生物膜注入中空纤维管内后，将中空纤维管置于溶液b中进行筛选，筛选结束后收集接收相，将与生物大分子、仿生物膜或生物膜特异性结合的中药活性成分游离出来，进行色谱或色谱/质谱分析，从而筛选出能与生物大分子、仿生物膜或生物膜特异性结合的活性成分。本方法提高和保证了中药活性成分筛选的可靠性和高效性，对揭示体内真正起效的中药效应物质基础具有重要的意义，同时具有操作简单、快速的特点。
文档编号A61K36/704GK101852787SQ20101020498
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者张茜, 田杰, 白小红, 陈璇 申请人:山西医科大学