专利名称：登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒及其制备方法，本发明还涉及登 革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒在作为疫苗研究方面的用途。
背景技术：
登革病毒(Dengue virus, DV)和流行性乙型脑炎病毒(国际上称为日本脑炎 病毒，Japanese encephalitis virus，JEV)均为黄病毒科的单股正链RNA病毒，以蚊虫 为媒介进行传播。DV所致的登革热(Dengue fever，DF)、登革出血热和登革休克综合症 (Denguehemorrhagic fever/Dengue shock syndrome, DHF/DSS)广泛流行于热带禾口亚热 带地区，全球有25 30亿人生活在流行区内，每年有1亿以上的人遭受感染，其中约100 万人发展成严重的 DHF/DSS，死亡率 5 20% (Chaturvedi UC. J Biosci. 2008 ；33 (4) 429-441)。我国海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区都是登革热的重点流行区域，多 次发生DF、DHF/DSS的爆发流行，给流行区人们的健康带来严重影响。JEV所致的日本脑炎， 也称流行性乙型脑炎(简称乙脑)主要流行于亚洲，威胁着约30亿人的健康，每年约5万 人感染，死亡率29%，得过乙脑的幸存者多有神经和精神后遗症，我国是乙脑流行的重点区 域(Wang H,et al. Jpn J Infect Dis. 2009 ；62(3) :331_336)。目前，对DV感染性疾病仍无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世。对 乙脑的预防虽有灭活疫苗和减毒活疫苗，但接种后易发生播散性脑脊髓膜炎(Acute Disseminated EncephaloMyelitis,ADEM)和过敏反应，减毒活疫苗接种更是存在病毒活力 增强致病风险。现有技术中的疫苗包括以下几种灭活疫苗如第一个乙脑灭活疫苗BIKEN/JE VAX 是由1935年首次分离自日本 的Nakayama流行毒株经鼠脑培养、福尔马林灭活后制成的，使用半个多世纪后，保护力日 趋低下，且ADEM等毒副作用日益明显。减毒活疫苗我国1988年自行研制的SA14-14-2减毒株在乙脑的预防上发挥了极 大作用，人群保护率60-96%，据2005年WHO统计，该减毒疫苗的使用超过全球乙脑疫苗市 场份额的50%，但目前国际上对其安全性仍存在争议，尚未被美国和欧洲等接受。美国00807995公开了一种减毒登革病毒的疫苗组合物。该减毒病毒通过在P D K 细胞中连续传代得到。施用减毒的登革-1、登革_2、登革-3和登革-4病毒可刺激个体的 免疫系统以诱导抵御所有四种登革病毒血清型的保护作用。由于减毒病毒存在独立增强制 备的风险，因而限制其应用。日本99801764提供了一种比常规疫苗高约2-10倍效价的新的灭活病毒颗粒以及 增强免疫原，及其制备方法。但仅用作由日本脑炎病毒群引起的感染性疾病的诊断试剂。Beasley 等(PLoS Pathog. 2010 ；6 (2) :el000790)公开了一种以黄热病病毒 YFV-17D为载体的乙脑重组疫苗，但是由于携带了重组的病毒特异性基因，在体内存在活力 增强的风险，因此限制了该疫苗的适用范围。
基因工程亚单位疫苗目前虽还没有登革热疫苗上市，但印度(Etemad B， et al. 2008)和我国学者(Chen S，et al. 2007)将4种血清型登革病毒E蛋白的特定 区域融合在一起，构建成4价重组蛋白疫苗，在动物水平有一定保护作用，中和滴度为 1 47-1 588，对各型DV的保护力差异较大，相比较而言，亚单位疫苗的保护效果不如颗 粒性疫苗。古巴200680051377公开了利用E蛋白的表面保守区域开发广谱抗病毒分子(一 种嵌合蛋白质)以用于预防和/或治疗由登革病毒1-4和其他黄病毒引起的感染。但该嵌 合蛋白缺乏病毒样的颗粒结构，效果不如完整病毒颗粒。假病毒疫苗假病毒(pseudovirus)为不含核酸的病毒空壳结构，但保留了天然 病毒颗粒的空间构象，不仅可用于模拟天然病毒对宿主的感染，探索病毒侵入敏感细胞的 机制，同时VLPs由病毒主要结构蛋白组成，含病毒特异的抗原表位，能够刺激机体免疫系 统产生很强的免疫应答，是很有发展前景的、安全的候选疫苗。Merck公司研制的HPV6、11、 16、18四价VLP Gardasil疫苗(预防宫颈癌)已于2006年6月获得美国FDA许可，成为第 一个投放市场应用的VLPs疫苗，也标示着未来疫苗的发展方向。综上所述，本领域急切需求安全性好，免疫效价高的优质疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种免疫效果好、安全、适于产业化生产的登革病毒-日 本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗及其制备方法。该疫苗嵌合了登革病毒和日本脑炎病毒的抗原 组分，可以刺激机体产生免疫应答，进而预防登革病毒和/或日本脑炎病毒感染性疾病。在本发明的第一方面，提供了 一种登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表 达质粒，所述的表达质粒中插入了下列元件a)黄病毒属信号肽编码序列；b)全部登革病毒的preM/M编码区；c)登革病毒E蛋白前35个氨基酸的编码区；d)日本脑炎病毒E蛋白后120个氨基酸的编码。在另一个优选方案中，所述的表达质粒包括pcDNA3. 1、pcDNA6. 0、pCIneo (+)、 pReceiver 等。在另一个优选方案中，所述的表达质粒中插入元件按a-b-c-d的顺序串联而成。在另一个优选方案中，所述的黄病毒属信号肽编码序列选自SEQ ID NO :1所示的 编码日本脑炎病毒preM/M信号肽的核苷酸序列，SEQ ID NO :3所示的编码II型登革病毒 preM/M信号肽的核苷酸序列、及SEQ ID NO 4所示的编码西尼罗河病毒preM/M信号肽的 核苷酸序列。在另一个优选方案中，所述的登革病毒为登革病毒血清型I、II、III或IV型。在本发明的第二方面，提供了一种嵌合假病毒颗粒，它由权利要求1所述的重组 表达质粒转染靶细胞后表达形成，不含任何核苷酸。所述的靶细胞包括BHK21、293、239T、 Cos、Hela等来源于真核生物的传代细胞系。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合，它含有上述重组表达质粒表达的假 病毒颗粒和药学上可接受的佐剂或载体。
在本发明的第四方面，提供了本发明的重组假病毒颗粒的用途，用于制备预防登 革热和/或日本脑炎的药物。在本发明的第五方面，提供了一种制备嵌合假病毒颗粒的方法，包括以下步骤1)将权利要求1所述的含有登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白编码序列的重组 表达质粒导入靶细胞；2)当所述的靶细胞表达登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白时，用质粒携带的抗性 基因对应的抗生素对转染细胞进行筛选，获得稳定转染的细胞克隆；3)培养稳定转染的细胞，从而产生登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒；4)回收嵌合假病毒颗粒。本发明提供了包含本发明所述的重组嵌合假病毒颗粒的各种组合物，包括药用组 合物，尤其是疫苗组合物。药物组合本发明所述的药用组合物可以包含实际使用时所选用的药学上可以接受的缓冲 剂，也包含用于预定用途的其它物质。本领域已有多种缓冲剂适用于预定用途，本领域的 技术人员都善于选择的缓冲剂。在一些实例中，该药用组合可以含有药学上可接受的保湿 剂，药学上可接受的各种保湿剂在多种公开出版物都有叙述，包括如中华人民共和国药典 (2005 版)。所述的药用组合物可制备出各种剂型，如注射剂、片剂、丸剂、胶囊、喷雾剂等。适 用于局部使用和口服的药用级别的有机或无机载体或稀释剂。本领域已知的稀释剂包括水 性介质、植物性和动物性油脂。还可用稳定剂、乳化剂、维持PH的各种缓冲剂和皮肤渗透增 强剂等作为辅助材料。当本发明用作疫苗时，重组的嵌合假病毒可采用多种方法进行配制。通常情况下， 按本领域熟知的各种方法，用药学上可以接受的载体或运载体配制本发明的疫苗。合适的 药用载体包括无菌生理盐水，也可用其它无菌的水性和非水性的等渗注射液，是本领域技 术人员熟知的药学上可接受的载体。配制本发明的疫苗组合物时还可含有其它成分，如佐 剂、稳定剂、PH调节剂、防腐剂等。这些成分都是疫苗领域的技术人员所熟知的。佐剂包括 (但不限于)铝盐佐剂、皂苷佐剂、Cerbu佐剂(Cerbu Biotechnik Gmbh,Gaiberg,Germany) 等。稳定剂包括(但不限于)精氨酸、乙基纤维素、多元醇、氨基酸、无机盐、PEG等。给药途径与剂量当用作疫苗时，可用本领域技术人员熟知的方法将本发明的重组登革病毒和日本 脑炎病毒嵌合假病毒颗粒施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径或模拟病毒感 染的途径施用这些疫苗。采用疫苗组合物的形式时，除含有重组的嵌合病毒外，还可包括药 学上可以接受的载体、佐剂、稳定剂、PH调节剂等。给药常规与途径包括肌肉注射、皮下注射、滴鼻、静脉注射、经口服等，如果需要 也可采用组合给药途径。疫苗组合物的给用剂量可以单剂量，也可多剂量，且可给予加强剂 量以维持被施用个体的免疫力。在所选用的给药途径中，应以“有效剂量”给予登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病 毒颗粒的量，足以引发被施用个体的免疫应答，能有效保护被施用个体，抵抗登革病毒和/ 或日本脑炎病毒的感染。
所述的有效剂量，是指在疫苗组合物中所选用的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假 病毒颗粒的量是按可引发个体免疫保护性应答而无明显的副作用的量确定。以疫苗组分中 嵌合假病毒颗粒蛋白质为基础计算有效剂量，通常包括给予约1-500μ g蛋白质，较佳地为 1-200 μ g，更加地10-100 μ g。可用包括观察对象中的抗体滴度和其它反应来确定具体疫苗 的最佳用量，通过检测疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量，施用佐剂或免疫 刺激剂可提高本发明假病毒颗粒的免疫应答，这些都是本领域的技术人员所熟知的。本发明人经过深入的研究，建立了登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗制备 技术，并成功构建了安全性好、免疫效价高的抗登革热病毒和/或日本脑炎病毒嵌合假病 毒疫苗，在此基础上完成了本发明。和现有技术相比，本发明具有以下优点1.提高了免疫的有效性1)嵌合假病毒表面既拥有登革病毒E蛋白的中和表位，又含有日本脑炎病毒E蛋 白的保护性抗原区，免疫宿主个体后可以产生对登革病毒和日本脑炎病毒的免疫活性，免 疫效能上优于单一组分疫苗。2)由于假病毒的组织亲嗜性和感染过程与真病毒相同，因此可以模拟天然病毒的 早期感染过程，有效刺激机体的免疫应答。2.提高了疫苗的安全性。本发明的嵌合假病毒没有病毒特异的核酸，因而不具有复制能力，也不会引起登 革病毒和日本脑炎病毒导致的特异性细胞病变，可以最大程度地降低疫苗使用的风险。3.生产成本低。在构建了重组表达质粒后，转化靶细胞并筛选稳定的细胞克隆。在生产时，只需要 培养稳定转染的细胞克隆即可产生大量的假病毒颗粒，从而缩短了疫苗生产流程，提高了 疫苗的生产效率，产品生产成本降低。下面结合具体实施实例，进一步阐明本发明。应当指出的是，这些实例仅用于进一 步阐明本发明，而不用于限制本发明的适用范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版，科学出版社，2002)中所 述的条件，或按试剂制造产家所建议的条件进行。
图1为嵌合假病毒重组表达质粒制备的过程示意图。图2为稳定转染克隆的筛选过程示意图。图3为抗G418克隆的Western blot鉴定结果，图中可见11个克隆中有4个克隆 能表达特异性抗原，它们分别是B8，Bll, C4和C7克隆。
具体实施例方式申请人:通过大量实验，发现本发明登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的构建必 须满足下列条件1)必须有完整的preM/M结构蛋白。黄病毒属病毒的preM/M结构蛋白为一种基质 蛋白，在病毒颗粒的形成中有重要作用，任何对preM/M结构蛋白的缺失或移码突变，形成 假病毒的效率会显著下降。
2)删除登革病毒E蛋白的后99个氨基酸，相应的编码序列是登革病毒E蛋白的后 297个核苷酸，因为这段序列中含有一个包膜锚定区(氨基酸452-491)和一个茎环区(氨 基酸395-450)，能使表达的E蛋白滞留于内质网上，降低了分泌。虽然删除小于99个氨基 酸(如79，59，39，19个)仍可形成假病毒颗粒，但假病毒颗粒的形成效率逐渐下降，因此优 选的范围是删除E蛋白的后79-99个氨基酸，更佳地删除99个。3)必须保留日本脑炎病毒E蛋白的后198个氨基酸，相应的编码序列是日本脑炎 病毒E蛋白的后594个核苷酸，因为该区域内含有E蛋白结合靶细胞的区域，能刺激机体产 生有效的免疫应答。可用于本发明的登革病毒没有特别限制，可以是4种血清亚型中的任何一种，4种 亚型的基因组序列登录号如下I 型U88536II 型U87411III 型AY099336IV 型AF326825可用于本发明的日本脑炎病毒基因组序列登录号为NC_001437. 1在制备本发明的嵌合假病毒颗粒时，通常按以下步骤进行1.构建重组表达质粒这可通过常规PCR扩增、连接、转化技术实现(见实施例1)。2.筛选稳定转染的细胞克隆(见实施例2)在获得重组表达质粒后，一种常规的方法是将其引入靶细胞，培养转染细胞，一段 时间(如48小时)后，收集培养上清，超速离心得到嵌合假病毒。另一种优选的方法是采 用质粒携带的抗性基因所对应的抗生素(如G418)筛选质粒转染后的细胞，获得有稳定抗 性的细胞克隆，再培养该克隆一段时间(如48小时)后，收集培养上清，离心得到嵌合假病
毒颗粒。实施例1构建嵌合假病毒重组表达质粒1.黄病毒信号肽编码序列(S片段)的制备(1)根据SEQ NO 所示的日本脑炎病毒信号肽序列(Davis BS etal, J Virol 2001，75 (9) 4040-4047)设计一对寡核苷酸片段S1 :ATAGGCTAGCGCCATGGGCAAGAGATCGGCG GGCTCAATCATGTGGCTCGCAAGCTTGG(SEQID No 5 )， S2 :GCG TGTGGTTAAATGGAATGCTCCTGCGTAAGCTATGACAACTGCCAAGCTT GCGAGC (SEQ ID No:6)，由大连 TakaRa公司DNA合成部合成；(2)引物延伸法合成S片段(Si链的5'端有EheI酶切位点)因Si，S2寡核苷 酸片段的3'端设计了 14bp的互补序列，即可采用引物延伸法生成S片段，该片段编码的氨 基酸序列如SEQ ID No:2所示。具体操作为将合成的寡核苷酸片段用无菌蒸馏水配制成 ΙΟΟμΜ 浓度，各取 2μ 1 置于一 0. 25mlEp 管中，补加 PrimerStar DNA 聚合酶(TakaRa) 1 μ 1， dNTPs (TakaRa, 2. 5mM/each) L 5 μ 1，5 X buffer 5 μ 1，补充 ddH20 至 25 μ 1。PCR 扩增仪 (BioRad)上按94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 30秒扩增2个循环，1. 2%的琼脂糖(上海生 工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收目的片段，得到黄病毒信号肽编码序列 (S片段)
2.登革病毒II型preM/M蛋白编码序列的PCR扩增(1)所述的登革病毒II型是GenBank登录号为U87411的病毒株，用SV Total RNA Isolation试剂盒(Promega)，按试剂盒说明书提取登革病毒RNA，用RT-PCR方 法(参见萨姆布鲁克等著，黄培堂等译《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社， 2002年)(扩增preM/M蛋白(SEQ ID No 9)编码序列(M片段)，所用DNA引物如下 Ml, TTCCATTTAACCACACGCAACGGAGAA(SEQ ID No 7)禾P M2，TGTCATTGAAGGAGCGACAGCT GTCAGTA (SEQ ID No 8)，引物由大连 TakaRa 合成；(2)逆转录逆转录(RT)试剂盒为Promega产品，以病毒RNA为模板，以下游M2为 引物进行RT得到cDNA第一链，RT反应如下IOXRT buffer4μ 1MgCl2 (25mM)2 μ 1dNTP (25mM/each)1 μ 1弓丨物 Μ2 (10 μ Μ)1 μ 1RNasin (40 μ g/ml)1 μ 1逆转录酶(AMV，IOU/μ 1)1 μ 1Total RNA (0· 6 μ g/ μ 1)10 μ 1RNase free H2O20 μ 1混勻后42°C水浴1小时，然后75°C 10分钟，以灭活逆转录酶。(3)PCR扩增以⑵中RT得到的cDNA第一链为模板，用M1-M2引物进行PCR扩增， 反应如下RT反应混合物(cDNA)1 μ 1
5XPCR buffer (TaKaRa)10 μ 1
MgCl2 (25mM) (TaKaRa)5 μ 1
dNTP(25mM/each)(TaKaRa)1 μ 1
引物 Ml (10 μ Μ)1 μ 1
弓丨物Μ2 (10 μ Μ)1 μ 1
PrimerStar(10U/μ 1)1 μ 1
dH2030 μ 1
total50 μ 1
混勻后，置PCR扩增仪(BioRad)上按94°C 30秒，52°C 30秒，72°C 60秒扩增25
个循环，1.2%的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收目的片 段；3.登革病毒II型E蛋白编码序列的PCR扩增用总RNA提取试剂盒提取登革病毒基因组RNA，用RT-PCR方法扩增E蛋白(SEQ ID No: 12)的编码序列(E 片段)，所用 DNA 引物如下为 El =AGC TGTCGCTCCTTCAATGACA (SEQ ID No 10)和 E2 :GCGGGAATTCAC TTCCTTTCTTGAACCAGTTAAG(SEQ IDNo :11)，E2 的 5 ‘端有 EcoRI酶切位点。逆转录和PCR扩增按本实施例2的步骤2进行，不同在于对引物进行了更换。4. SME片段的PCR扩增与克隆
(1)扩增利用S、M、E片段间的互补序列，在一 0. 25ml的PCR反应管中各加入S、 M、E片段InM，以S1/E2为引物进行PCR扩增，扩增条件如下5XPCR buffer (TaKaRa)10 μ 1
MgCl2 (25mM) (TaKaRa)5 μ 1
S片段(ImM)1 μ 1
M片段(ImM)1 μ 1
E片段(ImM)1 μ 1
dNTP(25mM/each)(TaKaRa)2μ 1
引物 Sl(IOyM)1 μ 1
引物 Ε2(10μΜ)1 μ 1
PrimerStar(10U/μ 1)1 μ 1
dH2027 μ 1
total50 μ 1
混勻后，置PCR扩增仪(BioRad)上按94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 3分钟扩增25
个循环，1.2%的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa胶回收试剂盒说明书回收SME片 段；(2)酶切与连接回收的SME片段经EheI (TaKaRa) /EcoRI (TaKaRa)双酶切，插入 真核表达质粒 pCIneo(+) (Promega)的 Ehel/EcoRI 位点；酶切反应SME片段(45ng/y 1)10 μ 1IOXbuffer B(TakaRa)5μ 1EheI (5U/μ 1)2μ 1EcoRI (5U/μ 1)2μ 1dH2031 μ 1total50 μ 1混勻后置37°C水浴反应4小时，1. 2%的琼脂糖(上海生工)凝胶电泳，按TakaRa 胶回收试剂盒说明书回收双酶切后的SME片段；pCI-neo (Promega)质粒的双酶切反应体系同上，回收质粒；连接反应10 X ligation buffer (Promega)1. 5μ 1pCI-neo (Ehel/EcoRI 酶切，25ng/ μ 1)1 μ 1SME 片段(Ehel/EcoRI 酶切，68ng/ μ 1)5 μ 1Τ4 ligase(Promega，IOU/μ 1)1 μ 1dH206. 5 μ 1total15 μ 1混勻后置16°C水浴反应16小时，750C 5min灭活连接酶；(3)转化大肠埃希菌DH5CI感受态的制备参见分子克隆实验指南(第三版，科学出版社， 2002)，取4μ 1连接产物于100 μ 1 DH5a感受态细胞中，混勻，冰浴中30min，42°C休克90 秒，置冰浴中2min，将混合物加入900 μ 1 LB培养基(TakaRa)中，37°C振荡培养1小时，涂 布AMP (100 μ g/ml，西南制约)轻质平板，37°C培养18小时，挑选AMP抗性菌落进行质粒提取与鉴定，序列正确者命名为pCI-SME。5.日本脑炎病毒E蛋白III区编码序列的PCR扩增所述的日本脑炎病毒为Beijing-I株(GenBank登录号为NC_001437. 1)，用总RNA 提取试剂盒提取日本脑炎病毒Beijing-I株RNA,用RT-PCR方法(参见萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)扩增E蛋白III区(SEQID No 15)的编码序列(J 片段)，所用 DNA 引物如下为 Jl GGGCGAATTCATGTGTACAGAAAAATTCTC GTTC(SEQ ID No 13)和 J2 :GACCTCTAGATCAAGCATGCACATTGGTCGCTAA (SEQID No :14)，Jl 引 物含EcoRI位点，J2引物含有XhoI位点。逆转录和PCR扩增参见本实施例2的方案进行。6.嵌合基因的构建与克隆将本实施例5中所获的J片段经EcoRI/XhoI酶切，插入4(3)中制备的真核表达 质粒pCI-SME中，转化大肠埃希菌DH5 α感受态，挑选AMP抗性菌落进行质粒提取与鉴定， 序列正确的嵌合基因如SEQ ID No :17所示，该质粒能表达嵌合假病毒蛋白(SEQ ID No: 16)。参见图1，图1为嵌合假病毒重组表达质粒的构建过程，含正确嵌合基因的重组子命名 为 pCI-SMEJ。实施例2嵌合假病毒重组表达质粒转染靶细胞及稳定转染克隆的筛选1.将实施例1所述的重组表达质粒pCI-SMEJ按脂质体试剂说明书 (Lipofectamine 2000， Invitrogen)转染 BHK21 细胞(Baby hamsterkidney)(ATCC# CCL-10)，用含10%小牛血清(Hyclone)的DMEM培养基(GIBCO)培养20小时。2.用0.25%的胰酶(GIBCO)消化转染细胞，参照萨姆布鲁克等著，黄培堂等译 《分子克隆实验指南》(第三版，2002年，科学出版社)的克隆有限稀释法用含0.6mg/ml G418 (Sigma)和10%小牛血清的DMEM培养基进行培养，10天后，培养板中出现克隆生长，挑 取克隆进行扩大培养。3.收集单克隆培养上清，取100 μ 1冷冻干燥浓缩，参照《分子克隆实验指南》的 SDS-PAGE方法进行电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗登革病毒II型的抗血清作 一抗，辣根过氧化物酶(HR)标记的兔抗小鼠(中山公司)作二抗进行免疫印迹(Western blot)鉴定，有特异性抗原表达者为稳定转染细胞克隆。附图2显示了稳定转染克隆的筛 选过程；附图3显示了对11个稳定转染克隆的Western blot鉴定结果，可见11个克隆中 有4个克隆能表达特异性抗原，分别是B8, Bll，C4和C7克隆，其中B8, Bl 1，C4，C7为细胞 克隆的全称。实施例3嵌合假病毒颗粒疫苗的制备过程1.复苏实施例2中获得的稳定转染克隆，用含10%小牛血清的DMEM培养基扩大 培养，达到所需的细胞量后，改用2%小牛血清的DMEM培养基培养，每48小时收集上清一 次，6000g离心30分钟(Sigma 3T3离心机)，留存上清。2.嵌合假病毒颗粒的离心纯化在培养上清中加入PEG8000(上海生工，终浓度为 7. 1% )和NaCl (上海生工，终浓度为2.7%)，4°C振摇过夜(16-20小时)，4°C 50000g离 心 1 小时，沉淀用 1/100 体积的 TNE buffer (IOmM Tris, ImM EDTA, IOOmM NaCl，pH 8.0)重 悬，制成浓缩病毒液。TNE buffer的配制如下称取1. 21g Tris (上海生工)，0. 37g EDTA (上海生工) 和5. 84gNaCl (上海生工)于一大烧杯中，加入500ml蒸馏水溶解，用IM的NaoH(上海生
10工)调节PH值到8.0，补加蒸馏水至1000ml，分装，15磅高压15分钟。3.嵌合假病毒颗粒的密度梯度离心纯化根据假病毒颗粒与残留细胞碎片密度 不同这一事实，采用密度梯度离心法分离，即使细胞碎片与病毒克隆的大小相同，在密度梯 度中也能将其分开。(1)以0. IM PBS为稀释液配制不同浓度的蔗糖(上海生工)溶液60%、57%、 55%,53%,50%,40%,30% (W/V)等梯度溶液；即分别称取 60、57、55、53、50、40、30g 蔗糖 于IOOml盐水瓶中，加IM PBS溶液(配制方法参见分子克隆实验指南)10ml，补加蒸馏水至 100ml, 10磅高压15分钟，4°C冰箱保存。(2)BeCkman离心机水平转头专用15ml离心管6支，分别由高到低装填60 %、 57%,55%,53%,50%,40%,30% (W/V)等蔗糖溶液，总体积共14ml。并且最底层承载液 (60%蔗糖溶液)不少于4ml，以防止病毒颗粒被离心到管底。加每层液体时，沿管壁慢加， 各层之间有明显区分带为佳。(3)在最表层缓慢加入浓缩病毒液，约1ml，与30%蔗糖溶液有明显区分带。(4)将离心管装入套筒中，盖紧螺盖，悬挂于水平转头，置入离心机，4°C，IlOOOOg 离心6h。(5)取出离心管，先肉眼观察各梯度蔗糖的区分带中有无蛋白质沉淀或明显蛋白 带出现，再以Iml注射器将区分带中的沉淀物轻轻吸出作为样本。(6)通过Western blot检测各区带的假病毒颗粒纯度和量，确定假病毒主要的沉 降区带后，大量制备纯化假病毒颗粒，-80°C储存备用。实施例4嵌合假病毒疫苗的动物实验为证实嵌合假病毒的免疫疗效，我们检测了嵌合假病毒疫苗对BalB/c小鼠抵抗 日本脑炎病毒致死性攻击的保护作用。致死性攻击病毒量的确定为测试日本脑炎病毒对BalB/c小鼠致死性攻击所需 的病毒量，首先Mf经病毒噬斑测定(Schaechter'sMechanisms of Microbial Disease,4th edition, 2007, Engleberg, DiRita& Dermody.)的日本脑炎病毒 Bei jing-1 株用 PBS 稀释 成 1 X IO3 1 X 107pfu/ml (plaque forming unit，pfu)，注射至Ij 4 周龄的 BalB/c 小鼠颅内， 每组10只，20 μ 1/只，阴性对照用PBS。结果，注射3天后1 X IO5 1 X 107pfu/ml注射组 小鼠全部死亡；lX103pfu/ml注射组有90%存活；lX104pfu/ml注射组有20%存活，最终 确定1 X 105pfu/ml为最适致死剂量。嵌合假病毒颗粒疫苗治疗方案实验分为4组，每组10只4周龄BalB/c小鼠。
在疫苗对照组和免疫组里的每只小鼠经皮下注射IO5Pfu嵌合假病毒颗粒，在注射 后14天，再次注射IO5Pfu嵌合假病毒颗粒作为追加免疫，正常对照组和病毒对照组则注射 PBS缓冲液。在注射后28天，病毒对照组和疫苗治疗组的小鼠每只颅内注射IO5Pfu的日本 脑炎病毒进行攻击，正常对照组和疫苗对照组则注射PBS。1.嵌合假病毒免疫疗效的观察(1)当小鼠注射假病毒颗粒后，每天观察生长情况，进食、活动等状态，记录死亡时 间。(2)在第二次皮下注射假病毒21天，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法(参见分子 克隆实验指南)检测小鼠血清中抗体滴度。2.实验结果(1)假病毒颗粒疫苗对小鼠的保护情况我们观察到，病毒对照组在进行IO5Pfu日本脑炎病毒颅内攻击后3天内，小鼠无 一存活，死亡率为100% ；疫苗免疫组小鼠在受同样剂量的日被脑炎病毒攻击后，除1只于 攻击后4天死亡外，其余全部存活，保护率90%。(2)嵌合假病毒疫苗对小鼠免疫应答的影响经ELISA检测小鼠血清中抗日本脑炎病毒的抗体效价，结果疫苗对照组的抗体效 价较正常对照组升高16倍。 实施例5构建不同型的II型登革病毒_日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗在本实例中，按照实施例1-3所述的方法构建了下列II型登革病毒-日本脑炎病 毒嵌合假病毒疫苗，其不同点在于II登革病毒E蛋白的长度不同，产生假病毒颗粒的效率 如下 实施例6构建I型登革病毒_日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗在本实施例中，按实施例1构建了 I型登革病毒_日本脑炎病毒嵌合假病毒重组 表达质粒，不同点在于仅用I型登革病毒的preM/M基因和E蛋白基因(缺失C-端99个氨 基酸的编码序列)代替II型登革病毒，然后采用实施例2和3的方法制备假病毒颗粒，再 按实施例4中疫苗免疫组相同的方案给药，进行动物实验。结果，在2次假病毒颗粒免疫后14天用IO5Pfu的日本脑炎病毒进行攻击，保护率 为 80%。实施例7构建III型登革病毒_日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗在本实施例中，先按本发明实施例1构建了 III型登革病毒_日本脑炎病毒嵌合 假病毒重组表达质粒，其不同点在于仅用III型登革病毒的preM/M基因和E蛋白基因(缺 失C-端99个氨基酸的编码序列)代替II型登革病毒，然后采用实施例2和3的方法制备 假病毒颗粒，再按实施例4中疫苗免疫组相同的方案给药，进行动物实验。结果，在2次假病毒颗粒免疫后14天用IO5Pfu的日本脑炎病毒进行攻击，保护率 为 75%。实施例8构建IV型登革病毒_日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗在本实施例中，按照实施例1所述的方法构建了 IV型登革病毒-日本脑炎病毒嵌 合假病毒重组表达质粒，不同点在于仅用IV型登革病毒的preM/M基因和E蛋白基因(缺 失C-端99个氨基酸的编码序列)代替II型登革病毒，然后按实施例2和3的方法制备假 病毒颗粒，再采用实施例4中疫苗免疫组相同的方案给药，进行动物实验。结果，在2次假病毒颗粒免疫后14天用IO5Pfu的日本脑炎病毒进行攻击，保护率 为 84%。
权利要求
一种登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特征在于所述的表达质粒中含有一由下列元件组成的嵌合编码基因a)黄病毒属信号肽编码序列；b)登革病毒的preM/M编码区；c)登革病毒E蛋白前396个氨基酸的编码区；d)日本脑炎病毒E蛋白后120个氨基酸的编码区。
2.根据权利要求1所述的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特 征在于所述表达质粒是pcDNA3. 1或pcDNA6. 0或pCIneo (+)或pReceiver。
3.根据权利要求1所述的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特 征在于所述嵌合编码编码基因由插入元件按a-b-c-d的顺序串联。
4.根据权利要求1所述的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特 征在于所述嵌合编码基因的黄病毒属信号肽编码序列选自SEQ ID NO :1所示的编码日 本脑炎病毒preM/M信号肽的核苷酸序列，SEQ ID NO 3所示的编码II型登革病毒preM/ M信号肽的核苷酸序列，SEQ ID NO :4所示的编码西尼罗河病毒preM/M信号肽的核苷酸序 列。
5.根据权利要求1所述的登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒的重组表达质粒，其特 征在于所述的登革病毒为登革病毒血清型I或II或III或IV型。
6.一种嵌合假病毒颗粒，其特征在于由权利要求1所述的重组表达质粒转染靶细胞 后表达的嵌合蛋白自组装形成，不含任何核苷酸。
7.根据权利要求6所述的嵌合假病毒颗粒，其特征在于所述的靶细胞包括来源于真 核生物的传代细胞系的BHK21或293或293T或Cos或Hela。
8.一种登革病毒-日本脑炎病毒嵌合假病毒疫苗，其特征在于它含有权利要求6所 述的嵌合假病毒颗粒和药学上可接受的佐剂或载体。
9.嵌合假病毒颗粒在制备用于预防登革热和/或日本脑炎药物中的用途。
10.一种嵌合假病毒颗粒的制备方法，其特征在于有以下步骤1)将权利要求1所述的含有登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白编码序列的重组表达 质粒导入靶细胞；2)当所述的转染靶细胞表达登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白时，用质粒携带的抗性 基因对应的抗生素对转染细胞进行筛选，获得稳定转染的细胞克隆；3)培养稳定转染的细胞，产生登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒；4)回收嵌合假病毒颗粒。
全文摘要
本发明涉及登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒疫苗及其制备方法。所述的嵌合假病毒颗粒是将克隆了登革病毒和日本脑炎病毒结构基因的重组表达质粒转染到靶细胞中表达而得到的。所述的嵌合假病毒制备方法包括1)含有登革病毒和日本脑炎病毒结构蛋白编码序列的重组表达质粒的构建；2)将重组质粒导入靶细胞并进行稳定转染细胞克隆的筛选；3)培养稳定转染的细胞，从而产生登革病毒和日本脑炎病毒嵌合假病毒颗粒；4)从细胞培养上清中提取并纯化嵌合假病毒颗粒。该疫苗嵌合了登革病毒和日本脑炎病毒的抗原组分，可以刺激机体产生免疫应答，进而预防登革病毒和/或日本脑炎病毒感染性疾病，具有免疫效果好、安全、适于产业化生产的优点。
文档编号A61K39/295GK101899466SQ20101021260
公开日2010年12月1日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者朱军民, 杨杰, 胡珍, 胡福泉, 陈志瑾, 饶贤才 申请人:中国人民解放军第三军医大学