专利名称：一种具有抑制新生血管作用的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及新的具有抑制新生血管作用的多肽-TK II系列多肽。该多肽可抑制体外血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成和可抑制体内鸡胚尿囊膜和小鼠角膜新生血管。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
背景技术：
血管新生是指在原有毛细血管网的基础上，通过血管内皮细胞增殖、迁移进而形成新生血管的过程。血管新生在体内胚胎发育、损伤修复等生理过程中发挥重要作用，同时也是众多新生血管性疾病，如肿瘤生长与转移、增殖性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、类风湿关节炎等疾病的主要病理变化。因此新生血管抑制剂的研究与应用对于一些难治性新生血管相关疾病具有重要意义。iM^iVMMWM^M (tissue-type plasminogen activator, t-PA) i—禾中@ 含多个结构域的丝氨酸蛋白酶，在体内能够将无活性的纤溶酶原转变为具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶，从而参与机体的纤维蛋白溶解过程。t-PA由一个I型纤维结合蛋白区域，一个表皮生长因子样区域，两个kringle结构域和一个羧基末端蛋白裂解区域组成。Kringle结构域是一种由约80个氨基酸组成的保守结构，内部包括3对二硫键， 形成双环构象。目前研究已发现多种内源性蛋白中所包含的kringle结构具有抑制体内外新生血管的作用，因此认为kringle结构可能是一个具有抑制新生血管作用的独立保守结构和功能单位。国外研究者发现t-PAkringlel-2(TKH)在体外能够抑制血管内皮细胞增殖、黏附和迁移，在体内具有抑制新生血管的作用。此外，t-PA kringle2具有独立的抑制血管内皮细胞增殖和迁移的作用，并且能够有效的抑制体内新生血管形成。t-PA kringle2 作为一种大分子蛋白类新生血管抑制剂，其所携带的具有抑制新生血管作用的保守氨基酸序列或结构为多肽类新生血管抑制剂的研发提供了重要信息。在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76. 5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体(如氨基酸转运体、寡肽转运体等)结合的药物才能到达前房发挥作用。第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。此外，分子量较大的外源性蛋白质也是敏感的异物源，可对眼部组织(如葡萄膜)造成免疫损伤。
第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如血管抑素(angiostatin)，它由纤溶酶原 Kringle 结构域 1-4 (plasminogen Kringle 1-4) 组成，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。正是由于上述种种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限， 比如重组抗人VEGF单克隆抗体bevacizumab (Avastin)、重组抗人VEGF单克隆抗体片段 ranibizumab (Lucentis)等，但它们价格高昂，并且需反复经玻璃体腔给药，出血、感染、血管栓塞等风险难以避免；而且VEGF单克隆抗体在阻断新生血管形成过程中，同时阻断了 VEGF的正常生理功能，反复使用会导致视网膜神经组织萎缩。多肽类新生血管抑制剂与目前研究广泛的蛋白类新生血管抑制剂相比具有合成方法简单、容易进行化学修饰、免疫原性低、溶解性好、生物利用率高、组织穿透性强、给药途径多样、价格低廉等突出优势。然而，目前尚没有来自t-PA Kringle结构域的、效果令人满意的小分子多肽。因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9] -[XaalO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3](I)式中，
XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段；
Xaal是选自下组的氨基酸His 或 Arg ；
Xaa2是选自下组的氨基酸Val, Thr, Leu, lie, Met 或 Ala ；
Xaa3是选自下组的氨基酸Leu, lie, Val, Met 或 Ala ；
Xaa4是选自下组的氨基酸Lys 或 Arg ；
Xaa5是选自下组的氨基酸Asn, Asp 或 Gln ；
Xaa6是选自下组的氨基酸Arg 或 Lys ；
Xaa7是选自下组的氨基酸Arg, Gln 或 Lys ；
XaaS是选自下组的氨基酸Leu, lie, Val, Met 或 Ala ；
Xaa9是选自下组的氨基酸Thr 或 Ser ；
XaalO是选自下组的氨基酸:Trp 或 Tyr ；
Xaall是选自下组的氨基酸:Glu 或 Asp ；
Xaal2是选自下组的氨基酸:Tyr 或 Phe ；
Xaal3是无，或1-3个氨基酉変构成肽段；
并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为12-18个氨基酸。在另一优选例中，Xaal3是1_3个氨基酸构成的肽段；更佳地，所述的肽段为⑶V、 CD、或 C。在另一优选例中，XaaO为C或WC。在另一优选例中，所述多肽的长度为12-15个氨基酸。在另一优选例中，所述多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO=I所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO 1所示氨基酸序列经过1_5个(较佳地1_3，更佳地1_2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID NO 1的所示多肽的抑制血管新生活性。在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID N0:1的相同性彡80%，较佳地 ^ 90% ；更佳地彡95%。本发明还提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有(a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途， 它们被用于制备用于抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。在另一优选例中，所述的与血管新生相关疾病的选自下组新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、 Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。在另一优选例中，所述的新生血管性眼病包括累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜， 包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。在另一优选例中，所述的对象是人。在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
--累述。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示了 t-PA Kringle2结构域示意图以及各小肽的氨基酸序列。图2显示了本发明TKII系列多肽抑制VEGF诱导血管内皮细胞增殖。其中，VEGF 10ng/ml能够显著诱导HUVECs增殖。TK 11-20、TK 11-30、TK 11-10在10 μ M浓度范围内， 对VEGF诱导HUVECs增殖无明显抑制作用(与VEGF组相比，P) 0. 05)。ΤΚΙΙ-12在浓度为 IOOnM, IyMUO μ M时能够有效抑制VEGF诱导的HUVECs增殖，并且随着ΤΚΙΙ-12浓度的增加，抑制作用逐渐增强。(**与VEGF组相比，P <0.01)。TK II-12S多肽不具有抑制VEGF 诱导HUVECs增殖的作用。图3显示了本发明TK II系列多肽抑制VEGF诱导血管内皮细胞迁移。其中，A图显示Transwell小室碳酸酯膜下室面HUVECs细胞苏木素染色情况。B图显示VEGF 25ng/ml能够显著诱导HUVECs迁移。TK 11-20在10 μ M浓度范围内，对VEGF诱导HUVECs迁移无明显抑制作用。TK 11-30在高浓度(10 μ Μ)时，对VEGF诱导HUVECs迁移具有抑制作用。TK II-IO在1 μ Μ、10 μ M浓度时，对VEGF诱导HUVECs迁移具有抑制作用。TK II -12在浓度为ΙΟΟηΜ、1 μ Μ、10 μ M时能够有效抑制VEGF诱导的HUVECs 迁移，并且随着TK II -12浓度的增加，抑制作用明显增强(*与VEGF组相比，P <0. 05，** 与VEGF组相比，P < 0. 01)。TK II -12S多肽不具有抑制VEGF诱导HUVECs迁移的作用。图4显示了本发明TK II系列多肽抑制VEGF诱导血管内皮细胞管腔形成。其中， A图显示血管内皮细胞管腔形成情况。无VEGF组管腔样结构形成少，VEGF组管腔样结构形成明显增多，彼此交错呈网状。TK II -20组10 μ M浓度时管腔样结构形成与VEGF组相比无明显减少，TK II -30、TK II -10、TK II -12各组10 μ M浓度时管腔样结构形成与VEGF组相比明显减少。B图显示VEGF 15ng/ml能够显著诱导HUVECs管腔形成。TK II -20多肽对VEGF 诱导的HUVECs管腔形成无明显抑制作用。TK II -30、TK II -10、TK II -12多肽在浓度为 IOOnMU μ M、10 μ M时能够有效抑制VEGF诱导的HUVECs管腔形成，并且随着浓度的增力卩，抑制作用明显增强。TK II -12对VEGF诱导血管内皮细胞管腔形成的抑制作用强于TK II -30 和TK II -10 与VEGF组相比，P < 0. 01)。TK II -12S多肽不能抑制VEGF诱导HUVECs管腔形成。图5显示了本发明TK II -12多肽抑制鸡胚尿囊膜新生血管。其中，A图显示鸡胚尿囊膜毛细血管生长情况。PBS组滤纸片周围一个直径范围内鸡胚尿囊膜毛细血管生长良好；TK II -12多肽IOng组，滤纸片周围一个直径范围内鸡胚尿囊膜毛细血管数量减少； TK II -12多肽50ng组，滤纸片周围一个直径范围内鸡胚尿囊膜毛细血管数量明显减少，出现部分无血管区。TK II -12S多肽50ng组，滤纸片周围一个直径范围内鸡胚尿囊膜毛细血管生长良好。B图显示与PBS组相比，IOng与50ng TK II -12多肽实验组滤纸片周围一个直径范围内尿囊膜毛细血管数量减少，并且差异具有统计学意义；TK II -12S多肽50ng组鸡胚尿囊膜毛细血管数量无明显减少。(**与PBS组相比，P <0.01 表示与IOng组相比，P < 0. 05)。图6显示了本发明TK II -12多肽抑制VEGF诱导小鼠角膜新生血管。其中，图A-D分别代表植入VEGF缓释颗粒(A)、VEGF+TK II -12多肽Iug缓释颗粒(B)、VEGF+TK II -12 多肽5ug缓释颗粒(C)和VEGF+TK II -12S多肽5ug缓释颗粒(D) 5天后小鼠角膜新生血管生长情况。VEGF组角膜新生血管浓密，迂曲扩张，VEGF+TK II -12多肽Iug组角膜新生血管短小稀疏，VEGF+TK II -12多肽5ug组未见明显粗大的新生血管生长，VEGF+TK II -12S多肽 5ug组角膜新生血管生长旺盛，迂曲扩张。图 E-H 分别代表 VEGF 组(E)、VEGF+TK II -12 多肽 Iug 组(F)、VEGF+TK II -12 多肽5ug组(G)和VEGF+TK II -12S多肽5ug组(H)小鼠角膜病理组织学检查。VEGF组角膜基质板层排列疏松，基质中有大量新生血管管腔，可见红细胞填充其中。VEGF+TK II -12多肽Iug组角膜基质中可见少量新生血管管腔，可见红细胞填充其中。VEGF+TK II -12多肽 5ug组未见明显新生血管管腔形成，角膜基质无明显水肿。VEGF+TK II -12S多肽5ug组角膜基质中可见大量新生血管管腔，可见红细胞填充其中。图I-K分别代表各组角膜新生血管长度(I)、新生血管钟点数(J)、新生血管面积 (K)的比较，与VEGF组相比，Iug与5ug TK II -12多肽组角膜新生血管长度、钟点数和面积均明显减少，并且差异具有统计学意义(**与VEGF组相比，P < 0. 01)。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自t-PA Kringle2结构域的、 具有抑制血管新生功能的，分子量小于5kD(如仅约l-3kD)的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列， 采用固相法将其合成后，再经鸡胚尿囊膜血管模型、VEGF诱导的内皮细胞增殖、迁移、管腔形成模型和小鼠角膜新生血管模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽。本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。活性多肽在本发明中，术语“本发明多肽”、“TKII-12多肽”、“TKII-12小肽”、“短肽 TKII-12”或“肽TKII-12”可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽TKII-12氨基酸序列(SEQ ID NO 1)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQ ID N0:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)1-5个(通常为1-4个，较佳地 1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或 N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内) 氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。本发明还包括TKII-12多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或(iii)TKII_12多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或Mlis等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3 个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。一类特别优选的衍生多肽的序列如SEQ ID NO 1以及实施例中所示。表 I
权利要求
1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xa alO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3] (I) 式中，XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段；Xaal是选自下组的氨基酸His或Arg ；Xaa2是选自下组的氨基酸:Val, Thr，Leu, Ile，Met或Ala ；Xaa3是选自下组的氨基酸:Leu, lie, Val, Met或Ala ；Xaa4是选自下组的氨基酸Lys或Arg ；Xaa5是选自下组的氨基酸Asn，Asp或Gln ；Xaa6是选自下组的氨基酸Arg或Lys ；Xaa7是选自下组的氨基酸Arg，Gln或Lys ；Xaa8是选自下组的氨基酸:Leu, lie, Val, Met或Ala ；Xaa9是选自下组的氨基酸Thr或kr ；XaalO是选自下组的氨基酸Trp或Tyr ；Xaall是选自下组的氨基酸Glu或Asp ；Xaal2是选自下组的氨基酸Tyr或Wie ；Xaal3是无，或1-3个氨基酸构成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为12-18个氨基酸。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaal3是1_3个氨基酸构成的肽段。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO为C或WC。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组(a)具有SEQID NO 1所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO :1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有(a)权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、 眼用凝胶或眼药膏。
8.如权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备用于抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关疾病的选自下组新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger' s病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病。
10.一种抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
全文摘要
本发明涉及预防和治疗血管新生的多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。
文档编号A61P7/02GK102311485SQ20101021715
公开日2012年1月11日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者苏莉, 许迅, 赵卉 申请人:上海市第一人民医院