专利名称：重组人源化抗cd20单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组人源化抗⑶20单克隆抗体。
背景技术：
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，好发于青壮年，其中绝大多数为B细胞来源，约占85%。在未治疗状态下，低度和部分中度恶性NHL如小淋巴细胞性淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤的生长形式往往呈惰性过程，中位生存期为5 9年。它们对首次化疗敏感，但很容易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被认为是难以治愈的恶性肿瘤。而一些高度恶性的NHL则死亡率极高。近年来，针对细胞表面分子的抗原靶向性治疗已取得了巨大进展并成为一种非常有发展前途的治疗方法，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂[Maloney DG. Immunotherapy for non-Hodgkin' s lymphoma monoclonal antibody and vaccines. J Clin Oncol. 2005Sep 10 ；23 (26) :6421_6428]。CD20抗原是非结合性单抗疗法的一个理想靶点，因为该抗原具有克隆特异性，仅表达于所有的前B细胞和成熟B细胞，而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他造血细胞系； 同时，CD20分子在B淋巴瘤细胞表面的表达量异常增高，磷酸化增加，与B细胞淋巴瘤的发生密切相关。⑶20分子在超过95%的B细胞性NHL中均有表达，且抗原分子在膜上比较暴露，容易接近，与单抗结合后无显著内化和脱落，也不会因与抗体的结合而发生抗原调变， 因此成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。⑶20单抗疗法在治疗B细胞淋巴瘤中已取得了令人满意的效果，目前抗⑶20抗体主要有以下几种，按照其发挥抗肿瘤作用的不同功能分为两大类(1)主要通过CDC、 ADCC(CDCC)作用发挥功能的C2B8、1F5、2H7、2F2(2)主要通过凋亡、ADCC(CDCC)作用发挥功能的B1、11B8。美国IDEC phamaceutical公司针对B细胞淋巴瘤生产的人鼠嵌合抗CD20 单克隆抗体Rituximab-C2B8是第一个经美国FDA批准用于治疗淋巴瘤的抗体。1997年批准上市。美罗华是一种嵌合型IgGl免疫球蛋白，它是通过转染相关基因结构到仓鼠卵细胞后表达的基因产物。美罗华含1328个氨基酸，分子量约144KD，由鼠抗CD20单克隆抗体的可变区Fab和人IgGl抗体稳定区Fc片段构成。杂交瘤技术生产的鼠源单克隆抗体进入人体后可能引起人抗鼠抗体免疫应答 human antimouse antibody response (HAMA)[Winter G, Harris WJ. Humanized antibodies. Immunol Today. 1993Jun ；14(6) :243_6]。因此，如何通过基因工程技术来构建抗降低鼠源抗体的免疫原性的抗体，有效地减少HAMA反应的发生率是本领域的技术人员急于解决的问题。人源化抗体[Ishida T，Tmai K. The expression technology of chimeric and humanized antibody. Nippon Rinsho，2002，60(3) :439_444Ishida T，Tmai K. The expression technology of chimeric and humanized antibody. Nippon Rinsho,2002, 60(3) 439-444]是为了克服鼠源单抗在临床应用中的缺陷而发展起来的新型基因工程抗体。第一代人源化抗体是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体，由于抗体的抗原亲和力是由其可变区决定的，因此嵌合抗体的亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了一定程度的降低。抗体的可变区是由超变区(CDR)区和框架区(FR)区组成的，CDR是高度可变的区域，直接介导抗体与抗原的结合。FR区相对保守，作为支架维持着CDR区的空间位置，它是可变区中产生免疫原性的主要区域。由于嵌合抗体上还保留着鼠可变区， 临床应用时仍常常会有强烈的HAMA反应。因此，为了尽可能降低嵌合抗体的免疫原性，人们考虑将鼠CDR区直接移植到人源抗体可变区中的FR区上，得到CDR移植抗体，也就是人源化抗体。但是，单纯的⑶R移植往往降低甚至丧失原抗体的亲和力，这是因为FR区不仅提供了⑶R的空间构象环境，有时还直接参与抗原抗体的相互结合，只有将FR中某些重要残基回复突变成鼠源残基才能恢复抗体的活性。(C，Queen, W，P，Schneider, H，Ε, Selick, P, W, Payne, N, F, Landolfi, J, F, Duncan, N, Μ, Avdalovic, Μ, Levitt, R, P, Junghans, Τ, A, ffaldmann, Ahumanized antibody that binds to the interleukin 2receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033. V. L. Pulito, V. A. Roberts, J. R. Adair, A. L. Rothermel, A. M. Collins, S. S. Varga, C. Martocello, M. Bodmer, L. K. Jolliffe, R.A.Zivin, Humanization and molecular modeling of the anti_CD4 monoclonal antibody, 0KT4A, J. Immunol. 156(1996)2840-2850. K. Nakamura, Y.Tanaka, K. Shitara, N. Hanai, Construction of humanized anti-ganglioside monoclonal antibodies with potent immune effector functions, Cancer Immunol. Immunother. 50(2001)275-284.)
综上所述，得到活性高的鼠源单抗并利用其CDR进一步得到恢复抗体活性的人源化抗体一直是本领域的技术人员着力解决的问题。
发明内容
因此，本发明提供了一种抗人⑶20人源化抗体，其重链超变区氨基酸序列为 CDRl =SYNMH ；CDR2 :AIYPENGDTSYNQKFKD 和 CDR3 :WHYYGNGGALDY，轻链超变区氨基酸序列为 CDRl :RASGNIHNYLA ；CDR2 :NAKTLPD 和 CDR3 =QQFffSNPffT ；本发明提供的抗人⑶20人源化抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :10， 轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO :12，更具体地，本发明提供的抗⑶20人源化抗体，其重链氨基酸序列为SEQ ID NO :6，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO :8。进一步地，本发明所述的抗人⑶20人源化抗体，由重链和轻链组成，其中重链包括重链可变区和人免疫球蛋白重链恒定区或其片段；蛋白轻链包括轻链可变区和人免疫球蛋白轻链恒定区或其片段。人免疫球蛋白恒定区可以从各种类型的免疫球蛋白中选择，优选的人免疫球蛋白重链恒定区或其片段为Y型(IgG2a)，氨基酸序列如SED ID NO :2所示；人免疫球蛋白轻链恒定区或其片段为κ型或λ型，优选的人免疫球蛋白轻链恒定区的氨基酸序列如SED ID NO 4 所示。本发明的另一目的在于提供编码上述抗人CD20人源化抗体的核苷酸分子，其中编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :9，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO :11，编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO :5，编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO :7，由该核苷酸分子转化的宿主也包含在本发明中。
本发明进一步提供上述抗人CD20的人源化抗体的制备方法，包括通过计算机辅助设计出人源化抗体hu8E4的氨基酸序列，全基因合成hu8E4的重链和轻链可变区基因并经基因重组分别与人免疫球蛋白重、轻链恒定区基因拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建人源化抗体的轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO细胞， 然后进行筛选、培养纯化即得本发明的抗人CD20的人源化抗体hu8E4。本发明利用得到的抗体进行了一系列实验，体外抗原结合活性测定结果表明 hu8E4都能很好地与高表达⑶20的Burkitt淋巴瘤细胞系Raji特异性结合。竞争抑制实验结果表明hu8E4保留了原鼠源抗体的亲和力和特异性，体外生物学功能检测其具有一定得生物学功能，生存率试验表明注射hu8E4组的小鼠的生存时间得到显著延长，hu8E4可用于治疗高表达⑶20的淋巴瘤，更优选的，hu8E4可用于非霍奇金氏淋巴瘤的治疗。
图1 :8E4单克隆抗体的分子模拟结构示意图FR区残基用灰色(浅色)条带表示， CDR区残基用黑色(深色)条带表示，11个位于CDR区周围5人距离内的FR区残基用球棒状表示；图2 人源化抗体hu8E4的重链(图2_1)和轻链(图2_2)氨基酸序列与相关序列的比对图，其中8E4VH和8E4VL分别表示鼠源单克隆抗体8E4的重链和轻链的可变区； 选择人免疫球蛋白重链III亚组的重链可变区和人抗体IgK链I亚组的轻链可变区分别作为人源化抗体hu8E4重链和轻链的框架区；hu8E4VHa和hu8E4VHb表示不同的人源化抗体重链可变区，hu8E4VLa和hu8E4VLb分别表示不同的人源化抗体轻链可变区；破折号表示与人免疫球蛋白重链III亚组或IgK链I亚组对应残基相同的氨基酸，括弧里表示的是CDR区；氨基酸的按照Kabat的编号方式进行编号[E. A. Kabat, Τ. T. Wu, H. M Perry, K. S. Gottesman, C. Foeller,Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth ed. , United States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD,1991.]；图3 :8E4的人源化抗体的抗原结合活性实验结果；图4:竞争抑制实验结果；图5 :CDC实验结果，图5-1对Dauli细胞，图5-2对Raji细胞；图6 抗体对Dauli和Raji细胞的ADCC作用结果，图6_1对Dauli细胞，图6_2对 Raji细胞；图7 抗体诱导Dauli和Raji细胞凋亡实验结果，图7_1对Dauli细胞，图7_2对 Raji细胞；图8 雌性BALB/C小鼠的生存率曲线。
具体实施例方式以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制Raji (人 B 淋巴瘤细胞，ATCC，CCL-86)pGEM-T载体，美国Promega公司产品pcDNA3. 1 (+)，美国 Invitrogen 公司产品T4DNA连接酶，美国Invitrogen公司产品
pcDNA3. 1/ZE0(+)载体，美国 Invitrogen 公司产品C0S-1 细胞(ATCC CRL 1650)CHO-Kl 细胞(ATCC CRL-9618)pGEM-T easy 载体，Promega 公司产品Human myeloma IgGl, κ , Sigma 公司产品HRP-羊抗人 kappa, Southern Biotechnology Associates 公司产品Human IgG为抗人her2的人源化抗体trastuzumab，Roche公司产品Rituximab, Roche ^wJzfeBnnDaudi (人 β 淋巴瘤细胞，ATCC, CCL-213)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用 Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22 =197-207)和文献(Nucleic Acids Research, 1982,10 4071-4079)报道的序列分别设计引物采用 RT-PCR 反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到 pGEM-Τ载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和 pGEM-T/CL。实施例1抗人CD20单克隆抗体8E4的制备-细胞融合杂交瘤制备单克隆抗体用高表达⑶20的Raji细胞免疫BALB/c小鼠(购自上海实验动物中心)，使其脾脏中的B淋巴细胞能产生抗人CD20的抗体，取免疫后小鼠的脾细胞与NS-I (BALB/c小鼠骨髓瘤细胞)融合，经HAT选择性培养，经过培养，筛选出抗人CD20阳性克隆，再经克隆化后筛选出亚克隆，以确保抗体是由单个克隆细胞产生，然后收集单个克隆细胞培养上清经 Protein G柱纯化后，就得到抗人⑶20的单克隆抗体8E4。实施例2嵌合抗体c8E4的构建抗人⑶20单抗8E4可变区基因的克隆按“Trizol Reagent”试剂盒(美国Gibco BRL公司产品)说明书提取2 X IO6分泌抗人⑶20单抗的杂交瘤细胞8E4的总RNA。选择抗体(IgG2a，κ )重链和轻链恒定区的适当位置分别设计3条基因特异性引物GSP1、GSP2、GSP3，其中GSPl距离可变区基因最远，用于逆转录反应，GSP2用于首轮PCR扩增，GSP3用于巢式扩增。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下 GSP1-H，5，-AGC TGG GAA GGT GTG CAC ACC ACT-3，;GSP2_H，5，-CAG AGT TCC AGG TCA AGG TCA-3，；GSP3_H，5，-CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT-3，· GSP1-L，5，-TTG CTG TCC TGA TCA GTC CAA CT-3，；GSP2_L，5，-TGT CGT TCA CTG CCA TCA ATC TT-3，；GSP3-L， 5，-TTG TTC AAG AAG CAC ACG ACT GA-3，.按照 5，RACE 试剂盒(美国 Gibco BRL 公司产品)说明书以GSPl为引物将总RNA逆转录成cDNA，然后给第一链cDNA的3’末端加上 poly(C)尾，加尾后用GSP2和AAP为引物进行PCR扩增，将扩增产物稀释100倍再以AUAP 和GSP3为引物进行巢式PCR扩增。两次PCR反应均采用热启动，反应条件94°C 5分钟； 940C 45秒，60°C 45秒，72°C 1分10秒，30个循环；72°C 7分钟。巢式PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片断并克隆到pGEM-T easy载体中，筛选阳性克隆测序，对测序结果进行分析。然后以测序正确的pGEM-T/VH*模板，设计引物正义AAG CTT GCC GCC ACC ATG GGA TGG AGT TGT ATC AT 禾口 H 反义 GCT AGCTGA GGA GAC GGT GAC，采用 Onestep RT-PCR反应扩增VH链可变区基因并使其5'端含有限制酶位点Hind III，3'端含有限制酶位点 Nhe I，反应条件为50°C 30 分；95°C 15 分钟；94°C 50 秒，58°C 50 秒，72°C 50 秒，30 个循环；72°C 10分钟。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与5’ RACE的序列完全一致。本例中的正确克隆记作 pGEM-T/VHo以测序正确的pGEM-T/Vl为模板，设计引物L正义AAG CTT GCC GCC ACC ATG AGT GTG CTC ACT CA 和 L 反义 CCG CTT GAT TTC CAG TTTGGT 采用 Onest印 RT-PCR 反应扩增 VL基因并使其5'端含有限制酶位点HindIII，3'端含有人抗体轻链恒定区5'端的互补序列，反应条件为94°C 5分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 1分钟，30个循环；72°C 10分钟。 经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序验证，结果证明该序列与5’ RACE的序列完全一致。本例中的正确克隆记作pGEM-T/VL。构建嵌合抗体c8E4将上述Onest印RT-PCR测序正确的质粒pGEM-T/VH用Hind III和Nhe I双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得约440bp的酶切片断，与同酶切的质粒pGEM-T/CH连接，挑选正确克隆后以HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pcDNA3. 1 (+)用T4DNA连接酶进行连接，构建成真核表达载体pcDNA3. 1 (+) (VHCH)。采用Overlapping PCR将上述Onest印RT-PCR测序正确的克隆pGEM-T/VL直接与轻链恒定区的正确克隆pGEM-T/CL融合，反应条件为50°C 30分；95°C 15分钟；94°C 50秒， 580C 50秒，720C 50秒，30个循环；72°C 10分钟，得到PCR产物VLCL,其5 ‘端含有限制酶位点HindIII，3'端含有限制酶位点EcoR I。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到 pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序。将测序正确的VLCL基因用Hind III和EcoR I双酶消化从pGEM-T载体中切下，克隆到pcDNA3. 1/ZE0(+)载体中，构建成真核表达载体pcDNA3. 1/ ZEO(+) (VLCL)。于3. 5cm组织培养皿中接种3 X IO5CHO-Kl细胞，细胞培养至90% -95%融合时进行转染取质粒 10 μ g (质粒 pcDNA3. 1 (+) (VHCH) 4 μ g，质粒 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (VLCL) 6 μ g) 禾口 2μ 1 Lipofectamine2000Reagent(Invitrogen 公司产品)分另 Ij 溶于 500 μ 1 无血 i青 DMEM 培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于0)2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μ g/ml G418和250 μ g/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fc) 包被于ELISA板，4°C过夜，用2% BSA-PBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgGl，κ )，37°C温育2h，加入HRP-羊抗人IgG (κ)进行结合反应， 37°C温育lh，加入TMB于37°C作用5min，最后用H2SO4终止反应，测A45tl值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化嵌合抗体c8E4。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。实施例38E4人源化抗体的构建
鼠源8E4单抗可变区(Fv)三维结构的同源模建利用Accelrys公司的Insight II程序包来模拟8E4鼠源单抗可变区的三维结构。 首先，用BLAST程序在蛋白质结构数据库(Protein Data Bank, PDB)中分别搜索8E4重链和轻链可变区蛋白的模板蛋白。选取同源性最高的抗体(PDBN0.20SL)和(PDB NO. 1WEJ) 分别作为8E4重链和轻链的模建模板，同源性分别为84%和94%，利用Insight II程序模建出8E4的三维结构，如图1所示。8E4人源化抗体的设计与构建分别选择人免疫球蛋白重链III亚组(heavy chain subgroup III (humIII))和IgK 链I亚组(light chain k subgroup I (humkl))分别作为8E4抗体轻重链的人源化模板.我们首先将8E4的重链和轻链CDR区分别直接移植到人源模板人免疫球蛋白重链III亚组和 IgK链I亚组上，构成CDR移植抗体，重链为hu8E4Ha，轻链为hu8E4La。hu8E4Ha和hu8E4La 的可变区氨基酸序列如图2所示。全基因合成人源化抗体重、轻链可变区基因(hu8E4VHa和 hu8E4VLa)，然后以hu8E4VHa基因和pGEM_T/CH载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体重链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10 分钟。并使此人源化重链基因的5'端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3'端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列AAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGTTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTCCAC TCC。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到PGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用Hind III和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体重链片段hu8E4VHaCH，与用Hind III和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1 (+)进行连接，构建成人源化重链真核表达载体pcDNA3. 1 (+) (hu8E4VHaCH)。以hu8E4VLa基因和pGEM_T/CL载体为模板通过重叠PCR合成人源化抗体轻链基因，反应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟， 得到PCR产物hu8E4VLaCL，其5'端含有限制酶位点Hind III和信号肽基因序列，，3‘端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列见AAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGCGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCC AGATGT。挑选测序正确的克隆用Hind III和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收人源化抗体轻链片段hu8E4VLaCL，与用Hind III和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1/ZE0(+)载体进行连接，构建成人源化轻链真核表达载体pcDNA3. 1/ZE0(+) (hu8E4VLaCL)。于24孔组织培养板中接种0. 8 X IO5/孔的C0S-1细胞，用10% FCS的RPMI1640/ DMEM混合培养基(16/DM培养基)培养至90-95%融合度时进行转染取质粒1 μ g(轻链表达载体 0. 6 μ g ；重链表达载体 0. 4 μ g)禾口 2 μ ILipof ectamine2000Reagent 分别溶于 50 μ 1 无血清16/DM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用0. 5ml无血清的16/DM培养基替换24孔板中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到孔中，CO2孵箱培养4小时后补加0. 5ml含20 % FCS的 16/DM培养基，置于CO2孵箱中继续培养，72小时后取培养上清进行分析，采用ELISA确定培养上清中抗体的含量Goat anti-human IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C过夜，用2% BSA-PBS 于37°C封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgGl, κ )，37°C孵育2 小时，加入HRP-goat anti-human kappa进行结合反应，37°C孵育1小时，加入TMB于37°C 作用5分钟，最后用H2SO4终止反应，测OD45tl值。
将人Raji细胞用2% FCS-PBS重悬成1 X 106cellS/ml，分别加入不同稀释度的转染人源化抗体的C0S-1细胞培养上清，表达后置于4°C孵育60min，用2% FCS-PBS洗细胞2 遍，再加入FITC-goat anti-human IgG(H+L)于4°C孵育60min，洗细胞后用FCM分析并计算细胞的荧光强度。结果发现与c8E4嵌合抗体相比，hu8E4Ha和hu8E4La组成的人源化抗体(hU8E4Ha/hU8E4La)的活性几乎完全丧失(图3)。因此，为了获得高亲和力的人源化抗体，我们还需对可能影响8E4抗体结合活性的FR区鼠源残基进行分析和回复突变。通过分析模建的8E4单抗可变区的三维结构(图1)，我们发现在⑶R区周围5 A 的空间范围内可能影响原抗体CDR构象而又与人源模板中相应位置不同的FR区残基有 11 个，分别为 L48Val，L49His, H30Thr, H48Ile, H49Gly, H67Ala, H69Leu, H70Thr, H71Ala, H73Lys和H78Ala。将这些鼠源氨基酸残基保留在构建的⑶R移植抗体中可得到人源化抗体(hu8E4Hb/hu8E4Lb)。hu8E4Hb和hu8E4Lb的可变区氨基酸序列如图2所示，SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10分别显示了 hu8E4Hb重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID N0:11和SEQID NO 12分别显示了 hu8E4Lb轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6分别显示了 hu8E4Hb的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 7 和SEQ ID NO 8分别显示了 hu8E4Lb的核苷酸序列和氨基酸序列。hu8E4Hb的三个⑶R区氨基酸序列分别为(可参见图 2-1 的HU8E4VHb) =HCDRl :SYNMH、HCDR2 :AIYPENGDTSYNQKFKD 和HCDR3 :WHYYGNGGALDY ；hu8E4Lb的三个CDR区氨基酸序列分别为(可参见图2_2的 HU8E4VLb) =LCDRl :RASGNIHNYLA ；LCDR2 :NAKTLPD 和 LCDR3 :QQFWSNPWT。采用重叠 PCR 的方法分别合成人源化抗体重、轻链可变区基因(hu8E4VHb/hu8E4VLb)，并按与人源化抗体 (hu8E4Ha/hu8E4La)相同的方法构建轻链表达载体pcDNA3. 1/ZE0(+) (hu8E4VLbCL)和重链表达载体pcDNA3. 1 (+) (hu8E4VHbCH)。然后将轻、重表达载体共转染C0S-1细胞，用流式细胞术测定抗体的抗原结合活性，发现其与Raji的结合活性与8E4嵌合抗体相似，将这个人源化抗体(hu8E4Hb/hu8E4Lb)命名为 hu8E4。实施例4人源化抗体的稳定表达与纯化于3. 5cm组织培养皿中接种3 X IO5CHO-Kl细胞，细胞培养至90% -95%融合时进行转染取质粒 10 μ g (质粒 pcDNA3. 1 (+) (hu8E4VHbCH) 4 μ g，质粒 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (hu8E4VLbCL) 6 μ g)禾口 2 μ lLipofectamine2000Reagent (Invitrogen 公司产品)分别溶于 500 μ 1无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使 DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基， 然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600yg/ml G418 和250 μ g/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C过夜，用2% B SA-PBS于37°C封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgGl, κ )，37°C温育2h，加入HRP-羊抗人kappa进行结合反应，37°C温育lh，加入TMB于37°C作用5min，最后用H2SO4终止反应， 测A450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE 公司产品)分离纯化人源化抗体hu8E4。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。实施例5竞争抑制实验
用透析标记法标记抗体用0. 025M pH9. 5的碳酸盐缓冲液将预标记的抗体8E4稀释成浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将FITC配成0. lmg/ml的溶液盛于小烧杯中， 使透析袋浸没于FITC溶液中，在4°C避光搅拌24h。取出透析袋中标记液，用S印hadex G-50 过柱，去除游离荧光素，收集荧光抗体FITC-8E4备用。将固定的亚饱和浓度的荧光标记抗体FITC-8E4和系列稀释的未标记纯化抗体分别混合后加入到靶细胞Raja (1 X 106/ml)中， 4°C孵育60min，FCS-PBS洗细胞2遍，流式细胞仪检测并用Cellquest软件分析。Human IgG作为对照。竞争抗体的每个浓度设3个复管，计算半数抑制浓度IC5tl值，最大荧光强度表示在没有竞争抗体时获得的平均荧光强度。实验结果见图4，结果表明抗体hu8E4能完全阻断荧光标记抗体FITC-8E4与Raja 细胞的结合，它们的IC5tl值接近，表明人源化抗体具有与原鼠源抗体相似的特异性和亲和力(竞争抑制分析结果见表1)。表1.竞争抑制分析结果
抗体类型ICsobg/ml)3SDη
8Ε41.300.153
c8E41.160.113
hu8E41.360.173实施例6补体介导的细胞杀伤(⑶C)实验收集细胞后用无酚红RPMI 1640培养液洗两遍，重悬于无酚红RPMI 1640培养液， 调整细胞密度至lX106/ml，按ΙΟΟμ 1/孔将细胞悬液加入96孔细胞培养板。用无酚红 RPMI1640 培养液将 rituximab 和 c8E4，hu8E4 分别稀释至 100 μ g/ml、20 μ g/ml、4 μ g/ml、 0. 8 μ g/ml和0. 16 μ g/ml, 1% Triton-X 100作为阳性对照，human IgG作为无关抗体对照， PBS作为阴性对照，空白培养液作为空白对照。然后将稀释好的抗体样品及对照加入上述 96孔细胞培养板，20 μ 1/孔，同时按50μ 1/ml细胞悬液的比例加入新鲜人血清，补充无酚红RPMI1640培养液至总体积200 μ 1/孔。以上每组各设3个复孔，CO2培养箱作用4小时。 4小时后将96孔细胞培养板200g离心5分钟，每孔吸取50 μ 1上清至另一 96孔板相应孔中。按照Promega公司CytoTox 96 非同位素法细胞杀伤检测试剂盒中的方法加入混合好的显色液50 μ 1//孔至96孔板中，室温，避光作用30分钟。酶标仪读490nm的光吸收值。实验结果见图5，试验结果表明在⑶20高表达的细胞株Daudi (ATCC)和Raji中， c8E4和hu8E4已具有很强的⑶C活性，在10 μ g/ml的浓度时杀伤强度最强，c8E4和hu8E4 的⑶C作用均强于Rituximab ；而对照抗体humanlgG不能诱导Dauli细胞的⑶C作用。实施例7抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实验外周血单个核细胞(PBMC)的分离无菌采集静脉血，注入含有肝素20U/ml的离心管中，轻轻混勻。在生物安全柜中用无菌吸管加入等体积PBS溶液，使血液稀释以提高分离效果。取15ml离心管，每管加入 6ml室温的淋巴细胞分离液，倾斜离心管，沿管壁缓慢加入稀释后的抗凝外周血6ml/管。动作轻柔，以防破坏界面。20°C，800g离心30min。将刹车关闭，自然降速。管内分为三层，从上至下依次为血浆层、细胞分离液、红细胞及粒细胞层。血浆层与细胞分离液交界处毛玻璃样的白色层即为淋巴细胞及单核细胞层。用吸管轻轻插入毛玻璃样层，缓慢吸出外周血单个核细胞，放入另一 15ml离心管中。在吸出的细胞中加入PBS稀释后离心，200g,离心5min， 共洗2遍。用无酚红RPMI-1640培养液调整细胞密度为6X 106/ml，悬于15ml离心管中，加入160U/ml的IL-2预激活，置于37°C，5% CO2细胞培养箱备用。靶细胞悬液的准备对数生长期的细胞悬液吸至15ml离心管中，200g，离心5min，弃去上清，用PBS洗 2遍，无酚红的RPMI-1640重悬细胞，计数，调整细胞密度为3 X 105/ml备用。细胞与抗体的作用设定培养基背景孔、效应细胞+靶细胞自发释放值孔、效应细胞+靶细胞最大释放值孔及实验孔，每种情况都设3个平行孔，用无酚红RPMI-1640培养基将c8E4，hu8E4稀释至浓度分别为100μ g/ml、20y g/ml、4y g/ml、0. 8μ g/ml和0. 16 μ g/ml，每管加入调整好细胞密度的靶细胞，4°C作用30min后，200g离心5min，PBS洗2遍，悬于300 μ 1无酚红 RPMI1640培养液，将上述与抗体作用后的细胞悬液加入96孔板中，100 μ 1/孔，加入效应细胞IOOyl/孔，以40 1的效、靶比加入96孔板中，37°C，5% C02细胞培养箱12h 24h 后显色。显色、读数将96孔板20(^离心51^11后，每孔吸取5(^1上清至另一 96孔板相应孔中，根据 Promega公司CytoTox 96 非同位素法细胞杀伤检测试剂盒中的方法加入混合好的显色液 50 μ 1//孔至96孔板中，室温，避光作用30min，酶标仪读490nm的光吸收值。实验结果见图6，试验结果表明，c8E4和hu8E4在低浓度时的作用时不明显，在 10 μ g/ml的浓度时能引起明显的ADCC作用，c8E4和hu8E4的ADCC作用与Rituximab相比无明显差别.而对照抗体human IgG不能诱导Raji的ADCC作用。实施例8细胞凋亡实验在96孔培养板中加入数目相等的细胞，5X IO5/孔，将抗体分别以10 μ g/ml、 2 μ g/ml、0. 4 μ g/ml和0. 08 μ g/ml的终浓度加至相应细胞孔中，37°C作用18 24h后，加入5μ1 Annexin V-FITC，轻轻混勻，室温，避光反应15min，PBS重悬后上机，流式细胞仪检测分析染色情况。阴性对照为PBS，无关抗体对照为Human IgG。实验结果见图7，试验结果表明，c8E4和hu8E4在低浓度时的作用时不明显，在10 μ g/ml的浓度时能引起一定量的细胞凋亡，c8E4和hu8E4的凋亡作用与Rituximab相比无明显差别，而对照抗体human IgG 不能诱导Dauli细胞凋亡。实施例9生存率实验用3. 5X IO6Raji细胞尾静脉注射免疫8_10周龄雌性BALB/C小鼠，接种肿瘤细胞五天后，注射100 μ g相关抗体(C8E4、Rituximab、Human IgG和hu8E4)抗体，每天观察小鼠的存活状态。实验结果见图8，试验结果表明在同等剂量下，与注射Rituximab的小鼠相比，注射抗体c8E4和hu8E4组小鼠的生存时间得到了显著延长(P < 0. 05)。
权利要求
1.一种抗人⑶20人源化抗体，其重链超变区氨基酸序列为⑶Rl =SYNMH,⑶R2 AIYPENGDTSYNQKFKD 和 CDR3 :WHYYGNGGALDY，轻链超变区氨基酸序列为 CDRl :RASGNIHNYLA ； CDR2 NAKTLPD 和 CDR3 :QQFWSNPWT。
2.权利要求1所述的抗人⑶20人源化抗体，其重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO 10，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID N0:12。
3.权利要求2所述的抗人⑶20人源化抗体，其重链氨基酸序列为SEQIDNO :6，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO :8ο
4.一种核苷酸分子，编码权利要求1 3任一所述的抗人CD20人源化抗体。
5.权利要求4所述的核苷酸分子，其中编码重链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO :9， 编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO=Il0
6.权利要求5所述的核苷酸分子，其中编码重链的核苷酸序列为SEQID Ν0:5，编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO :7。
7.权利要求1 3任一所述的抗人CD20的人源化抗体的制备方法，包括通过计算机辅助设计出人源化抗体的氨基酸序列，全基因合成的重链和轻链可变区基因并经基因重组分别与人免疫球蛋白重、轻链恒定区基因拼接，克隆到真核表达载体中，分别构建人源化抗体的轻、重链表达载体，然后将轻、重链表达载体用脂质体法共转染CHO细胞，然后进行筛选、 培养纯化即得。
8.权利要求1 3任一所述的抗人⑶20的人源化抗体在制备治疗高表达⑶20的淋巴瘤药物中的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中高表达⑶20的淋巴瘤为非霍奇金氏淋巴瘤。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗人CD20人源化抗体hu8E4、其制备方法及用途，其中，本发明公开的抗人CD20人源化抗体hu8E4重链超变区氨基酸序列为CDR1SYNMH、CDR2AIYPENGDTSYNQKFKD和CDR3WHYYGNGGALDY，轻链超变区氨基酸序列为CDR1RASGNIHNYLA；CDR2NAKTLPD和CDR3QQFWSNPWT；本发明公开的抗人CD20人源化抗体hu8E4保留了原鼠源抗体的亲和力和特异性，并具有一定的生物学功能，可用于制备治疗高表达CD20的淋巴瘤药物。
文档编号A61P35/02GK102329394SQ20101022537
公开日2012年1月25日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者侯盛, 张大鹏, 李博华 申请人:上海中信国健药业股份有限公司