专利名称：乙肝核心蛋白与结核抗原或抗原片段的重组融合蛋白及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一系列基因工程重组融合蛋白，具体是涉及预防和/或治疗结核病的 重组融合蛋白。本发明涉及的重组融合蛋白中，乙肝核心蛋白的作用是提供允许多种结核抗原或 抗原片段联合，以增强针对结核分枝杆菌感染的免疫应答的蛋白载体。本发明提供了编码该系列重组融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，以及相应重 组融合蛋白的制备方法。本发明还涉及该系列重组融合蛋白在制备用于预防和/或治疗结核病的疫苗和 药物中的应用。
背景技术：
结核是一种人畜共患的慢性传染病，全球约有1/3的人口感染了结核杆菌 (Barker LF, Brennan MJ, Rosenstein PK, Sadoff JC. Tuberculosis vaccine research the impact of immunology. Curr Opin Immunol2009 ；21 (3) :331_8·)。近年来，由于耐药 株的出现，HIV的合并感染以及大规模高危人群的流动，结核病又开始死灰复燃(Hesseling AC, Marais BJ, Gie RP, Schaaf HS, Fine ΡΕ, Godfrey-Faussett P，et al. The risk ofdisseminated Bacille Calmette-Guerin (BCG) disease in HIV-infected children. Vaccine 2007 ;25 (1) :14_8.)。结核的保护性免疫主要是以T细胞介导的细胞免疫为 主。卡介苗是目前最广泛使用的结核疫苗，但是由于它只对儿童期散布性和脑膜结核有 效(Hesseling AC, Marais BJ, Gie RP, SchaafHS, Fine ΡΕ, Godfrey-Faussett P, etal. The risk of disseminated Bacille Calmette-Guerin(BCG) disease in HIV-infected children. Vaccine2007 ；25(1) :14_8.)，而且它还有可能干扰结核菌素皮肤实验筛查， 以及在某些免疫缺陷人群中存在安全隐患等(Doffinger R, Jouanguy E, Dupuis S， Fondaneche MC, Stephan JL, Emile JF, et al. Partial interferon-gammareceptor signaling chain deficiency in a patient with bacille Calmette-Guerin and Mycobacterium abscessusinfection. J Infect Dis 2000 ；181(1) :379_84·)，使得它仍然 有一些需要完善的地方。目前研究者们正在从多个角度着手发展新型结核疫苗，从安全性 的角度来看，亚单位疫苗被认为是非常值得期待的新型结核疫苗之一。然而现有的研究结 果表明，使用常规单一结核抗原来治疗或预防结核分枝杆菌感染的方法不能得到令人满意 的效果，因此，寻找新的具有更高保护力的结核杆菌抗原分子，探索候选抗原分子作为疫苗 的更为安全有效的形式，以及通过不同途径提高现有疫苗的保护力等，对于结核的有效控 制具有十分重要的现实意义。ESAT-6是从结核杆菌早期培养物滤液中分离得到的一种低分子量分泌性蛋 白，其基因位于结核杆菌的一段被称为可变区(Regionofdifference 1，RDl)的区域内， 比较基因组学的研究表明，ESAT-6基因仅在所有致病性结核杆菌中存在和表达，在所
3有BCG疫苗株和非致病性结核杆菌株中缺失，这提示ESAT-6很有希望成为研制结核疫 苗的一种非常有效的革巴分子(Brodin P, Rosenkrands I，Andersen P, Cole ST, Brosch R. ESAT_6proteins :protective antigens and virulence factors ？ Trends Microbiol 2004 ；12(11) :500-8·)。但是也有研究者发现(Stukova MA, Sereinig S, Zabolotnyh NV, Ferko B, Kittel C, Romanova J, et al. Vaccine potential ofinfluenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6protein. Tuberculosis (Edinb)2006 ； 86(3-4) =236-46.)，ESAT-6免疫的结果依赖于疫苗投递的方法当单纯以肽或DNA疫苗的 形式免疫时，在动物体内不能诱导显著的保护性免疫反应。Ag85复合物是目前受到关注的另一类结核抗原，包括三种密切相关的分枝酰基转 移酶，Ag85A、Ag85B、Ag85C，它们不仅参与细菌细胞壁及索状因子的合成，对结核分枝杆菌 结构的维持起重要作用，另一方面，由于它们被分泌后能够和宿主直接接触，也很容易引发 宿主的保护性免疫。尤其是其中的Ag85A和Ag85B被认为是最有效的结核抗原，并且是针对 结核感染的人T细胞反应的主要靶标(Gupta UD,KatochVM,McMurray DN. Current status ofTB vaccines. Vaccine 2007(25) :3742_3751.)。近年来，大多数已经进入到临床研究 阶段的结核亚单位疫苗都以Ag85A或Ag85B为其中的一个组分(Delogu G，Fadda G. The questfor a new vaccine against tuberculosis. J Infect Developing Countries 2009 ； 3(1) 5-15)。TB10. 4是另一个强有力的免疫显性蛋白，可以被接种过BCG的个体所识别。有研 究者 艮道(GuptaUD, Katoch VM, McMurray DN. Current status of TB vaccines. Vaccine 2007(25) :3742-3751.)，用TB 10. 4免疫接种可以在鼠源模型上诱导很好的保护作用，当 其与Ag85B融合时，它所引发的针对结核的保护作用与用Ag85B-ESAT6和BCG所激发的保 护作用相似，比单独用Ag85B和ESAT6蛋白效果要好。Mtb32C和PPE18均为结核分枝杆菌的细胞结合抗原，目前研究者们将它们联合 使用，得到融合蛋白Mtb72F，这种融合蛋白是目前被报道的唯一在小鼠，豚鼠和家兔模型 中均有保护作用的候选疫苗(GuptaUD, Katoch VM, McMurray DN. Current status of TB vaccines. Vaccine 2007(25) :3742_3751·)。上述结果提示我们，如果能够找到一种合适的载体分子，允许将足够多的结核抗 原或抗原片段联合起来，所得到的重组融合蛋白在预防和治疗结核病的能力上可能会比现 有的预防和治疗结核病的疫苗或药物有更大的提高。乙肝核心蛋白是一种较好的载体分子，它是乙肝核心抗原的结构成分，可以自我 装配成二十面体对称的颗粒样粒子，由于其具有高度的免疫原性，可允许对其分子的N端， C端和主要的免疫显性区域同时进行适当的外源序列插入，自身氨基酸的缺失和替换等修 饰，并能将与之融合的外源序列展示在所形成的颗粒的表面，使得它作为一种病毒样颗粒 载体，被广泛地用于细菌，病毒或原生质体等的亚单位疫苗或药物的研究。当前较为成功的 基于乙肝核心蛋白所制备的重组疫苗主要是流感疫苗(Schotsaert M,De FiletteM,Fiers W, Saelens X.Universal M2ectodomain_based influenza A vaccines !preclinical andclinical developments. Expert Rev Vaccines 2009 ;8 (4) :499_508.)禾口症疾疫苗 (Gregson AL,OliveiraG,Othoro C,Calvo-Calle JM,Thorton GB,Nardin Ε,et al. Phase I trial of an alhydrogel adjuvantedhepatitis B core virus-like particlecontaining epitopes of Plasmodium falciparum circumsporozoiteprotein. PLoS One 2008 ；3 (2) :el556.)，它们都已经完成了 I期临床的研究，并取得了显著的成果。此外，乙肝 核心蛋白作为免疫载体，还能够快速制备，无需佐剂，可经口腔途径免疫等，再加上它允许 在一个分子上进行多位点，不同外源序列的融合(外源序列的融合在不同的位点有相应的 长度限制)使得它在现代疫苗，尤其是联合疫苗的研究方面有着广泛的应用前景。另外，在这个基础上，如果能再适当增加若干对结核杆菌具有免疫原性，或增强针 对结核杆菌免疫反应，但是却不会影响或干扰结核抗原或其片段的免疫作用的辅助因子， 可能会使所得到的重组融合蛋白的免疫原性和抗原性有进一步增强和完善。本发明创造性地将常用结核抗原或抗原片段，以及免疫辅助因子以不同的组合方 式，插入到乙肝核心蛋白相同或不同的许可位点，希望能利用乙肝核心蛋白分子在插入外 源片段后依然能形成颗粒状结构，并将外源片段展示在颗粒表面，同时还能发挥免疫佐剂 效应等性质，来达到增强所插入的外源片段的免疫原性，得到优于现有预防和治疗结核病 的制剂的目的，为构建携带有多种结核抗原或抗原片段的新型结核疫苗或药物的研究提供 了思路。
发明内容
本发明的第一方面是提供一系列重组融合蛋白，该系列重组融合蛋白对结核病有 预防和/或治疗作用。本发明所涉及的重组融合蛋白，其特征在于该系列重组融合蛋白至少包含乙肝核 心蛋白和结核抗原或抗原片段两个部分，其中所述乙肝核心蛋白的特征在于对应于如SEQ ID NO 1所示序列或该序列N端的144个氨基酸。本发明所述的重组融合蛋白所包含的结核抗原或抗原片段，其特征在于至少为下 列一种结核抗原或抗原片段序列ESAT-6、TB10. 4、Ag85A、Ag85B、PPE18、MTB32C ；本发明所述的重组融合蛋白可能包含的免疫辅助因子，其特征在于至少为下列一 种免疫辅助因子序列IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF, IFN- y、IL-4 和 / 或 IL-6 ；本发明所述的重组融合蛋白中包含结核抗原或抗原片段序列，以及所述的免疫辅 助因子之间有/无连接序列。本发明所述的重组融合蛋白，当其结核抗原或抗原片段部分包括两种或两种以上 结核抗原或抗原片段序列时，所述的两抗原或抗原片段序列之间可以存在或不存在连接序 列；当其免疫辅助因子部分包括两种或两种以上免疫辅助因子时，所述的两免疫辅助因子 之间可以存在或不存在连接序列。在本发明的一个实施方式中，所述的乙肝核心蛋白的长度为氨基端144个氨基 酸，所述的结核抗原或抗原片段序列为全长的结核抗原ESAT-6，免疫辅助因子不存在。本发明的第二方面是提供制备乙肝核心蛋白、结核抗原或抗原片段、免疫辅助因 子重组融合蛋白的方法。制备乙肝核心蛋白、结核抗原或抗原片段、免疫辅助因子重组融合蛋白的方法包 括以下几个部分
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首先利用化学合成和重叠延伸PCR的方法得到乙肝核心蛋白分子的基因序列，再 通过重叠延伸PCR，或者通过引入常用的酶切位点的方法将结核抗原或抗原片段和免疫辅 助因子以一定的插入方式，分别插入到乙肝核心蛋白的相同或不同的许可位点，成为一个 人工基因，并将该基因在表达载体系统中表达后纯化，得到乙肝核心蛋白、结核抗原或抗原 片段、免疫辅助因子的重组融合蛋白。其中所述的结核抗原或抗原片段的插入方式为单抗原或抗原片段插入，单抗原 或抗原片段重复插入，单抗原或抗原片段经连接序列间隔后重复插入，不同抗原或抗原片 段串联插入，不同抗原或抗原片段串联重复插入，不同抗原或抗原片段经连接序列间隔后 串联插入，不同抗原或抗原片段经连接序列间隔后串联重复插入。其中所述的免疫辅助因子的插入方式为一种免疫辅助因子单独插入，单种免疫 辅助因子经连接序列间隔后重复插入，不同免疫辅助因子经连接序列间隔后串联插入，不 同免疫辅助因子经连接序列间隔后串联重复插入。其中所述的结核抗原或抗原片段在乙肝核心蛋白中的许可位点为以下任何位点 之一(1) 78-79位氨基酸之间；(2)替换76-81位氨基酸之间的任意η个氨基酸(1 < η < 6)；(3)羧基端最后一位氨基酸之后。其中所述的免疫辅助因子在乙肝核心蛋白中的许可位点为以下任何位点之一(1) 78-79位氨基酸之间；(2)替换76-81位氨基酸之间的任意η个氨基酸(1 < η < 6)；(3)羧基端最后一位氨基酸之后；附加条件是免疫辅助因子必须在结核抗原或抗原片段存在的前提下出现，两者之 间有/无连接序列。本发明的实施方式中，为单独的结核抗原ESAT-6直接插入到乙肝核心蛋白的位 点(1)中。本发明的第三方面是提供编码上述融合蛋白的核酸序列和氨基酸序列。由于基因 的简并性，编码相同肽段的核酸序列不是唯一的，但均应属本发明的保护范围。本发明的第四方面是提供了一种以本发明重组融合蛋白作为有效成分的疫苗或 药物，所以本发明还可以包括或不包括医学上可接受的药用辅料，如铝佐剂等。本发明在设计上将结核抗原或抗原片段，可能还包括免疫辅助因子插入到乙肝核 心蛋白的相同或不同位点，得到了能够激发机体产生针对结核分枝杆菌感染的免疫反应的 重组融合蛋白，初步评价了融合蛋白的免疫原性，为新型结核疫苗的研究做出了尝试。
图1所示为本发明中乙肝核心蛋白与结核抗原ESAT-6的重组融合蛋白ΗΕ6的结 构设计图。图2所示为重组融合蛋白ΗΕ6的基因扩增图。图3所示为重组融合蛋白ΗΕ6的诱导表达和纯化图。图中M为蛋白分子量标准， 泳道1为非诱导对照，泳道2为小样诱导表达，泳道3为纯化结果。
图4所示为重组融合蛋白HE6的免疫印迹图。图中㈧和⑶分别为抗HBc单抗 和抗ESAT-6单抗的检测结果，1为HE6未诱导对照，2为HE6小样诱导表达。图5所示为重组融合蛋白HE6的电镜检测结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于 限制本发明的范围。实施例1 以全长结核抗原ESAT-6插入到乙肝核心蛋白分子的78_79位氨基酸之 间为例，制备携带一种结核抗原的乙肝核心蛋白、结核抗原重组融合蛋白。1.HE6基因的构建结核抗原ESAT-6 —共有94个氨基酸，对应的核酸序列长度为282bp，借助质粒 pET21a-H144L2中载体蛋白，乙肝核心蛋白(HBc) 68-70位氨基酸对应的核酸序列中存在的 Msc I酶切位点和重叠延伸PCR技术，通过将ESAT-6分两段，先分别扩增出长度约为329bp 的上游序列E段和长度约为190bp的下游序列H段，再通过两段部分序列的互补，将整个 ESAT-6基因融合引入，得到嵌合有ESAT-6的HBc融合序列，命名为HE6，见图1。引物E-I-up 5~ Jccat cctgggtgggaagtaatttggaagacacagagcagcagtggaatt-3E-I-down :5_taattccctggatgctggtgcgaacatcccagtgacgttgc_3E-2~up :5-gcaacgtcactgggatgttcgcaccagcatccagggaatta-3E-2-down :5- c^c|aagctt} ttacggaagtgttgataagataggggcatttgg-3 14W%iSΨM 基，方框内分别为1/2的Msc I的酶切位点及HindIII的酶切位点。第一轮PCR以质粒PAS22-ESAT-6为模板，通过引物Elu和Eld，扩增出第一个片段E，以质粒 pET21a-H144L2为模板，通过引物E2u和E2d，扩增出第二个片段H。反应条件均为94°C预变 性 5min, 94°C变性 30sec，61. 4°C退火 30sec, 72°C延伸 45sec, 25 个循环，再 72°C延伸 7min。第二轮PCR以pET21a-H144L2为模板，利用引物Elu和E2d，将上述第一轮PCR得到的E和H 片段的回收产物融合。具体反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30sec，65°C退火30sec， 72°C延伸lmin, 25个循环，再72°C延伸7min。扩增结果如图2所示，得到了预期为519bp的含有全长ESAT-6基因序列和部分乙 肝核心蛋白基因序列的核酸片段。之后通过分步用内切酶Msc I和Hind III对上述得到的 融合核酸片段和质粒pET21a-H144L2进行酶切，以及将回收的片段用T4DNA Ligase进行连 接，得到了携带有乙肝核心蛋白与ESAT-6的融合质粒，pET21a-HE6, HE6的核酸序列如SEQ ID NO :2。2. HE6的诱导表达及WB验证采用常规的CaCl2转化的方法将得到的融合质粒转化进大肠杆菌DH5 α中，对质 粒进行扩增富集，并测序鉴定。利用promega公司的试剂盒并参照其说明对上述测序正确 的克隆提质粒，并将提得的质粒按CaCl2转化的方法转化至表达宿主大肠杆菌BL21中进行 蛋白的诱导表达，通过SDS-PAGE分析蛋白的表达水平。重组融合蛋白HE6 —共有239个氨基酸，理论分子量为26. 2kD，蛋白序列如SEQNO :3，诱导表达结果如图3所示，与预期符合。 通过抗HBc抗体和抗ESAT-6抗体对得到的重组融合蛋白的表达进行验证，结果如图4所 示，诱导表达的重组融合蛋白可以很好地与抗HBc抗体和抗ESAT-6抗体结合。3. HE6的纯化和颗粒性检测对经上述WB验证的重组融合蛋白HE6进行放大培养，并通过DEAE流穿，硫酸铵沉 淀，以及凝胶分离的方法来富集蛋白，通过负染和透射电镜技术对得到的重组融合蛋白进 行颗粒性检测，结果如图4和图5所示，重组融合蛋白HE6经上述步骤纯化后可以较好的分 离和富集，Bandscan软件检测蛋白纯度的结果约为80%，并且可以形成透射电镜下可见的 颗粒结构。小结本部分实施例通过重叠延伸PCR技术，将全长的结核抗原ESAT-6插入到乙肝核心 蛋白分子的78-79位氨基酸之间，得到了乙肝核心蛋白结核抗原重组融合蛋白HE6。通过 WB技术在体外验证了重组融合蛋白HE6与特异性抗体的结合，通过DEAE流穿，硫酸铵沉淀 和凝胶分离技术对表达的蛋白进行了富集，Bandscan软件检测的结果表明上述方法纯化得 到的蛋白纯度约为80 %。通过负染和透射电镜技术证明了重组融合蛋白HE6可以形成电镜 下可见的颗粒结构。实施例2 以HE6为例在动物模型上进行重组融合蛋白的免疫学评价。1.动物实验30只4-5周龄的无菌雌性BALB/c小鼠被随机分为5组，分别经皮下注射免疫载体 HBC-N144、HE6、rESAT_6，各蛋白的免疫剂量均为20 μ g抗原Λ00 μ 1/只，前三次免疫分别 间隔两周，第四次免疫10天后处死小鼠取脾脏，开展细胞免疫的检测。由于免疫载体HBc 还被报道自身可能具有免疫佐剂的效应，所以在本实施例中还设置一组ΗΕ6不加佐剂的对 照，另外HBC-N144或空白组(blank)均被作为阴性对照，各组均使用氢氧化铝佐剂(其中 铝的终浓度为1.0mg/ml)。取小鼠三免后血清同时检测体液免疫的情况。2. ELISA检测体液免疫虽然结核的免疫以细胞免疫为主，体液免疫对保护性可能影响不大，但对疫苗的 免疫程序、安全性等有一定意义，因此本研究检测了小鼠对重组融合蛋白HE6产生抗体的 水平，具体方法如下①ELISA板条(96孔)分别用200ng/孔的rESAT-6包被4°C过夜；②用PBS-0. 05% (v/v) Tween20溶液洗板三次，每次5min，于吸水纸上拍打干净；③将ELISA 板用封闭液(PBS-2% (w/v)BSA)于 37°C封闭 Ih ；④将小鼠血清按1/100起的浓度加入到ELISA板条中，之后按倍比稀释的方法系 列稀释，ELISA板的最后一列留空，作为阴性对照孔，于37°C孵育Ih;⑤将孵育好的ELISA板条用PBS-0. 05% (v/v) Tween20溶液洗板四次，每次5min， 于吸水纸上拍打干净后加入1/8000稀释的HRP-小鼠IgG或IgGl或IgG2a，再次于37°C孵 育Ih;⑥将孵育好的ELISA板条用PBS-0. 05% (v/v) Tween20溶液洗板四次，每次5min， 于吸水纸上拍打干净后加入TMB溶液于暗处显色；⑦5min后用2M的H2SO4终止反应，并用酶连仪(Bio-Rad)于OD45tl读值；
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⑧以大于2倍阴性孔OD45tl值的孔为阳性孔。3.检测细胞免疫(1)小鼠脾脏单细胞悬液的制备具体步骤如下①将小鼠断颈处死，浸泡于75%的乙醇中5min ；②无菌，取5ml完全RPIM1640培养基于培养皿中，在培养皿中放置一个200目的 细胞筛，取脾脏(解剖位置位于小鼠的左上腹腔)，置于平皿内200目的细胞筛上，用注射器 针芯研磨，使其分散为单个细胞，再加入15ml完全RPM1640培养液冲洗细胞筛，使终体积 为 20ml ；③将上述细胞悬液转移至50ml的尖底离心瓶中，10°C，400g(转头4180)，5min， 离心脾细胞悬液，吸出上清；④用3ml ACK裂解缓冲液重悬细胞沉淀，在室温下孵育3-5min以裂解红细胞；⑤再加入27ml完全RPMI1640培养液至细胞悬液中混勻，10°C，400g (转头 4180)，5min,离心脾细胞悬液；⑥吸出上清，用30ml完全RPMI1640重悬细胞沉淀，10°C，400_500g，5min,弃上清，
细胞沉淀备用；⑦用IOml完全RPI1640培养基充分重悬细胞沉淀；⑧对细胞进行计数，并将其用完全RPMI1640调整至浓度为5. 0X 106Cells/ml。(2) ELISP0T 法检测 IFN- γ具体方法如下第一天①预湿每孔加入15 μ LMagiTM Coating Buffer (达科为公司)润湿各孔内的 PVDF 膜；②包被润湿之后，无须洗涤，每孔加入50 μ L PBS稀释好的包被抗体，4°C包被过 夜；③封闭(第二天)倾倒包被液，用PBS洗涤3次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣 干。200 μ L/孔加入用IXPBS稀释好的封闭液，37°C封闭Ih ；④倾倒封闭液，无须洗涤，直接加入检测细胞进行ELISP0T检测。第二天①将计数好的细胞悬液调整为5X 106ml，按100 μ L/孔的量分别加入到96孔板 中，每个处理做3个复孔；②在细胞种到96孔板时同时加入刺激物，并于37°C孵箱孵育，其中特异性刺激 物:rESAT-6和HBC-N144终浓度为10μ g/ml,非特异刺激物的终浓度为PMA :50ng/ml, ionomycin 1 μ g/ml ；③裂解细胞培养约20h后，倾倒孔内的细胞及培养基，200 μ L/孔加入冰冷的去 离子水，4°C冰浴IOmin(低渗法裂解细胞)；④洗涤每孔加入200 μ L wash buffer，浸泡3_5mins后扣出洗涤液，重复5次， 最后一次，在吸水纸上扣干；⑤加入检测抗体每孔加入IOOyL稀释好的生物素标记检测抗体，37°C孵育Ih ；⑥洗涤每孔加入200 μ Lwash buffer，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次， 在吸水纸上扣干；⑦加入酶标亲和素每孔加入100 μ L稀释好的酶标亲和素，370C 1小时；⑧洗涤每孔加入200 μ L wash buffer，浸泡3_5mins后扣出洗涤液，重复5次， 最后一次，在吸水纸上扣干；⑨显色解冻已配好的AEC显色液。每孔加入IOOyL的显色液，室温静置 30min (在20-25 0C，显色25min较合适)，注意避光；⑩待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣 在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜 自然晾干。将晾干的ELISP0T提交达科为公司读板。(3)流式细胞术检测IFN-Y1)将计数好的脾细胞悬液按5X 106cellS/ml的浓度转移到6孔板中，同时设置加 非特异性刺激物的阳性对照孔和不刺激的阴性对照孔，以及同型对照孔，每孔2. 5ml ；2)各孔加入特异性刺激物rESAT-6后于37 °C孵箱培养，每孔中特异性刺激物 rESAT-6的终浓度为10 μ g/ml ；3)4-6h后各孔加入终浓度为10 μ g/ml BFA,同时在所设置的阳性对照孔中加入终 浓度为500ng/ml的Ionomycin和终浓度为5ng/ml的PMA ；4) 6h后收集细胞，将细胞转移到流式管中，2管，10°C，400g, 5min ；5)吸弃上清，用 2ml 的 RPMI1640 重悬细胞，10°C，400g，5min ；6)弃上清，每管各加入 2ml stain Buffer (FBS)重悬细胞沉淀，10°C，400g，5min ；7)弃上清后，估计剩余液体体积，并在每管中分别加入5 μ 1小鼠APC-ant i CD3 ε，PerCP-antiCD4，FITC_antiCD8a抗体，补齐至50 μ L，使抗体的终浓度为 1 μ g/106cells, 10°C避光孵育 30min ；8)向原有孔中再加入 0. 5mL stain buffer，洗细胞 1 次，10°C，400g，5min ；9)弃上清，用100 μ L Cytof ix/Cytoperm 充分重悬细胞，室温，孵育20min ；10)加400 μ L的Perm/wash solution使终体积为500 μ L，将6孔板分出的管分 别分为两管，wash细胞一次，IO0C，400g, 5min ；11)用含有 ΡΕ-antiIFN- γ 的 50 μ L 的 Perm/Wash solution 重悬细胞沉淀，同型 对照管加入等量的 PE-Rat IgGl, κ Isotype Control，10°C，避光孵育 30min ；12)向原有孔中再加入150 μ L Perm/Wash solution，使终体积为200 μ L，洗细胞 1 次，10°C，400g，5min ；13)加 200 μ L 的 Perm/wash solution，再 wash 细胞一次，10°C，400g，5min ；将上 述离心后的细胞沉淀用200 μ L的stain buffer重悬；14)进行流式分析。小结本部分实施例的结果表明，单纯用重组ESAT-6免疫时，ESAT-6特异的IgG约为 3. 63 X IO3 ；当用HE6不加佐剂或使用铝佐剂免疫时，ESAT-6特异的IgG滴度大于IO4或105， 这提示HBc的加入显著地增加了针对ESAT-6的抗体反应。我们同样也检测了相关的抗体 亚类，检测的结果表明，HE6不加佐剂组和使用铝佐剂组激发的IgGl和IgG2a的水平均显著高于rESAT-6单独加铝佐剂免疫组，然而分析特异性抗体IgG2a和IgGl比值，组与组之 间比较没有统计学差异(P均大于0. 05)。 本部分实施例中，细胞免疫反应的检测结果表明在rESAT-6刺激下，HE6不加佐剂 组或使用铝佐剂组较rESAT-6组，载体组和空白组，分泌IFN- γ的T细胞数目均有显著增 加，这主要是rESAT-6特异的T细胞数目的增加。这提示HBc的使用有助于刺激Thl型细 胞反应。另外，流式的结果表明经rESAT-6刺激后的所检测到的HE6不加佐剂组对应的脾 IFN- γ +⑶4+T细胞频率和IFN- γ +⑶8+Τ细胞频率，均显著高于单独用rESAT-6加铝佐剂免 疫组小鼠和空白组小鼠。我们也发现HE6不加佐剂组和使用氢氧化铝佐剂组经刺激后产生 的ESAT-6特异的T细胞频率的增加在数值上没有显著性差异，这提示我们佐剂效应可能依 然存在。
权利要求
一种重组融合蛋白，其特征在于该重组融合蛋白至少包含乙肝核心蛋白和结核抗原或抗原片段两个部分，其中所述乙肝核心蛋白的特征在于对应于如SEQ ID NO1所示序列或该序列N端144个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的结核抗原或抗原片段，其特征在于至少为下列一种结核抗原 或抗原片段序列ESAT-6、TB10. 4、Ag85A、Ag85B、PPE18、MTB32C ；
3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白还可以包含至少下列一种免疫辅助因子序列IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN- y、IL-4 和 / 或 IL-6 ；
4.编码根据权利要求1，2，3所述的由乙肝核心蛋白、结核抗原或抗原片段、免疫辅助 因子所构成的重组融合蛋白的核酸和氨基酸序列。
5.制备编码权利要求1，2，3所述重组融合蛋白基因序列的方法，是利用化学合成和重 叠延伸PCR的方法得到乙肝核心蛋白片段所对应的基因序列，再通过重叠延伸PCR，或者通 过引入常用的酶切位点的方法将结核抗原或抗原片段和免疫辅助因子以一定的插入方式， 分别插入到上述乙肝核心蛋白的相同或不同的许可位点。
6.根据权利5所述的插入方式，其特征在于结核抗原或抗原片段的插入方法为单抗原或抗原片段插入，单抗原或抗原片段重复插 入，单抗原或抗原片段经连接序列间隔后重复插入，不同抗原或抗原片段串联插入，不同抗 原或抗原片段串联重复插入，不同抗原或抗原片段经连接序列间隔后串联插入，不同抗原 或抗原片段经连接序列间隔后串联重复插入。免疫辅助因子的插入方式为一种免疫辅助因子单独插入，单种免疫辅助因子经连接 序列间隔后重复插入，不同免疫辅助因子经连接序列间隔后串联插入，不同免疫辅助因子 经连接序列间隔后串联重复插入。
7.根据权利5所述的结核抗原或抗原片段在乙肝核心蛋白中的许可位点，其特征在于 是以下任何位点之一(1)78-79位氨基酸之间；(2)替换76-81位氨基酸之间的任意η个氨基酸(1≤ η ≤ 6)；(3)羧基端最后一位氨基酸之后。
8.根据权利要求5所述的免疫辅助因子在乙肝核心蛋白中的许可位点，其特征在于是 以下任何位点之一(1)78-79位氨基酸之间；(2)替换76-81位氨基酸之间的任意η个氨基酸(1≤ η ≤ 6)；(3)羧基端最后一位氨基酸之后；附加条件是免疫辅助因子必须在结核抗原或抗原片段存在的前提下出现，两者之间有 /无连接序列。
9.一种以本发明重组融合蛋白作为有效成分的疫苗或药物，其特征在于所述疫苗或 药物中有/无医学上可以接受的药用辅料。
10.根据权利9所述的疫苗或药物，在预防和/或治疗结核病中的应用。
全文摘要
本发明涉及乙肝核心蛋白和结核分枝杆菌抗原或抗原片段所构成的一种或数种重组融合蛋白，所述的结核抗原或抗原片段以单抗原或抗原片段，或者组合在一起的多种抗原或抗原片段的形式插入到乙肝核心蛋白的相同或不同的许可位点。本发明所述的重组融合蛋白还可以包含一些的免疫辅助因子。此外，本发明还涉及结核抗原或抗原片段及免疫辅助因子与乙肝核心蛋白的融合形式，编码相应重组融合蛋白的核酸和氨基酸序列，以及本发明中重组融合蛋白的制备方法及其在制备用于预防和/或治疗结核病疫苗和药物中的应用。
文档编号A61P31/06GK101891825SQ20101022679
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者付玲, 侯利华, 张军, 徐俊杰, 李 浩, 殷瑛, 董大勇, 陈薇 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所