专利名称：一种新型抗肿瘤细胞化合物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及萘酰亚胺类化合物的用途，尤其涉及抗肿瘤细胞化合物Bl化合物用 以耐药的作用。
背景技术：
化疗是治疗肿瘤的主要手段之一，肿瘤细胞产生的多药耐药已成为当前影响肿瘤 化学治疗疗效的主要障碍，有关资料统计，90%以上肿瘤患者死因或多或少都与耐药有关。 近年来，细胞凋亡与多药耐药及肿瘤细胞的抗药性的关系日益受到人们的关注，研究发现 抑制凋亡与耐药的形成存在一定的关系。细胞凋亡过程受到许多癌基因调控，如P53基因 及Bcl-2家族等。Bcl-2基因为一抑制细胞凋亡的原癌基因，同时也是一种耐药基因。当 Bcl-2蛋白过度表达时，可引起细胞不死亡或病死率下降的抗凋亡作用，从而对抗药物的治 疗作用，使化疗药物失去效果。即Bcl-2导致耐药主要是通过抑制肿瘤细胞的凋亡途径而 完成。促凋亡基因中Bax功能与Bcl-2相反，当Bax增加时自身可形成同源二聚体，致使细 胞凋亡加速，肿瘤细胞对化疗药物敏感性增强。当Bcl-2表达增加，Bax同源二聚体解离， 形成Bcl-2/Bax异源二聚体，抑制了 Bax-Bax同源二聚体的细胞凋亡作用，从而肿瘤细胞对 化疗药物产生耐药性。临床上遇到这种情况通常是以更换治疗方案为对策(如间断用药， 替换用药，联合用药等)，但因为多数患者是多药耐药，所以更换方案后往往效果亦不佳，最 终导致化疗失败。因此寻找低毒有效的抗肿瘤细胞耐药的化合物是提高化疗疗效的一个重 要方法。萘酰亚胺类化合物Bi，是一种新型的DNA嵌入剂。该化合物已被报道能通过激发 P53基因的信号通路诱导肿瘤细胞周期阻滞及凋亡，达到抗肿瘤的目的。但是，化合物Bl在 抗肿瘤细胞耐药方面的应用，还未见报道。
发明内容
为了解决上述肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的问题，本发明的目的是提供了萘 酰亚胺类化合物Bl的一种新用途，即克服Bcl-2高表达引起的多药耐药的作用。本发明所采用的化合物Bl是由实验室化学合成，结构式如下所示 上述化合物Bl用以抗肿瘤细胞耐药性。进一步，所述耐药性为Bcl-2高表达的肿瘤细胞所产生的耐药性。进一步，所述的耐药肿瘤为良性肿瘤或恶性肿瘤。进一步，所述肿瘤为恶性黑色素瘤，或恶性淋巴瘤，或消化器官的肿瘤，或肺癌， 或乳癌，或睾丸癌，或卵巢癌，或子宫癌，或前列腺癌，或上颚癌，或舌癌，或口腔癌，或咽喉 癌，或甲状腺癌，或脑部肿瘤，或骨肉瘤，或白血病，或神经系统肿瘤，或膀胱肿瘤，或皮肤 癌，或皮肤附属器官癌，或皮肤转移癌。进一步，所述消化器官的肿瘤为胃癌，或肠癌，或肝癌，或胆囊癌，或胆道癌，或胰 腺癌。进一步，该化合物Bl用以制备具有抗肿瘤细胞耐药性的抗肿瘤药物。进一步，所述药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸 剂或注射剂。且该种萘酰亚胺类化合物Bl低毒，适合于人和哺乳类动物经口和非经口给药。且该种萘酰亚胺类化合物Bl的剂型无特定的限制，可作为经口给药的散剂，丸 剂，片剂，胶囊剂等固型制剂，也可作为非经口给药的外用剂，软膏，贴敷剂，注射剂。且该种萘酰亚胺类化合物Bl，通常能与不影响药理学作用的辅助料配合制成经口 和非经口给药的制剂。且该种萘酰亚胺类化合物Bi，可经水溶剂(如蒸留水)，水溶性制剂(如生理盐 水)脂溶剂(如胡麻油)等的溶剂用常规法调制。且该种萘酰亚胺类化合物Bi，通常能与药理学上允许的添加成分(稀释剂，着色 剂，安定剂，界面活性剂，助溶剂，缓冲剂，矫味剂，香料，保存剂，糖衣剂)相组合，用于经口 和非经口剂型。且该种萘酰亚胺类化合物Bi，在剂型上通常能与药理学上允许的稀释成分和成型 成分相组合，用于经口和非经口剂型。且该种萘酰亚胺类化合物Bl经口剂型，是指片剂，丸剂，颗粒剂，散剂和胶囊。非 经口剂是指静脉注射剂，肌肉注射剂和皮下注射剂，浴剂，直肠，肛门和阴道给药。本发明所述的萘酰亚胺类化合物Bl抗肿瘤细胞耐药的作用的有益效果如下(1) 具有临床应用前景，萘酰亚胺类化合物Bl可杀伤Bcl-2高表达的肿瘤细胞，其药效不受常 规耐药机理影响，对HL60/Bcl-2细胞的杀伤能力与HL60细胞基本一致。(2)该化合物具有 较低的毒性，因此具有较好的临床肿瘤化疗、尤其是抗临床肿瘤多药耐药的应用前景。
图1是萘酰亚胺类化合物Bl对肿瘤细胞形态的影响。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例做进一步的说明。为进一步了解本发明，下面结合具体实施例作进一步说明。实施例1萘酰亚胺类化合物Bl能克服Bcl-2高表达引起的肿瘤细胞耐药实验材料
HL60细胞株购自中国科学研究院细胞所。质粒pSFFV-neo，pSFFV-neo Bcl-2购自 美国Addgene公司。真核转染pSFFV_neo Bcl-2质粒，G418筛选得到HL60的Bcl_2高表 达株。萘酰亚胺类化合物Bl由实验室合成。噻唑蓝(3-(4，5-dimethylthiaZ0l-2-yl)-2， 5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)购自 Sigma 公司。对照组、载体组的处理作下说明对照组细胞加入RPMI 1640培养液实验方法(1)先将对数生长期细胞2 XlO5ceIVml接种于96孔培养板，每孔0. 1ml，培养6 小时。(2)实验组加入含浓度范围在0-5 μ M的药物的RPMI 1640培养液，对照组则用等 体积的培养液，每组设3个以上的平行孔，置37°C，5% CO2及饱和湿度的培养箱培养48h。(3)培养结束后，吸弃上清，然后每孔加入100 μ 1的含5mg/ml的MTT，37°C继续培 养4小时。(4)小心吸弃上清，每孔加入100 μ 1的DMSO溶解甲臜，振荡lOmin，待MTT还原产 物完全溶解，在酶标议上用波长为570nm，参比波长为630nm测定光密度(OD)值，计算细胞 的生长抑制率。
1_ 恋臉 ΗΟΓ)⑶数据处理细胞生长抑制率=^qd Χ 100%实验结果药物作用48小时，萘酰亚胺类化合物Bl对HL60/Bcl-2和HL60细胞株的IC50非 常接近，说明该化合物能克服由Bcl-2高表达引起的肿瘤细胞耐药。表1 萘酰亚胺类化合物 Bl 对 HL60、HL60/vector、HL60/Bcl_2 的 IC50 实施例2萘酰亚胺类化合物Bl诱导肿瘤细胞形态的改变实验材料Hoechst33258购自上海美季生物技术有限公司。实验方法(1)对数生长期细胞2 X IO5个/ml接种于24孔板，立刻加药，对照组加等量体积 的RPMI1640培养液。(2)处理36小时后离心，倒去上层RPMI 1640培养基，用PBS洗2次，离心去上清 (1500rpm,5min)。(3)加固定液(甲醇乙酸=3 1)，4°C固定lOmin。(4) Hoechst 33258 (5 μ 1/ml)染色，5min。(5) 356nm紫外激发，荧光显微镜下观察并照相。实验结果
HL60细胞及HL60/Bcl_2细胞经0. 3 μ MBl作用48小时后，Hoechst染色，细胞呈 现核染色质浓缩、核碎裂以及出现凋亡小体等典型的细胞凋亡特征(图1)。对照组和载体 组细胞均无形态学变化，所发荧光较均勻(图1)。实施例3萘酰亚胺类化合物Bl诱导HL60及HL60/Bcl_2细胞凋亡实验材料Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自上海美季生物技术有限公司。实验方法(1) 1 X IO6个细胞用0. 3 μ MBl处理48小时；(2) IOOOg (约1000-2000rpm)离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞；(3)重悬的细胞，IOOOg离心5min，弃上清，加入195 μ 1 Annexin V-FITC结合液 (IX)轻轻重悬细胞；(4)加入 5 μ 1 Annexin V-FITC，轻轻混勻；(5)室温(20-25°C )避光孵育lOmin，可以使用铝箔进行避光；(6) IOOOg离心5min,弃上清，加入190 μ 1 Annexin V-FITC结合液(IX)轻轻重悬 细胞； (7)加入10 μ 1碘化丙啶染色液，轻轻混勻，冰浴避光放置；(8)随即进行流式细胞仪检测，Armexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光，激发 波长Ex = 488nm ；发射波长Em = 530nm实验结果如表2 所示，0. 3gM Bl 分别作用 HL60、HL60/vector 和 HL60/Bcl_2 细胞 48 小时 后，其凋亡率均达到50 %以上。表2萘酰亚胺类化合物Bl处理HL60、HL60/vector、HL60/Bcl_2后的凋亡率 以上实例说明萘酰亚胺类化合物Bl能够克服Bcl-2高表达引起的多药耐药，且 对HL60/Bcl-2细胞的杀伤能力与HL60细胞基本一致。
权利要求
一种新型抗肿瘤细胞化合物的用途，该抗肿瘤细胞化合物B1结构式如下，其特征在于该化合物B1用以抗肿瘤细胞耐药性。FSA00000190920800011.tif
2.如权利要求1的新型抗肿瘤细胞化合物的用途，其特征在于，所述耐药性为Bcl-2高 表达的肿瘤细胞所产生的耐药性。
3.如权利要求2的新型抗肿瘤细胞化合物的用途，其特征在于，所述的耐药肿瘤为良 性肿瘤或恶性肿瘤。
4.如权利要求3的新型抗肿瘤细胞化合物的用途，其特征在于，所述肿瘤为恶性黑色 素瘤，或恶性淋巴瘤，或消化器官的肿瘤，或肺癌，或乳癌，或睾丸癌，或卵巢癌，或子宫癌， 或前列腺癌，或上颚癌，或舌癌，或口腔癌，或咽喉癌，或甲状腺癌，或脑部肿瘤，或骨肉瘤， 或白血病，或神经系统肿瘤，或膀胱肿瘤，或皮肤癌，或皮肤附属器官癌，或皮肤转移癌。
5.如权利要求4的新型抗肿瘤细胞化合物的用途，其特征在于，所述消化器官的肿瘤 为胃癌，或肠癌，或肝癌，或胆囊癌，或胆道癌，或胰腺癌。
6.一种新型抗肿瘤细胞化合物的用途，该抗肿瘤细胞化合物Bl结构式如下，其特征在 于该化合物Bl用以制备具有抗肿瘤细胞耐药性的抗肿瘤药物。
7.如权利要求6的新型抗肿瘤细胞化合物的用途，其特征在于，所述药物的制剂形式 包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸剂或注射剂。
全文摘要
本发明提供了一种新型抗肿瘤细胞耐药的化合物(B1)的新用途，即应用此化合物使得Bcl-2高表达的肿瘤细胞的作用不受Bcl-2抗凋亡蛋白高表达的影响，而且该化合物对Bcl-2高表达的肿瘤细胞的杀伤能力与其亲本肿瘤细胞基本一致，具有较低毒性，因此具有很好的临床应用前景。
文档编号A61P35/00GK101890009SQ20101022702
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者刘建文, 吴爱斌, 姜子敬, 崔大岺, 张焕英, 徐可, 徐玉芳, 林冰, 梁欣, 金惠, 钱旭红 申请人:华东理工大学