专利名称：一类新的抑制新生血管的小肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一类新的抑制新生血管的小肽，所述的小肽是源于胎盘生长因子(Placenta Growth Factor,P1GF)的多肽。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
背景技术：
新生血管的形成是一个极其复杂的过程，它包括现存血管的扩张、血管通透性的增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成。在眼部，约2/3的致盲性疾病均与病理性新生血管有关，例如单纯疱疹性角膜基质炎引起的角膜新生血管，年龄相关性黄斑变性中的脉络膜新生血管，以及糖尿病视网膜病变或早产儿视网膜病变中的视网膜新生血管等。目前临床上，对于眼部病理性新生血管常规运用激光光凝、光动力学疗法(Wiotodynamic therapy, PDT)以及经瞳孔温热疗法 (Thermal transpupillary therapy,TTT)等进行治疗。然而，这些治疗手段不仅对局部组织易造成破坏，此外其远期疗效也并不十分令人满意。因此，近年来人们不断尝试开发治疗眼部病理性新生血管更有效的方法。在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76. 5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体(如氨基酸转运体、寡肽转运体等)结合的药物才能到达前房发挥作用。第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药的浓度。用于治疗肿瘤新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。此外，分子量较大的外源性蛋白质也是敏感的异物源，可对眼部组织(如葡萄膜)造成免疫损伤。第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如血管抑素(angiostatin)，它由纤溶酶原 Kringle 结构域 1-4 (plasminogen Kringle 1-4) 组成，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。正是由于上述种种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限， 比如重组抗人VEGF单克隆抗体bevacizumab (Avastin)、重组抗人VEGF单克隆抗体片段 ranibizumab (Lucentis)等，但它们价格高昂，并且需反复经玻璃体腔给药，甚至可引起血
管栓塞等风险。因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9] -[XaalO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8] (I)式中，XaaO是无，或1_3个氨基酸构成肽段；Xaal是选自下组的氨基酸Val或Leu ；Xaa2是选自下组的氨基酸Ser或Thr ；Xaa3是选自下组的氨基酸:Leu, lie，Val，或Ala ；)(aa4是选自下组的氨基酸Leu，lie，Val，或Ala ；Xaa5是选自下组的氨基酸Arg或Lys ；Xaa6是选自下组的氨基酸Cys或kr ；Xaa7是选自下组的氨基酸Thr或kr ；Xaa8是选自下组的氨基酸Gly或Ala ；Xaa9是选自下组的氨基酸Cys或kr ；XaalO是选自下组的氨基酸Cys或kr ；Xaall是选自下组的氨基酸Gly或Ala;Xaa 12是选自下组的氨基酸Asp或Glu ；Xaa 13是选自下组的氨基酸Glu或Asp ；Xaa 14是选自下组的氨基酸Asn或Gln ；Xaal5是选自下组的氨基酸:Leu, lie，Val，或Ala ；Xaa 16是选自下组的氨基酸His或Arg ；Xaa 17是选自下组的氨基酸Cys或kr ；XaalS是选自下组的氨基酸无，或1_3个氨基酸构成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为17-23个氨基酸。在另一优选例中，XaalS是3个氨基酸构成的肽段。更佳地，所述的肽段为VPV、在另一优选例中，XaaO为Cys。在另一优选例中，所述多肽的长度为18-21个氨基酸。在另一优选例中，所述多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO :1、2、3或4所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :1、2、3或4所示氨基酸序列经过1_5个(较佳地1_3，更佳地 1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID NO 1的所示多肽的抑制血管新生活性。在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO 1的相同性彡80 %，较佳地 ^ 90% ；更佳地彡95%。本发明还提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有(a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途， 它们被用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。在另一优选例中，所述的与血管新生相关疾病的选自下组新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、 Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。在另一优选例中，所述的新生血管性眼病包括累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜， 包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。在另一优选例中，所述的对象是人。在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示了小肽ZYl的高效液相色谱分析的纯度鉴定。图2显示了小肽ZYl对鸡胚尿囊膜上新生血管的影响。其中，图A :PBS组(阴性对照组)；图B 小肽ZYl低浓度(2ug/ul)组；图C 小肽ZYl高浓度(10ug/ul)组。图D中， 纵坐标为滤纸片周2. 5mm范围内3_5级微血管数。图3A至3C分别显示了小肽ZY2-4对鸡胚尿囊膜上新生血管的抑制作用。其中， 纵坐标为滤纸片周2. 5mm范围内3_5级微血管数，*表示P < 0. 05 ；^表示P < 0. 01。图4A显示小肽ZYl对小鼠角膜病理性新生血管的影响小肽ZYl明显具有抑制新生血管的效应。图中，*表示小颗粒所在部位，Δ表示新生血管生长部位。图4Β中，横坐标分别为1 空白对照组(即阴性对照组)；2 =VEGF组(即阳性对照组)；3 =VEGF+小肽ZYl低浓度(lug/粒)组；4 =VEGF+小肽ZYl中浓度(5ug/粒)组； 5 =VEGF+小肽ZYl高浓度(IOug/粒)组；纵坐标为小鼠角膜病理性新生血管面积(mm2)。 ** 表示:P < 0. 01。图5显示了小肽ZYl对小鼠视网膜病理性新生血管的影响小肽ZYl明显具有抑制新生血管的效应。图中，横坐标分别为1 空白对照组PBS(即阴性对照组)；2 小肽ZYl 低浓度(500ng/ul)组；3 小肽ZYl中浓度(lug/ul)组；4 小肽ZYl高浓度(2ug/ul)组； 纵坐标为小鼠视网膜病理性新生血管内皮细胞核数；**表示P < 0. 01。图6显示小肽ZYl对原代人脐静脉血管内皮细胞HUVECs增殖的影响小肽ZYl明显具有抑制内皮细胞增殖的效应。图中，横坐标分别为1 无血清培养基组(即阴性对照组)；2 VEGF组(即阳性对照组)；3 VEGF+小肽ZYl (lug/ul)组；4 VEGF+小肽ZYl (1 Oug/ ul)组；5 =VEGF+ 小肽 ZYl (25ug/ul)组；6 =VEGF+ 小肽 ZYl (50ug/ul)组；纵坐标为原代人脐静脉血管内皮细胞的0D490值；**表示P < 0. 01。图7显示小肽ZYl对原代人脐静脉血管内皮细胞HUVECs迁移的影响小肽ZYl明显具有抑制内皮细胞迁移的效应。图中，横坐标分别为1 无血清培养基组(即阴性对照组)；2 VEGF组(即阳性对照组)；3 VEGF+小肽ZYl (lug/ul)组；4 VEGF+小肽ZYl (1 Oug/ ul)组；5 =VEGF+ 小肽 ZYl (25ug/ul)组；6 =VEGF+ 小肽 ZYl (50ug/ul)组；纵坐标为人脐静脉血管内皮细胞平均迁移率；**表示P < 0.01。图8显示小肽ZYl对原代人脐静脉血管内皮细胞HUVECs趋化的影响小肽ZYl 明显具有抑制内皮细胞趋化的效应。图中，横坐标分别为1 无血清培养基组(即阴性对照组)；2 =VEGF组(即阳性对照组)；3 =VEGF+小肽ZYl (10ug/ul)组；4 =VEGF+小肽 ZYl (25ug/ul)组；5 :VEGF+小肽ZYl (50ug/ul)组；纵坐标为=Transwell小室膜下表面内皮细胞核数；#表示P <0.01。图9显示小肽ZYl对原代人脐静脉血管内皮细胞HUVECs管腔形成的影响小肽 ZYl明显具有抑制内皮细胞管腔形成的效应。图中，横坐标分别为1 无血清培养基组(即 阴性对照组)；2 VEGF组(即阳性对照组)；3 VEGF+小肽ZYl (lug/ul)组；4 VEGF+小肽 ZYl (10ug/ul)组；5 =VEGF+ 小肽 ZYl (25ug/ul)组；6 =VEGF+ 小肽 ZYl (50ug/ul)组；纵坐标为人脐静脉血管内皮细胞形成的管腔数；**表示P < 0. 01。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一类源自胎盘生长因子的、具有抑制血管新生功能的，分子量小于5kD(如仅约3k D)的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固相法将其合成后，再经鸡胚尿囊膜血管模型、VEGF诱导的细胞株增殖模型和缺氧诱导小鼠视网膜新生血管模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生功能的小分子多肽。本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。活性多肽在本发明中，术语“本发明多肽”、“ZY多肽”、“ZY小肽”、“短肽ZY”，或“肽ZY”可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽ZY氨基酸序列(SEQ ID NO 1-4)的蛋白或多肽。 此外，所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQ ID NO :1-4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地 1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个 (通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/ 或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。本发明还包括ZY多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii) ZY多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或 6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3 个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。一类特别优选的衍生多肽的序列如 SEQ ID NO 3 所示。表 I
权利要求
1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xa alO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8] (I) 式中，XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段；Xaal是选自下组的氨基酸Val或Leu ；Xaa2是选自下组的氨基酸Ser或Thr ；Xaa3是选自下组的氨基酸:Leu, lie，Val，或Ala ；Xaa4是选自下组的氨基酸:Leu, lie，Val，或Ala ；Xaa5是选自下组的氨基酸Arg或Lys ；Xaa6是选自下组的氨基酸Cys或kr ；Xaa7是选自下组的氨基酸Thr或kr ；XaaS是选自下组的氨基酸Gly或Ala ；Xaa9是选自下组的氨基酸Cys或kr ；XaalO是选自下组的氨基酸Cys或kr ；Xaall是选自下组的氨基酸Gly或Ala ；Xaal2是选自下组的氨基酸Asp或Glu ；Xaal3是选自下组的氨基酸Glu或Asp ；Xaal4是选自下组的氨基酸Asn或Gln ；Xaa 15是选自下组的氨基酸Leu，lie, Val，或Ala ；Xaa 16是选自下组的氨基酸His或Arg ；Xaal7是选自下组的氨基酸Cys或kr ；XaalS是选自下组的氨基酸无，或1-3个氨基酸构成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的长度为17-23个氨基酸。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaalS是3个氨基酸构成的肽段。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO为Cys。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组(a)具有SEQID N0:l、2、3或4所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQID NO :1、2、3或4所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有(a)权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、 眼用凝胶或眼药膏。
8.如权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关疾病的选自下组新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger' s病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病。
10. 一种抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
全文摘要
本发明涉及预防和治疗血管新生的多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。
文档编号A61P13/12GK102336811SQ201010235580
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者许迅, 赵卉, 郑颖 申请人:上海市第一人民医院