专利名称：Peg-pcl-peg的新用途及装载抗原的混合物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制品领域，涉及PEG-PCL-PEG共聚物作为免疫佐剂以制备蛋白多 肽疫苗的用途。
背景技术：
免疫佐剂(immunoadjuvant)又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗 原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性(见抗原)或改变免疫反应类型。种类很多， 目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐 剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌 提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿 苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗 氏佐剂目前在实验动物中最常用，又可分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种。免疫佐剂的 生物作用包括(1)抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质 缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；(2)佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗 原易于被巨噬细胞吞噬；(3)佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；(4)佐剂可促进淋巴细胞 之间的接触，增强辅助T细胞的作用；(5)可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体， 故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；(6)可提高机体初次和再次免 疫应答的抗体滴变；(7)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。近年来，脂质体在免疫佐剂领域中开始得到应用。作为免疫佐剂，脂质体有着安全 性好；毒副作用小；提高抗原稳定性，延长疫苗使用期；能降低被包裹抗原的毒性，增强受 体耐受高剂量病原微生物或其毒素攻击的能力等优点。但是不同的疫苗是否都能使用脂质 体作为免疫佐剂目前没有定论，不同疫苗所需要的脂质体免疫佐剂的配方还需要反复地寻 找和筛选；并且脂质体作为佐剂成本高、包封率低、制备复杂、批间差异大，在实际应用中有 较大的困难。本领域目前需要开发新的、优秀的免疫佐剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为免疫佐剂的使用提供新的选择。本发明解决技术 问题的技术方案是提供PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作为免疫佐剂的新用途。其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为1500 10000，其中PEG链 段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0. 4 2. 6。其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG共聚物分子量为2000 8000，其中PEG链段的 分子量与PCL链段的分子量的比值为0. 5 2。其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG 共聚物为 E55(1-C22(1Q-E55(1、E75Q-C3_-E75。、 E750-C2500-E750、E750-C750-E750 或 E2_-C4000-E2000 ；其中 E 表示 PEG，C 表示 PCL，下标分别表示相 应链段的分子量。本发明所解决的第二个技术问题是提供了一种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作为免疫佐剂装载目标抗原制成的复合物。其中，上述复合物中的PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为1500 10000，其中PEG 链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0. 4 2. 6。其中，上述复合物中的PEG-PCL-PEG共聚物分子量为2000 8000，其中PEG链段 的分子量与PCL链段的分子量的比值为0. 5 2. 25。优选的，上述PEG-PCL-PEG共聚物中 PCL的相对分子质量与PEG的相对分子质量的比值优选为1.75 2. 25。更优选的，上述嵌 段共聚物中PCL的相对分子质量与PEG的相对分子质量的比值为2。其中，上述复合物中的PEG-PCL-PEG 共聚物为 E55。-C22。。-E55。、E75。-C3_-E75。、 E750-C2500-E750、E750-C750-E750 或 E2_-C4000-E2000 ；其中 E 表示 PEG，C 表示 PCL，下标分别表示相 应链段的分子量。其中，上述复合物为水凝胶，其中的PEG-PCL-PEG共聚物浓度为15wt% 40wt%; 较优为20wt% 30wt% ；更优选浓度为25wt%。其中，上述复合物中的目标抗原为肿瘤生长因子类多肽。其中，上述复合物中的目标抗原为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或其具备抗 原性的短肽(tbFGF)。bFGF短肽为缺失部分氨基酸残基但是仍具有同样活性的bFGF短肽 (tbFGF)。进一步的，上述复合物还含有多糖成分。其中，上述复合物中的多糖为甘露聚糖。其中，上述复合物中的bFGF蛋白或短肽 与多糖的重量比例为1 0.2 5，优选比例为1 2。其中，上述复合物中PEG-PCL-PEG的用量则根据实际使用的抗原剂量和注射时的 复合物或者疫苗体积确定，以使液态复合物或液态疫苗中的PEG-PCL-PEG浓度为15wt% 40wt%为宜，较优为15wt% 35wt%，最优为25wt%。根据本发明，在实际使用中，本发明复合物(疫苗)可将目标抗原(如bFGF或短 肽).PEG-PCL-PEG共聚物、多糖溶解于水或生理盐水中后，再冷冻干燥成粉末形成。将此复 合物装载于瓶中进行保藏，运输和销售。在使用前使用时再将水或生理盐水注射入瓶中，配制成均勻溶液，然后进行皮下 注射。皮下注射后一段时间内形成凝胶，凝胶缓慢降解，释放其装载的抗原成分。同时，本发明复合物(或疫苗)可含有两分离的组分，A组分是PEG-PCL-PEG共 聚物、多糖等溶解于水或生理盐水中后，再冷冻干燥所得到的粉末；B组分是目标抗原(如 bFGF的冻干粉末)。A组分可装于A瓶中；B组分可装于B瓶中。使用时，可将水或生理盐水分别注射入A瓶和/或B瓶中，形成均勻溶液，水或 生理盐水的加入量为以使PEG-PCL-PEG浓度为15wt% 40wt%为宜，较优为15wt% 35wt%，最优为25wt%。再将B瓶和A瓶的均勻混合形成混合溶液，然后将该混合溶液进 行皮下注射。皮下注射后一段时间将形成凝胶，凝胶缓慢降解，释放其装载的抗原及多糖成 分。当然，PEG-PCL-PEG共聚物与抗原成分的相对用量主要是满足能够在形成凝胶后 有较好的包封率，而这是可以在一个较大的范围内波动的。如使用lOOul复合物溶液进行 疫苗注射，则其中可有15 35mg PEG-PCL-PEG共聚物，优选25mg ；抗原成分(bFGF或其缺 失部分氨基酸残基但是仍具备与受体结合活性的bFGF短肽)15 25 y g，优选20 u g。如果添加多糖成分，则其与抗原成分的重量比为1 0.2-5，优选比例为1 2。上述技术方 案中使用的其缺失部分氨基酸残基但是仍具备与其活性的bFGF短肽可为N’-KRLYCKNGGFF LRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVV SIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTY-C，。本发明所解决的第三个技术问题是提供了由上述的复合物添加药学上所接受的 辅助性成分制备而成疫苗。本发明还提供了制备上述的复合物的方法，其方法在于包括以下步骤将PECE共 聚物溶解于水或生理盐水中，冷却至4°C形成溶液；将所需量的抗原(如碱性成纤维细胞生 长因子)和多糖(如甘露聚糖)加入至PECE溶液中形成均勻溶液。当上述复合物中含有多糖时，制备方法为将PECE共聚物溶解于水或生理盐水 中，冷却至4°C形成溶液；将所需量的抗原(如碱性成纤维细胞生长因子)加入至PECE溶 液中形成均勻溶液。本发明上述复合物及其制备方法中使用的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可以 是其全长蛋白，也可以是其缺失部分氨基酸残基但是仍具备与碱性成纤维细胞生长因子同 样的受体结合活性的bFGF短肽(tbFGF)。根据本发明的再一个方面，本发明装载有bFGF的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物复合 物或装载有bFGF和多糖的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物复合物可以作为肿瘤的抗血管生成 治疗性疫苗和治疗血管生成相关疾病的疫苗，也可再添加药学上可以接受的辅助性成分制 备成上述疫苗。本发明的有益效果为本发明利用PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物溶液作为免疫佐剂 装载目标抗原形成复合物，同时复合物中还可以加入多糖成分。本发明复合物具有安全性 好、包封率接近100%、批间差异小、成本低、制备简单、使用方便，能在体内形成凝胶缓慢释 放等优点。并且实验证明使用PECE佐剂可以达到作为免疫佐剂研发标准的弗氏佐剂的水 平，具有很好的免疫效果，为免疫佐剂的使用提供了新的选择。
图1、装载有 bFGF (200 u g/ml)的 PECE 水凝胶(25wt % )的 SEM 照片。图2、bFGF从bFGF-PECE水凝胶中释放出来的释放曲线。A :bFGF载药量对其释放 行为的影响；B :SDS-PAGE实验表明bFGF从BFGF-PECE水凝胶中释放出来后其结构完整，泳 道1 标记物；泳道2 标准的bFGF ；泳道3 24小时；泳道4 72小时；泳道5 168小时；泳 道6 336小时。图3、皮下免疫NS (生理盐水)、空白PECE水凝胶、纯的bFGF、载有bFGF的PECE水 凝胶复合物的各组在免疫后第四周的抗体滴度比较。老鼠是在第0周免疫一次，并在第四 周收集血清。生理盐水组的IgG滴度被设为1。图4、由单独bFGF以及载有bFGF的PECE水凝胶复合物所产生的IgG抗体滴度随 着时间的变化曲线。图5、免疫tbFGF各组小鼠肺重比较。图6、免疫tbFGF各组小鼠肺转移灶的比较。图7、本发明PEG-PCL-PEG共聚物的合成反应示意图，其中的X、Y均为正整数。
具体实施例方式以下结合附图通过对具体实施方式
的描述以详细说明但不限制本发明。实施例一 PEG-PCL-PEG共聚物的合成和验证1) PEG-PCL-PEG 共聚物的合成本发明PEG-PCL-PEG共聚物的合成反应路线如图7所示，其中的X、Y均为正整数。 根据该合成路线，在装有搅拌器的三口烧瓶中加入一定量的聚乙二醇单甲醚(MPEG)和￡ -己 内酯(￡ -CL)，以辛酸亚锡为催化剂，在130°C、氮气保护的条件下反应6小时，降温至80°C， 加入交联剂异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)再继续反应6小时后得到产物，冷却至室温提纯，烘 干。此外，适合的二异氰酸酯还包括甲苯二异氰酸酯、六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)、L-lysine ethyl ester diisocyanateOJH，赖氨酸乙酯二异氰酸酯)、二苯基甲烷_4，4，- 二异氰酸酯 等。在进行上述反应时可以用上述二异氰酸酯替代IPDI进行偶联反应。根据上述方法，合成了 E550—C2200_E550、E750_C3000_E75o、E750—C2500—E750、E750—C750—E750、E20oO_C4000_E2000 等系歹ll 共
物(见表1)。表1合成的PEG-PCL-PEG共聚物 a根据投料比计算出来的理论值b根据核磁共振氢谱测试结果计算出来的数值；2、PEG-PCL-PEG 共聚物的验证(1)、本发明PEG-PCL-PEG共聚物的表征方法用傅里叶红外光谱仪(FTIR) (200SXV，Nicolet)，采用KBr压片法对合成的共聚物 进行红外光谱分析。t-NMR用核磁共振仪(Varian 400,Varian)测量，在400MHZ下，溶剂为 ⑶Cl3，以四甲基硅烷为内标。各种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的分子量和PEG与PCL的嵌 段比例根据核磁共振氢谱检测来确定。根据上述试验结果可以得出结论本实施例已经成
？t) itfe^pTj^C 了 Sifef^^J E550—C2200_E550、￡750"C3000—E750、E750—C2500_E750、E75o—C750—E750、E2000_C4000_E20OO
的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物。实施例二以PEG-PCL-PEG共聚物(PECE)作为佐剂的疫苗的制备将PECE共聚物溶解于生理盐水中，然后冷却至4°C形成溶液。将所需量的bFGF 或tbFGF加入至PECE溶液中形成均勻溶液即得疫苗，其中PECE共聚物的浓度控制在 15wt% 40wt%为宜，较优为15wt% 35wt%，25wt%左右最佳。实际使用时将该溶液行皮下注射，稍后会在皮下成为凝胶。本实施例制备的疫苗是在100 u LPEG-PCL-PEG-bFGF复合物中，含有20 y g的bFGF 或tbFGF、25mg的PECE共聚物，溶剂为生理盐水，生理盐水的用量为使体系PECE浓度为 25%。其使用后形成的凝胶的微观结构见图1。本实例同时进行了在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中的释放实验。bFGF从 bFGF-PECE水凝胶复合物中释放出来的释放曲线见图2。其中A:bFGF载药量对其释放行为 的影响；B :SDS-PAGE实验表明bFGF从bFGF-PECE (E55(1-C22(1c1-E55(1)水凝胶中释放出来后其结 构完整，泳道1 标记物泳道2 标准的bFGF ；泳道3 24小时；泳道4 72小时；泳道5 168 小时；泳道6 336小时。结果表明其释放行为较好，释放出的bFGF结构完整。实施例三PEG-PCL-PEG抗原复合物动物免疫实验材料重组人bFGF购自R&D公司，纯度大于97 %。tbFGF为自行构建载体表达制 备的，纯度大于 99% (该多肽的序列为N，-KRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEE RGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTY-C，，具体序列及制备过程参见中国 专利申请200810304731. X，“成纤维生长因子受体介导的血管靶向脂质体载体及制备方法 和用途”)。甘露聚糖购自SIGMA公司，产品编号M7504。本实例的试验组中，使用的动物为6周大小的雌性BALB/c小鼠，每组6只，bFGF的 使用量均为20 u g。载有bFGF的PECE复合物组是在100 u L复合物中，含有20 y g的bFGF、 40 ug的甘露聚糖、25mg的PECE共聚物(E55(1-C22(1(1-E55C1)，溶剂为生理盐水，生理盐水的用量 为使体系PECE浓度为25%，其余各组的生理盐水用量参照确定。处理方法是在第0周进行单独bFGF组和载有bFGF的PECE复合物组免疫后，每隔 两周抽血用ELSA法检查其抗体滴度。皮下免疫NS (生理盐水)、空白PECE共聚物、单独的bFGF、载有bFGF的PECE复合 物的各组的抗体滴度比较值见图3。结果表明载有bFGF的PECE复合物组的抗体滴度远远 高于单独的bFGF。由单独bFGF以及载有bFGF的PECE水凝胶复合物所产生的IgG抗体滴度随着时 间的变化曲线见图4。结果表明载有bFGF的PECE复合物组各时间段的抗体滴度均远高于 单纯的bTOF组。实施例四PEG-PCL-PEG抗原复合物抗肿瘤作用研究以下的试验组中，使用的动物老鼠6周大小的雌性C57BL/6J小鼠，每组6只， tbFGF的使用量均为20 u g。载有tbFGF的PECE复合物组为在100 u L复合物中，含有20 y g 的tbFGF、40 u g的甘露聚糖、25mg的PECE共聚物(E55(1-C22(1(1-E55C1)，溶剂为生理盐水，生理盐 水的用量为使体系PECE浓度为25%，其余各组的生理盐水用量参照确定。处理方法是在第0、2、4周进行tbFGF复合有弗氏佐剂组(FA_tbFGF)和载有tbFGF 的PECE复合物组(Hy-tbFGF)免疫后，第5周尾静脉接种3X 105LL/2结肠癌细胞。第18天 后处死小鼠，称取肺重，计算肺结节数以说明其转移灶的情况。图5显示各组小鼠的肺重，FA-tbFGF组和Hy-tbFGF组的小鼠肺重明显低于生理 盐水组，差异具有显著性(P < 0. 01)。图6显示各组小鼠的肺结节数，同样，FA-tbFGF组和 Hy-tbFGF组的肺结节数远低于生理盐水组，具有显著性差异(P<0.01)。结果表明，使用 PECE佐剂的tbFGF可以达到使用弗氏佐剂(免疫佐剂金标准)的tbFGF的抗肿瘤水平。
权利要求
PEG PCL PEG三嵌段共聚物作为免疫佐剂的用途。
2.PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作为免疫佐剂装载目标抗原制成的复合物。
3.根据权利要求2所述的复合物，其特征在于所述PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为 1500 10000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0. 4 2. 6。
4.根据权利要求3所述的复合物，其特征在于所述PEG-PCL-PEG共聚物分子量为 2000 8000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0. 5 2。
5.根据权利要求3所述的复合物，其特征在于所述的PEG-PCL-PEG共聚物为 ^550—C22oo—E550^ E750_C3000_E750、E75O—C25OO—E75Q^ E750—C750—E750^ E20oo_C^qo"E20oo ；其中 E 表不 PEG，C 表示PCL，下标分别表示相应链段的分子量。
6.根据权利要求2 5任一项所述的复合物，其特征在于所述PEG-PCL-PEG三嵌段 共聚物的用量为使其在形成的凝胶中的比例为15wt% 40wt%。
7.根据权利要求2 6任一项所述的复合物，其特征在于所述目标抗原为肿瘤生长 因子类多肽。
8.根据权利要求7所述的复合物，其特征在于所述目标抗原为碱性成纤维细胞生长 因子或其具备抗原性的短肽。
9.根据权利要求2 8任一项所述的复合物，其特征在于还含有多糖成分。
10.根据权利要求9所述的复合物，其特征在于所述多糖为甘露聚糖。
11.权利要求9或10所述的复合物，其特征在于bFGF蛋白或短肽与多糖的重量比例为 1 0. 2-5。
12.根据权利要求9 11任一项所述的复合物，其特征在于是将目标抗原、 PEG-PCL-PEG共聚物、多糖溶解于水或生理盐水中后，再冷冻干燥形成的粉末。
13.疫苗，由权利要求2 12任一项所述的复合物添加药学上所接受的辅助性成分制 备而成。
14.制备权利要求2 8任一项所述的复合物的方法，其特征在于包括以下步骤将 PECE共聚物溶解于水或生理盐水中，冷却至4°C形成溶液；将所需量的bFGF或短肽加入至 PECE溶液中形成均勻溶液。
15.制备权利要求10 11任一项所述的复合物的方法，其特征在于包括以下步骤将 PECE共聚物溶解于水或生理盐水中，冷却至4°C形成溶液；将所需量的bFGF或短肽和多糖 加入至PECE溶液中形成均勻溶液。
16.权利要求12所述复合物的使用方法，步骤为将所需量水或生理盐水注射入复合物 粉末的包装中，配制成均勻溶液，装入注射器备用。
17.根据权利要求2 11任一项所述的复合物，其特征在于含有两分离的组分，A组 分是PEG-PCL-PEG共聚物或PEG-PCL-PEG共聚物与多糖溶解于水或生理盐水中后，再冷冻 干燥成的粉末，B组分是目标抗原，A组分可装于A包装中；B组分装于B包装中。全文摘要
本发明属于生物制剂领域，涉及PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作为免疫佐剂在制备蛋白多肽疫苗中的应用。上述PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为1500～10000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.4～2.6。上述目标抗原为肿瘤生长因子类多肽，且上述复合物还可含有多糖成分。本发明复合物具有安全性好、包封率接近100％、批间差异小、成本低、制备简单、使用方便等优点，具有好的应用前景。
文档编号A61K39/39GK101890162SQ20101024162
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月30日 优先权日2009年7月31日
发明者杨莉, 赵霞, 钱志勇, 魏于全 申请人:四川大学