专利名称：一种重组融合蛋白pacap-ptd及其表达方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组融合蛋白PACAP-PTD及其表达方法 和应用。
背景技术：
Il 体腺 Ρ 酸环化 Bl激 舌多月太(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)是1989年发现的，由脑垂体分泌的或目的组织自分泌和旁分泌的具 有重要生物学功能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP的 具有3个受体PAC1是PACAP的特异受体；VPACl和VPAC2是PACAP和血管活性肠肽(VIP) 的共同受体；PACAP对3个受体具有相同的激动功能。PACAP及其受体在体内分布广泛， 主要分布于中枢神经系统、周围神经系统以及睾丸、卵巢、呼吸道、肺、胰腺等非神经组织内 等。目前已证实由PACAP介导的生物学功能有神经递质/调质、保护神经细胞；神经损伤 修复；调节血管功能；促进激素分泌，调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生； 参与消化活动，调节能量代谢平衡；参与调节免疫系统；调节细胞增殖分化；与摄食睡眠有 关；与学习和记忆有关；与某些心理感受有关；与动物的生物钟有关；等等。已有研究表明 PACAP通过激活其特异受体，有效促进神经干细胞的增殖和分化。因此，PACAP具有预防、治 疗神经损伤，神经修复、神经失调等神经相关疾病的潜能。PACAP为38个氨基酸组成，不具备主动穿越各种生物屏障，如血脑屏障、血睾屏 障、血管内皮屏障、气血屏障、胎盘屏障、角膜、眼部内部各层细胞等的功能，只能通过扩散 传播。PTD(Protein transduction domain)是最初发现于HIV病毒TAT蛋白中的具有 穿膜功能的核心区；由11个氨基酸YGRKKRRQRRR组成，含有8个碱性氨基酸，生理条件下带 较高的正电荷，并形成稳定的a螺旋结构。PTD具有强大的运载潜能，能将外源性蛋白质、 DNA、RNA、化学药物等转运至细胞内，甚至可以穿越血脑屏障。此过程不受化合物/复合物 分子类型和大小的限制，并且对宿主细胞没有显著毒副作用。目前尚未有人利用PTD的运载功能将PACAP多肽运送进入靶位点，从而实现相关 疾病的治愈，也未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术存在的不足，提供一种既可通过血脑屏障和穿细 胞膜运输的，又具备PACAP生物活性的重组融合蛋白PACAP-PTD。本发明另一目的在于提供一种编码上述重组融合蛋白PACAP-PTD的核苷酸序列。本发明另一目的在于提供一种含有上述编码上述重组融合蛋白PACAP-PTD的核 苷酸序列的重组质粒。本发明另一目的在于提供一种含有上述重组质粒的表达工程菌。本发明另一目的在于提供上述重组融合蛋白PACAP-PTD的表达方法。
本发明还有一个目的在于提供上述重组融合蛋白PACAP-PTD的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种重组融合蛋白PACAP-PTD，由55个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQID NO 1 所示。编码该蛋白的重组融合蛋白PACAP-PTD的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。一种重组质粒，该重组质粒中含有权利要求2所述的重组融合蛋白PACAP-PTD的基因。一种表达工程菌，该工程菌是将权利要求3所述重组质粒转化大肠杆菌宿主菌构 建而得。本发明重组融合蛋白PACAP-PTD是采用常规的基因重组方法制备而得，包括如下 步骤(1)采用引物进行PCR扩增，得到核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示的基因，所述引 物序列如SEQ ID NO :4 6所示；(2)将所得基因经双酶切、克隆构建得到重组质粒；(3)将重组质粒转化大肠杆菌宿主菌，构建表达工程菌；(4)用诱导剂诱导表达工程菌表达重组目的蛋白；(5)重组目的蛋白经纯化、硫醇切割和水解，得到重组蛋白PACAP-PTD。作为一种优选方案，本发明表达方法步骤O)中所述双酶切为NdeI和B10I双酶 切。作为一种优选方案，本发明表达方法步骤中所述诱导剂为异丙基-D硫代 半乳糖苷。作为一种优选方案，本发明表达方法步骤(5)中所述纯化是用几丁质柱纯化；所 述硫醇切割是硫醇诱导蛋白内含肽的N端切割；所述水解时多肽C端硫酯水解。作为一种最优选方案，本发明表达方法的步骤如下(1)扩增 PACAP-PTD 基因本发明设计合成3条引物，采用两步PCR方法扩增PACAP-PTD基因引物1，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；引物3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。上述三条引物中，N代表保护碱基，CATATG为NdeI酶切位点，CTCGAG为BioI酶切 位点。两步PCR 首先以现有的PACAP基因为模板，引物1和2进行第一轮PCR ；然后以 第一轮PCR产物为模板，以引物1和3为引物，进行第二轮PCR，获得PACAP-PTD基因，所述 PACAP-PTD基因其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。(2)构建重组质粒用NdeI和BioI进行酶切，将PACAP-PTD基因克隆到质粒中构建重组质粒；(3)构建表达工程菌将上述所得重组质粒转化表达大肠杆菌宿主菌，构建表达工程菌；大肠杆菌宿主 菌选用 E. coli. ER2566。(4)用诱导剂异丙基-D硫代半乳糖苷诱导表达重组目的蛋白；
(5)表达的目的蛋白经几丁质柱纯化，硫醇诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的 多肽C端硫酯，多肽C端硫酯水解得到重组融合蛋白PACAP-PTD。本发明首次利用基因工程原理和技术实现重组的PACAP和PTD融合的新型融合 蛋白PACAP-PTD的制备及生物学功能的研究。PACAP-PTD既有PACAP的活性，又能跨细胞 屏障运输，穿过血脑屏障，血睾屏障，角膜，眼内部各层细胞；使其用药途径获得优化，应用 范围得以扩展。如原PACAP、VIP等多肽必须通过脑腔注射，才能进入脑部；PACAP-PTD可腹 腔注射或静脉注射即可进入脑部作用；PACAP-PTD还可通过角膜进入眼内部房水，作用于 眼底神经。而且穿越细胞屏障的功能可使PACAP-PTD可通过透皮或透粘膜吸收，从而提高 PACAP-PTD的应用效率和应用范围。本发明的重组融合蛋白PACAP-PTD可用于诊断、治疗与PACAP或其受体相关的疾 病，如能量代谢失调、糖尿病(包括I型、II型)、肥胖、肥胖相关疾病、代谢障碍、代谢相关 综合症、脑损伤、脑缺血、防止神经细胞死亡、受损神经细胞保护及再生、抗炎、男性阳痿、性 冷淡、不孕不育、女性性功能障碍，神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、精神病，记忆损伤、痴 呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏缩、心肌缺血、心肌梗死/纤维化、动脉硬 化、肌畏缩症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜病变、神经萎缩、神经保护，神经 损伤修复、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抗肿瘤、及 任何与PACAP/VIP有关的疾病，等等。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的重组融合蛋白PACAP-PTD既具有PACAP的生物学活性，又因含有PTD， 而具备跨生物屏障运输的功能；2.细胞水平研究发现本发明的重组融合蛋白PACAP-PTD具有促进PACl-CHO细胞 增殖的功能，说明PACAP-PTD具有PACAP的活性；3.动物实验结果发现，PACAP-PTD不仅能有效穿越血脑屏障，而且可以穿过角膜 组织进入房水。PACAP的药用功能已被众多的研究所确定，而PACAP-PTD赋予的穿越生物 屏障运输的功能将使其较易穿过血脑屏障、角膜、气血屏障、血睾屏障和内皮屏障等生物屏 障，极大地提高其在脑部，眼部、肺部和生殖器官等部位的应用价值。4.本发明的重组融合蛋白PACAP-PTD在透皮吸收、粘膜吸收、穿角膜施药等方面 都提供了研究基础，而且鉴于该重组融合蛋白PACAP-PTD既有PACAP的活性，又能跨生物屏 障运输，可改善其用药途径及扩大其应用范围。
图1为重组融合蛋白PACAP-PTD结构示意图；图2为重组融合蛋白PACAP-PTD纯化的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白marker，1为菌体IPTG诱导前，2为菌体IPTG诱导后，3为菌体IPTG 诱导后破碎沉淀，4为菌体IPTG诱导后破碎上清，5为上清过几丁质柱流出液，6为洗柱流出 液，7/8/9为硫醇切割后洗脱液(含目的蛋白)；10为硫醇切割后柱填料上结合蛋白；图3为PACAP-PTD飞行质谱结果质谱图；图4为PACAP-PTD促进PAC1-CH0增殖活性测定；
图5为PACAP-PTD穿越小鼠脑屏障的效率测定；
图6为PACAP-PTD穿越小鼠角膜的效率测定；图7为PACAP-PTD穿越兔角膜的效率测定。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。实施例1重组融合蛋白PACAP-PTD的制备本实施例重组融合蛋白PACAP-PTD的制备，包括如下步骤1. PACAP-PTD基因的扩增及克隆首先设计并合成3条引物引物1，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；引物3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。上沭三条弓I物中，N代表保护碱基,CATATG为NdeI酶切位点，CTCGAG为BioI酶切 位点。两步PCR (1)第一步PCR，以现有的PACAP基因为模板，PCR反应体系为引物2(0. OlA/ μ L) 1 μ L、弓丨物 3(0. 01Α/μ 1) 1 μ L、含 PACAP 基因的质粒 1 μ L、dNTP 10 μ L、10 X TaKaRa Ex Buffer 10 μ L、TaKaRa Ex Taq 酶 1 μ L 和 H2O 76 μ L ；PCR 反应条件为94°C，4min ；94°C， 45sec、55°C，45sec、72°C，60sec，35 个循环；72°C，IOmin ；(2)第二步PCR，以第一步PCR反应产物为模板，PCR反应体系为引物1 (0. OlA/ μ L) 1 μ L、弓丨物 3(0. OlA/μ 1) 1 μ L、第一步 PCR 反应液 1 μ L、dNTPIO μ L、10 X TaKaRa Ex Buffer 10 μ L、TaKaRa Ex Taq 酶 1 μ L 和 H2O 76 μ L ；PCR 反应条件为94°C，4min ；94°C， 45sec、58°C，45sec、72°C，60sec，35 个循环；72°C，lOmin。上述两步PCR所涉及到的试剂均为市售或者采用试剂盒配带的均可。2.重组质粒的构建用NdeI和XholJf PACAP-PTDX基因克隆到质粒pKTO (市售)的NdeI和XhoI位 点间，构建重组质粒pKY-PACAP-PTD ；3.表达工程菌的构建重组质粒pKY-PACAP-PTD转化表达宿主菌E. coli Strain ER2566 (市售)，构建表 达工程菌 pKY-PACAP-PTD-ER ；4.诱导剂IPTG诱导由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域(Chitin binding domain, CBD)组成的“三元”融合蛋白的表达挑取单克隆于5mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基，摇菌培养过夜，以 1 20 (体积比)接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37°C摇菌至OD6tltl为0. 5-0. 8， 加入诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度lmm0l/L，3(TC诱导融合蛋白表达 4h，离心收集菌体，重悬于 60mL 的溶液 M20mMTris. HCl,500mM NaCl，ImM EDTA，pH8. 0)，然 后超声破碎，20，OOOg离心30min，收集上清，作为后续纯化的上样样品。5.融合蛋白的纯化
取IOmL 几丁质珠装填 2. 5 X IOcm 层析柱，溶液 M20mM Tris-HCl，0. 5MNaCl，ImM EDTA，pH 8. 0)洗柱；取上述上样样品以0. 5mL/min的流速上样；溶液A以2mL/min洗去杂 蛋白，3011^溶液^201111 Tris-HCl, 0. 5M NaCl，ImM EDTA，50mMβ -巯基乙醇，pH 8.0)快速 过柱，使巯基乙醇均勻分布并浸泡柱内填料，16°C诱导蛋白肽切割16h;溶液A洗脱目 的多肽，分管收集，每2mL为一管，目的多肽大多存在于前10管中。SDS-PAGE鉴定目的多肽，电泳结果如图2所示，从图中可以看出融合蛋白部分以 可溶状态存在于破碎上清，并能有效与几丁质柱结合(过柱后目的带消失)，经硫醇切割 后，融合蛋白能有效释放目的多肽PACAP-PTD，其电泳位置与预期相吻合；而柱填料上能够 检测出原融合蛋白和切割后融合蛋白两种蛋白。4°C透析过夜除去β-巯基乙醇。重组多肽PACAP-PTD送北京军事医学科学院进行飞行质谱检测，分子量为 6681.81(图3)，与理论值相符。本实施例所用LB培养基采用本领域技术人员配制LB培养基所采用的常规配方。实施例2重组融合蛋白PACAP-PTD促进PACl-CHO细胞增殖采用特异表达PACAP受体PACl的PACl-CHO细胞，铺板于96孔板，待细胞密度达 到80%左右，改用无血清培养(饥饿培养)过夜，加入梯度浓度的PACAP-PTD (lnM，IOnM, ΙΟΟηΜ，IOOOnM)孵育，M小时后用MTT测定细胞活性。结果如图4所示，PACAP-PTD具有显著(P < 0. 01)促进PAC1-CH0增殖的活性，说 明PACAP-PTD能有效激活体内的PACl受体。实施例3重组融合蛋白PTD-PACAP穿血脑屏障膜的功能检测利用FITC (异硫氰酸荧光素)标记试剂盒，对PACAP-PTD，PACAP进行荧光标记，测 定标记蛋白浓度及标记蛋白荧光值，计算多肽标记效率(即每mol多肽所携带FITC的值)。KM小鼠按体重随机分两组，分别腹腔注射PACAP_FITC 0. lnmol/kg ；和 PACAP-PTD-FITC 0. lnmol/kg ；注射后他，颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠的脑组织，用PBS漂洗 数次。以150mg湿重脑组织/lml PBS的比例分装至EP管中，超声破碎妨s，4°C下16000g 离心30min，取上清200ul加入96孔板中，用荧光分光光度计，激发光495nm，检测各个样品 在520nm的发射强度。多肽穿越血脑屏障效率(％ )=(样品荧光值-空白对照荧光值)/ (标记效率WX蛋白上样量)。设PACAP-FITC的穿血脑屏障的效率为1，PACAP_PTD_FITC组的穿血脑屏障的效率 与PACAP-FITC组的比值为纵坐标作图，结果如图5所示PACAP-PTD-FITC组穿血脑屏障的 效率是PACAP-FITC组的5.沈士0. 17倍，这说明PACAP-PTD较PACAP有效穿越血脑屏障，进 入脑组织。实施例4重组融合蛋白PACAP-PTD穿小鼠眼角膜屏障的功能检测利用FITC (异硫氰酸荧光素)标记试剂盒，对PACAP-PTD，PACAP进行荧光标记，测 定标记蛋白浓度及标记蛋白荧光值，计算多肽标记效率(即每mol多肽所携带FITC的值)。KM小鼠按体重随机分为三组，每组8只空白对照(PBS)、PACAP-FITC组、 PACAP-PTD-FITC组。小鼠实验时先用10%水合氯醛麻醉小鼠，在眼部滴50 μ L各组对应 的实验样品。暗处放置一小时后，颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠完整眼球，放入EP管中，加入 Iml的PBS，于超声破碎30s，重复两次。在冷冻离心机中15000g，离心30min，取上清200 μ L加入96孔板中，用荧光分光光度计，激发光495nm，检测各个样品在520nm的荧光值。计算 多肽穿越眼角膜效率(％)=(样品荧光值-空白对照荧光值)/(标记效率WX蛋白上样
量)O设PACAP-FITC的穿小鼠角膜的效率为1，PACAP_PTD_FITC组的穿小鼠角膜的效率 与PACAP-FITC组的比值为纵坐标作图，结果如图6所示PACAP-PTD-FITC组小鼠角膜的效 率是PACAP-FITC组的6. 67士0. 19倍，这说明PACAP-PTD较PACAP有效穿越小鼠角膜，进入 眼睛内部。实施例5重组融合蛋白PTD-PACAP穿兔眼角膜屏障的功能检测利用FITC (异硫氰酸荧光素)标记试剂盒，对PACAP-PTD，PACAP进行荧光标记。测 定标记蛋白浓度及标记蛋白荧光值，计算多肽标记效率(即每mol多肽所携带FITC的值)。新西兰大白兔按体重随机分为三组，每组5只空白对照(PBS)、PACAP-FITC组、 PACAP-PTD-FITC组。兔子实验时在眼部滴入100 μ L对应的实验样品，使样品充分浸润整 个眼球。暗处放置一小时后，用注射器穿刺眼部，吸取房水，装入EP管中，在冷冻离心机中 15000g，离心5min，取上清200 μ L加入96孔板中，用荧光分光光度计，激发光495nm，检测 各个样品在520nm的荧光值。多肽穿越眼角膜效率(％ )=(样品荧光值-空白对照荧光值)/(标记效率WX 蛋白上样量)。设PACAP-FITC的穿兔角膜的效率为1，PACAP_PTD_FITC组的穿兔角膜的效率与 PACAP-FITC组的比值为纵坐标作图，结果如图7所示PACAP-PTD-FITC组兔角膜的效率是 PACAP-FITC组的6. 17士0. 23倍，这说明PACAP-PTD较PACAP有效穿越兔角膜，进入房水。
权利要求
1.一种重组融合蛋白PACAP-PTD，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2.编码权利要求1所述重组融合蛋白PACAP-PTD的基因，其特征在于所述基因的核苷 酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3.—种重组质粒，其特征在于所述重组质粒中含有权利要求2所述的重组融合蛋白 PACAP-PTD 的基因。
4.一种表达工程菌，其特征在于所述工程菌是将权利要求3所述重组质粒转化大肠杆 菌宿主菌构建而得。
5.权利要求1所述重组融合蛋白PACAP-PTD的表达方法，其特征在于所述方法包括如 下步骤(1)采用引物进行PCR扩增，得到核苷酸序列如SEQID NO :2所示的基因，所述引物序 列如SEQ ID NO :4 6所示；(2)将所得基因经双酶切、克隆构建得到重组质粒；(3)将重组质粒转化大肠杆菌宿主菌，构建表达工程菌；(4)用诱导剂诱导表达工程菌表达重组目的蛋白；(5)重组目的蛋白经纯化、硫醇切割和水解，得到重组蛋白PACAP-PTD。
6.根据权利要求5所述重组融合蛋白PACAP-PTD的表达方法，其特征在于步骤O)中 所述双酶切为NdeI和BioI双酶切。
7.根据权利要求5所述重组融合蛋白PACAP-PTD的表达方法，其特征在于步骤(4)中 所述诱导剂为异丙基- β -D硫代半乳糖苷。
8.根据权利要求5所述重组融合蛋白PACAP-PTD的表达方法，其特征在于步骤(5)中 所述纯化是用几丁质柱纯化；所述硫醇切割是硫醇诱导蛋白内含肽的N端切割；所述水解 时多肽C端硫酯水解。
9.权利要求1所述重组融合蛋白PACAP-PTD在制备诊断、治疗与PACAP或其受体相关 疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述重组融合蛋白PACAP-PTD的应用，其特征在于所述与PACAP 或其受体相关疾病为能量代谢失调、糖尿病I型、糖尿病II型、肥胖、肥胖相关疾病、代谢障 碍、代谢相关综合症、脑损伤、脑缺血、防止神经细胞死亡、受损神经细胞保护及再生、抗炎、 男性阳痿、性冷淡、不孕不育、女性性功能障碍，神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、精神病， 记忆损伤、痴呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏缩、心肌缺血、心肌梗死/纤 维化、动脉硬化、肌畏缩症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜病变、神经萎缩、神 经保护，神经损伤修复、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增 殖、抗肿瘤或其它与PACAP/VIP有关的疾病。
全文摘要
本发明公开了一种重组融合蛋白PACAP-PTD及其表达方法和应用。本发明重组融合蛋白PACAP-PTD的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明重组融合蛋白PACAP-PTD既具有PACAP的生物学活性，又将PTD的跨细胞屏障运输的功能赋予PACAP，使其具备穿越细胞屏障运输的功能，能有效穿越血脑屏障、角膜、气血屏障、血睾屏障和内皮与粘膜组织等，极大地提高了PACAP-PTD在脑部、眼部、肺部、生殖器等部位的相关疾病中的应用价值，可以改善其用药途径，扩大其应用范围。
文档编号A61P27/02GK102079790SQ201010248229
公开日2011年6月1日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者丁勇, 余榕捷, 李娟 , 汤翠翠, 赵秀丽, 陈建苏, 黄霖 申请人:暨南大学