专利名称：鸭源性冠状病毒n蛋白基因及其克隆方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种鸭源性冠状病毒ZZ2004的N蛋白基因及 其克隆方法与应用。
背景技术：
1937年，冠状病毒(Coronaviruses)首先从鸡身上分离出来。1965年，分离出第 一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其 形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。根据病毒的血清学特点和 核苷酸序列的差异，目前冠状病毒科分为冠状病毒和环曲病毒两个属。冠状病毒科的代表 株为禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。该病毒为有囊 膜、呈中等多形性球状或椭圆形的病毒粒子，表面有杆状突起。禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的 一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该 病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感 染，如新城疫(Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如 大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界 的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。 1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100%，死亡率可达10 30%。国内外已报道的IBV有26种以上血清型，因血清型及新变型众多，不同血清型之间 缺乏交叉保护，新的变异株不断出现和流行，是造成鸡群免疫失败的原因。这使得IB对养 鸡业造成的威胁持续存在。而掌握流行毒株的生物学特性和流行特点是正确使用疫苗的前 提。2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB 疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率达 20%以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个 1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成 大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳头肿 大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”， 肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌 及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV 疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工 作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株，保 藏编号为CGMCC NO. 3842，其专利申请号为201010225577. 4，此为第一次有关家鸭感染IBV 的报道。IBV粒子含有3种特异性蛋白，即核衣壳蛋白(N)，膜蛋白(M)和纤突蛋白(S)。N 蛋白全长约409个氨基酸，分子量约51kDa，占病毒总蛋白量的40%，是IBV病毒内部核衣壳的组成蛋白，它与病毒RNA结合，为螺旋形的核衣壳提供基础。核蛋白在组内高度保守， 但近年的研究表明，在不同毒株间N基因存在变异，并且这些差异存在于推测的抗原表位 和功能相关区域，提示不同IBV毒株N基因之间的变异可能影响到病毒的某些生物特性发 生改变。N蛋白具有较好的免疫原性，在细胞免疫和体液免疫中起重要作用，在局部免疫方 面也具有重要作用，因此深入研究N蛋白基因的结构及其变异规律，对于揭示IBV的变异机 制，研制高效的IBV疫苗，为有效防控IB的发生将具有起到重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是对鸭源性冠状病毒ZZ2004的N蛋白基因进行了分析 测序，并给出了克隆该N蛋白基因的方法及其应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO. 3842)的N蛋白基因，该基 因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。一种鸭源性冠状病毒的(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO. 3842) N蛋白基因，该基 因的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO. 3842)的N蛋白基因的克 隆方法，包括以下步骤 1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5 ‘ -AGTCAGTAGACAGCGGAGAG-3 ‘为上游引 物，以 5 ‘ -TTCGTTTCCAGGCTACTAAG-3 ‘为下游引物；2)通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株N蛋白基因全长片段， PCR 的扩增条件 94°C，5min ;94°C lmin，53°C lmin，72°C Imin，共 35 个循环，最后于 72 °C 延 伸10min，4°C结束反应；3)然后将N蛋白基因片段分别与pMDIS-T载体连接。所述鸭源性冠状病毒的N蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位蛋白疫苗中的应 用，该N蛋白基因片段可被克隆到质粒载体或真核表达载体上进一步研制出IBV核酸疫苗 及活载体疫苗对预防IBV将具有重要意义。所述鸭源性冠状病毒的N蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管炎药物中的应用， 该N蛋白基因一旦被导入植物，并在植物中表达出活性蛋白，有望研制出转基因植物可食 疫苗，作为禽类饲料添加剂，家禽食用含有该种抗原的转基因植物，将激发肠道免疫系统， 从而产生对IBV的免疫能力。上述鸭源性冠状病毒(Avianinfectious bronchitis virus，IBV)ZZ2004，已 于2010年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为 CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该鸭源性冠状病 毒的保藏编号为CGMCC N0. 3842，其中国专利申请号为201010225577. 4。本发明具有积极有益的效果此前尚无有关家鸭感染IBV的报道，本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖 场，本病毒不仅可以引起鸡的大批发病及死亡，还可严重影响家鸭的生长发育，同时引起鸭 的感染和死亡。与其它禽类的冠状病毒相比，ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更 广；近年来的研究发现N基因是重要的免疫基因，在细胞免疫及体液免疫方面均具有重要作用，在局部免疫方面也具有重要作用，本发明对N基因的研究，对于揭示IBV变异规律，区 分不同的血清型，进而制备出新型高效的基因工程疫苗，为有效防制IBV将起到重要作用。
图1为鸭源性冠状病毒ZZ2004的N基因推导的氨基酸序列同源性比对图谱；图2为鸭源性冠状病毒ZZ2004分离株与参考毒株N蛋白系统进化树；图3为鸭源性冠状病毒ZZ2004的N基因RT-PCR扩增结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护内容并不局限于下述具 体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。实施例1 一种鸭源性冠状病毒ZZ2004的N基因的克隆方法，包括如下步骤(I)PCR引物设计设计一对特异性引物，序列如下上游引物5' -AGTCAGTAGACAGCGGAGAG-3‘；下游引物5' -TTCGTTTCCAGGCTACTAAG-3‘。(2) ZZ2004株的浓缩方法取ZZ2004株感染的尿囊液用灭菌PBS作1 10稀释，取0. 2ml接种于9日龄的 SPF鸡胚绒毛尿囊腔内，37°C孵化36 48h，置4°C 12h后收获鸡胚尿囊液。分别取50ml ZZ2004株感染的SPF鸡胚尿囊液于灭菌的离心管3管，5000rpm离 心20min ；分别弃沉淀，取上清于另一灭菌的离心管中，12000rpm离心20min ；分别弃沉淀， 取上清加入50ml的超速离心管，不足的以灭菌PBS补足，40000rpm离心4小时；弃上清，取 沉淀用Iml灭菌PBS悬浮后_20°C保存备用。(3) ZZ2004 株总 RNA 的提取用DNA/RNA 提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 3. 0)提 取RNA，参照试剂盒说明书进行。(4) ZZ2004株基因片段的RT-PCR扩增①反转录反应在0. 2ml Microtube管中配制下列混合液(表1)，同时设空白对照。表1模板RNA/弓丨物反应混合液
dNTP Mixture (IOmM each)1 μ L
random 6 mersIuL
上述提取的Template RNA8uL
Total Volume10 μ L在PCR仪上进行变性、退火反应65°C 5min，4°C保存。离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底。在上述Microtube管中配制下列反转录反应液(表2)。
表2反转录反应液
权利要求
一种鸭源性冠状病毒的N蛋白基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种鸭源性冠状病毒的N蛋白基因，其特征在于，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
3.一种鸭源性冠状病毒的N蛋白基因的克隆方法，包括如下步骤1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5‘ -AGTCAGTAGACAGCGGAGAG-3 ‘为上游引物，以 5 ‘ -TTCGTTTCCAGGCTACTAAG-3 ‘为下游引物；2)通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株N蛋白基因全长片段，PCR的扩 增条件 94°C，5min ;94°C lmin,53°C lmin，72°C lmin，共 35 个循环，最后于 72°C延伸 IOmin, 4°C结束反应；3)然后将N蛋白基因片段分别与pMDlS-Τ载体连接。
4.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的N蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位蛋白 疫苗中的应用。
5.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的N蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管炎药 物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种鸭源性冠状病毒ZZ2004的N蛋白基因及其克隆方法与应用。该N蛋白基因序列全长1230bp，编码409个氨基酸残基的N蛋白；通过随机PCR找到与其同源性较高的病毒序列，以该序列为模版设计1对特异性引物扩增出对应的片段，再将其分别与pMD18-T载体连接即克隆出该病毒N蛋白基因。鉴于N基因是重要的免疫基因，在细胞免疫及体液免疫方面均具有重要作用，在局部免疫方面也具有重要作用，本发明对N基因的研究，有助于揭示IBV变异规律，区分不同的血清型，进而研制备出新型高效的基因工程疫苗，为有效防制IBV将起到重要作用。
文档编号A61P11/00GK101948851SQ201010264748
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者刘兴友, 刘金华, 姚四新, 王三虎, 王丽荣, 王宪文, 王自良, 王青, 赵坤, 赵淑秋 申请人:河南科技学院