专利名称：一种具有免疫活性的浒苔多糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及是医药生物技术，更详细地讲是关于浒苔等天然海藻提炼的一种具有免疫活性的浒苔多糖及其制备方法。
背景技术：
众所周知，浒苔是一种大型绿藻，为近海滩涂中的天然野生绿藻，其自然繁殖能力特别强，产量巨大。我国海域特别是东海海域的绿藻主要以浒苔为主，其资源十分丰富，仅福建沿海每年天然产量(鲜重)达10万吨以上。近几年黄海海域的浒苔，大面积暴发，严重的影响了水体美观，污染海域环境。通常，浒苔作为垃圾丢弃，造成了环境污染，增加了处理成本，浪费了优质资源。因此，针对浒苔的研究开发是目前治理环境污染，优化资源利用的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能消除上述缺点，具有方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，集降低胆固醇与提高免疫力为一体等特点的一种具有免疫活性的浒苔多糖及其制备方法。尤其是采用提取、脱蛋白、纯化的制备方法，以及科学的试验手段，首创性的研究获得浒苔多糖及其提炼方法，开创了治理浒苔的新方法和途径。它有效地开发了浒苔的药用价值和用途，治理了环境污染，降低了清理成本，提高了社会和经济效益，是理想的浒苔治理和综合利用的专用制备技术。本发明的一种具有免疫活性的浒苔多糖是指多糖HT-II，其特征为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为96kDa，主要由葡萄糖和甘露糖组成，其组成比为鼠李糖木糖甘露糖葡萄糖=36 20 6 28。本发明的一种具有免疫活性的浒苔多糖的制备方法，即多糖HT-II的提取纯化方法如下1、提取从青岛海域采取缘管浒苔做样品，浒苔样品用自来水冲洗，自然风干后取100g，打碎，以浒苔渣与水的质量比为1 30加入蒸馏水，95°C提取池，抽滤，滤渣再以 1 15的蒸馏水重复提取两次。合并滤液，旋转蒸发浓缩至液体微黏，加入3倍体积的95% 乙醇，4°C静置过夜。9000rpm离心，沉淀依次用85%、95%、无水乙醇及乙醚脱水，冷冻干燥
得粗多糖。2、脱蛋白将粗多糖配成5%的糖溶液，用木瓜蛋白酶，按酶与粗多糖质量比为 1 50取蛋白酶加入至糖液中，边加边搅拌，50°C保温Mi，9000rpm离心去除沉淀，上清液按糖液总体积的1/4加入kvage试剂(正丁醇氯仿=1 4)，摇床充分震荡30min，静置， 离心，取上清重复操作，直至无游离蛋白为止。3、纯化将粗多糖溶于pH7. 4磷酸缓冲液中，上DEAE-S^hadex A-50层析柱 (40X2. 5cm)进行初步分离。室温下，以上限为0. 5mol/L NaCl磷酸缓冲液进行梯度洗脱， 流速Mml/h，自动部分收集洗脱液，每IOmin收集1管(每管约細1)。采用苯酚-硫酸显色法，于490nm处测定吸光值，检测多糖含量。合并峰位洗脱液，透析后减压浓缩，冷冻干燥。获得的样品再由kphadex G-100层析柱(100X2cm)进一步纯化，洗脱液为0. 05mol/ L NH4AC溶液，流速为8ml/h，以苯酚-硫酸法跟踪检测。合并峰部的洗脱液，透析后浓缩冻干得纯化的浒苔多糖HT-II。采用紫外分光光度法，在^K)nm、280nm处检测样品的吸光值，
确定其纯度。本发明针对缘管浒苔的多糖进行分离提取，其制备方法为打碎一90°C水提一过滤一合并提取液一浓缩一乙醇沉淀一去除蛋白一分离纯化一冷冻干燥一多糖纯品。经体外细胞活性检测，该多糖单独或协同ConA能够显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，同时提高细胞白介素II(IL-2)的分泌，可作为提高机体免疫力的食品添加剂。结合多糖的组成分析，对本发明做进一步说明本发明的一种具有免疫活性的浒苔多糖，其多糖HT-II的分子量与单糖组成分析方法及结果1、采用高效凝胶渗透色谱法(HP-GPC)测定南极菌NJ-B3胞外多糖分子量。分析条件TSK-GELG2000PW, 3007. 5mmID 色谱柱；流动相 0. lmol/LNa2S04溶液，流速lOml/min ；柱温60°C，进样量2 μ 1，示差折光检测器检测。以标准Dextran T系列葡聚糖作标准曲线，计算分子量。分析结果表明HT-II多糖的相对分子量为96kDa。2、单糖组成分析10mg纯化多糖中加入2mol/L三氟乙酸2ml置于100°C水浴中水解18h，减压浓缩至干，加入IOmg盐酸羟胺和0. 5ml吡啶，放入90°C水浴中加热反应30min 分钟并振荡。取出后冷至室温，加入0. 5ml醋酸酐，90°C下继续反应30min分钟进行乙酰化。反应产物减压浓缩至干，加入0.5ml氯仿萃取。同时将D-阿拉伯糖，D-木糖、D-半乳搪、D-葡萄糖和D-甘露糖按上述步骤转化成糖氰乙酸酯衍生物作为标准对照，接着进行气相(GC)色谱分析。气相色谱分析条件0V-225柱，载气N2,90ml/min ；柱温240°C，检测器温度250°C， 气化室温度280°C，氢火焰离子检测器。分析结果表明HT-II主要由葡萄糖和甘露糖组成，其组成比为鼠李糖木糖 甘露糖葡萄糖=36 20 6 28。本发明制备的HT-II多糖具备良好的免疫活性。可在医药、食品、美容、生物技术等领域具有潜在的应用前景。本发明的特点在于1、以青岛海域的缘管浒苔为原料，开创性地建立提取、分离、 纯化浒苔多糖的生产工艺；2、提供了缘管浒苔多糖的潜在用途；细胞免疫试验表明HT-II多糖能够显著的提高小鼠脾淋巴细胞的增殖和促进小鼠白介素II的分泌，显示出良好的免疫活性。本发明制备的多糖纯品为生物技术产品，可广泛地用于医药、食品、生物技术等领域。
具体实施例方式结合实施例进一步说明本发明的技术方案实施例1 :HT-II多糖的制备方法
1、提取从青岛海域取缘管浒苔做样，浒苔样品用自来水冲洗，自然风干后取 100g，打碎，以浒苔渣与水的质量比为1 30加入蒸馏水，95°C提取池，抽滤，滤渣再以 1 15的蒸馏水重复提取两次。合并滤液，旋转蒸发浓缩至液体微黏，加入3倍体积的95% 乙醇，4°C静置过夜。9000rpm离心，沉淀依次用85%、95%、无水乙醇及乙醚脱水，冷冻干燥得粗多糖HT。2、脱蛋白将粗多糖配成5%的糖溶液，用木瓜蛋白酶，按酶与粗多糖质量比为 1 50取蛋白酶加入至糖液中，边加边搅拌，50°C保温Mi，9000rpm离心去除沉淀，上清液按糖液总体积的1/4加入kvage试剂(正丁醇氯仿=1 4)，摇床充分震荡30min，静置， 离心，取上清重复操作，直至无游离蛋白为止。3、纯化将粗多糖溶于pH7. 4磷酸缓冲液中，上DEAE-S^hadex A-50层析柱 (40X2. 5cm)进行初步分离。室温下，以上限为0. 5mol/L NaCl磷酸缓冲液进行梯度洗脱， 流速Mml/h，自动部分收集洗脱液，每IOmin收集1管(每管约細1)。采用苯酚-硫酸显色法，于490nm处测定吸光值，检测多糖含量。合并峰位洗脱液，透析后减压浓缩，冷冻干燥。获得的样品再由kphadex G-100层析柱(100X2cm)进一步纯化，洗脱液为0. 05mol/ L NH4AC溶液，流速为8ml/h，以苯酚-硫酸法跟踪检测。合并峰部的洗脱液，透析后浓缩冻干得纯化的浒苔多糖HT-II。采用紫外分光光度法，在^K)nm、280nm处检测样品的吸光值， 确定其纯度。实施例2 =HT-II多糖的免疫活性试验1、HT-II多糖对脾淋巴细胞的增殖作用采用MTS-PMS比色法。BALB/c小鼠断颈椎处死，无菌取脾，制备脾淋巴细胞，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4109/L cell/ ml ο将BALB/c小鼠4109/L cell/ml的脾细胞悬液加入96孔细胞培养板内，每孔 100 μ 1，多糖组每孔加入用RPMI1640完全培养液稀释成浓度为6. 25、12. 5、25、50、IOOmg/ L的HT-II各10μ 1，每个浓度5个重复，空白对照组以等体积的RPMI1640代替。置37°C， 5% CO2饱和湿度培养箱中培养72h。取出，加入20 μ IMTS-PMS继续培养4 他，用酶标仪
测定A492nm值。将BALB/c小鼠4109cell/ml的脾细胞悬液加入96孔细胞培养板内，随后每孔加入 ConAlOy 1，终浓度为5mg/L，多糖组每孔加入用RPMI1640完全培养液稀释成浓度为6. 25、 12. 5、25、50、100mg/L的HT-II各10 μ 1，每个浓度3个重复，空白对照组以等体积的RPMI 1640代替，置37°C ,5% CO2饱和湿度培养箱中培养72h。取出，加入20 μ 1 MTS-PMS继续培养4 他，用酶标仪测定A492nm值，测定结果见表1。表IHT多糖对脾淋巴细胞增殖的影响
组别0 (Control)6. 25多糖浓度(mg/L) 12.5 2550100HT0. 291 ±0. 0240. 319±0. 027*0. 361 ±0.016**0. 341 ±0.014**0. 359 士 0.015**0. 383±0.025**HT+ConA0. 743 土 0. 0931.074±0. 076**1.102±0.115**1.156±0. 037**1.037 土 0.058**0. 727 土 0· 044氺ρ < 0. 05 氺氺ρ < 0. 01 vs control从表1中看出，HT在6. 25 100mg/L的浓度范围内可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，随着多糖浓度增加，刺激效应呈增强趋势。HT在6. 25 50mg/L的浓度范围内与ConA刺激的淋巴细胞增殖有协同作用，但这种协同效应与多糖浓度无明显相关性。2、HT-II多糖对细胞白介素II的诱导作用制备脾单细胞悬液同上，加入48孔板，每孔1000 μ L，每样3个复孔，加ConA与多糖浓度同上，培养4 取上清用ELISA法测定 IL-2含量，测定结果见表2。表2HT多糖对IL-2分泌的影响
权利要求
1.一种具有免疫活性的浒苔多糖，其特征在于是指多糖HT-II，为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为96kDa，它主要由葡萄糖和甘露糖组成，其组成比为鼠李糖木糖甘露糖葡萄糖=36 20 6 28。
2.用于权利要求1所述的一种具有免疫活性的浒苔多糖的制备方法，其特征在于该制备方法为打碎一90°C水提一过滤一合并提取液一浓缩一乙醇沉淀一去除蛋白一分离纯化一冷冻干燥一多糖纯品。
3.如权利要求1或2所述的一种具有免疫活性的浒苔多糖的制备方法，其特征在于是多糖HT-II的提取纯化方法，其步骤如下a、提取从青岛海域采取缘管浒苔做样品，浒苔样品用自来水冲洗，自然风干后取 100g，打碎，以浒苔渣与水的质量比为1 30加入蒸馏水，95°C提取池，抽滤，滤渣再以 1 15的蒸馏水重复提取两次，合并滤液，旋转蒸发浓缩至液体微黏，加入3倍体积的95% 乙醇，4°C静置过夜。9000rpm离心，沉淀依次用85%、95%、无水乙醇及乙醚脱水，冷冻干燥得粗多糖；b、脱蛋白将粗多糖配成5%的糖溶液，用木瓜蛋白酶，按酶与粗多糖质量比为1 50 取蛋白酶加入至糖液中，边加边搅拌，50°C保温Mi，9000rpm离心去除沉淀，上清液按糖液总体积的1/4加入kvage试剂(正丁醇氯仿=1 4)，摇床充分震荡30min，静置，离心， 取上清重复操作，直至无游离蛋白为止；c、纯化将粗多糖溶于pH7.4磷酸缓冲液中，上DEAE-S^hadex A-50层析柱 (40X2. 5cm)进行初步分离。室温下，以上限为0. 5mol/L NaCl磷酸缓冲液进行梯度洗脱， 流速2%il/h，自动部分收集洗脱液，每IOmin收集1管(每管约細1)，采用苯酚-硫酸显色法，于490nm处测定吸光值，检测多糖含量，合并峰位洗脱液，透析后减压浓缩，冷冻干燥，获得的样品再由kphadex G-100层析柱(100X2cm)进一步纯化，洗脱液为0. 05mol/L NH4AC溶液，流速为8ml/h，以苯酚-硫酸法跟踪检测，合并峰部的洗脱液，透析后浓缩冻干得纯化的浒苔多糖HT-II，采用紫外分光光度法，在^K)nm、280nm处检测样品的吸光值，确定其纯度。
4.如权利要求1或2或3所述的一种具有免疫活性的浒苔多糖及其制备方法，其特征在于所述的浒苔多糖HT-II可单独或协同ConA使用，能够有效促进小鼠脾淋巴细胞增殖， 提高小鼠细胞白介素II的分泌。
全文摘要
一种具有免疫活性的浒苔多糖是指多糖HT-II，为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为96kDa，它主要由葡萄糖和甘露糖组成，其组成比为鼠李糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖＝36∶20∶6∶28。其制备方法打碎→90℃水提→过滤→合并提取液→浓缩→乙醇沉淀→去除蛋白→分离纯化→冷冻干燥→多糖纯品。具有方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，可集降低胆固醇与提高免疫力为一体等特点。尤其是采用提取、脱蛋白、纯化的制备方法，以及科学的试验手段，开创了治理浒苔的新方法和途径。开发了浒苔的药用价值和用途，治理了环境污染，降低了清理成本，提高了经济效益，是理想的浒苔治理和综合利用的专用制备技术。
文档编号A61P39/00GK102399297SQ20101028197
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者李江, 林学政, 谭姣姣, 黄晓航 申请人:国家海洋局第一海洋研究所