专利名称：一种油菜蜂花粉提取物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物提取物，特别是涉及一种油菜蜂花粉提取物及其应用。
背景技术：
油菜(Brassica campestris L.)为十字花科芸苔属植物，油菜蜂花粉是蜜蜂采集 的油菜雄性生殖细胞，其不仅含有许多营养成分，还含有许多与生命科学相关的药效成分， 是传统的纯天然营养保健品。由于其含有丰富的营养素又有众多的生理活性成分，导致油 菜蜂花粉具有多种多样的营养药理学作用。迄今证实，油菜蜂花粉具有促进生长发育、抗疲 劳，提高运动能力、促进造血功能、调节免疫功能、抗衰老、调节体内代谢和内分泌功能、抑 制前列腺增生和抗炎、抗肝损伤、抗溃疡、改善消化道功能；此外，增进学习记忆功能、抗肿 瘤、解毒等作用亦有报道。这些作用的发现直接为研制特种营养保健与药品提供了依据。实验证明，花粉有较好的抗炎作用。口服花粉提取物T60或GBX对巴豆油或卵白 蛋白所致的大鼠足趾肿胀和滤纸片肉芽肿有抑制作用。另据报道玉米花粉多糖提取物具有 抑菌作用。而关于油菜蜂花粉的相关作用未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗炎、镇痛、抑菌活性的油菜蜂花粉提取物，并进一 步提供其制备方法和应用方法。为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种油菜蜂花粉提取物，其制备步骤 为(1)取油菜蜂花粉，加入3 10倍体积蒸馏水或去离子水，超声辅助常温或加热进 行水提，离心分离上清，沉淀重复提取，合并上清液，减压浓缩至0.5 Ig花粉/ml ；(2)向上述浓缩物中缓慢加入乙醇至沉淀不再产生，离心去沉淀，取上清液减压浓
缩获得浸膏；(3)取上述浸膏，加入甲醇至恰好完全溶解，缓慢加入丙酮至沉淀不再产生，离心 去沉淀，上清液减压浓缩并干燥后即得。上述步骤(1)中还可以包括在水提前将油菜蜂花粉进行破壁的过程，可使提取率 显著提高。破壁的方法可采用任何已知的蜂花粉物理破壁方法，如超临界破壁法、机械破壁 法、微波辐射破壁法、气流粉碎法等。本发明的提取物，其中制备步骤⑴中，水提温度优选为15 50°C，提取时间1 4小时，重复提取次数2 4次；减压浓缩温度为40 60°C。本发明的提取物，其中制备步骤(2)中，减压浓缩脱去乙醇时的温度优选为35 50 "C。本发明的提取物，其中制备步骤(3)中干燥方式为常压干燥、低温干燥、真空干燥 或冷冻干燥。本发明发现所得到的提取物具有很好的抗炎、镇痛、抑菌活性，故而可将其按照常
3规方法制备成可临床应用或方便服用的各种食品、药品或保健品，如一种抗炎组合物，或一 种镇痛组合物，或一种抑菌组合物。本发明通过大量工艺研究得到了油菜蜂花粉中含有的一种具有抗炎、镇痛、抑菌 活性的提取物。通过严谨的试验证明，该提取物具有抗炎、镇痛、抑菌作用，对人白细胞弹性 蛋白酶有抑制作用；对醋酸所致的小鼠内脏疼痛和热板所致的体表疼痛均有良好的镇痛作 用；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌具有良好的抑菌 杀菌作用。本发明可应用于植物源抗炎、镇痛、抑菌剂的开发。并且我国油菜花粉产量巨大， 其作为生产植物源抗炎、镇痛、抑菌剂的原料，还具有成本低廉、工艺流程简单的优点。本发明得到的油菜蜂花粉水提浓缩物经过乙醇沉淀除去了乙醇不溶物，在甲醇饱 和溶液中加入丙酮，对提取物进行了进一步的除杂和纯化，提取物富集了相关功能成分，作 用效果明显。本发明的制备方法对设备条件要求低，方法简单，易于实施，制备周期短，成本 低，适合生产。
图1是本发明的油菜蜂花粉提取物的抗炎实验结果。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1一种油菜蜂花粉提取物的制备方法，该制备方法依次包括以下步骤称取油菜蜂花粉100g，加入300ml蒸馏水，50°C超声辅助提取1小时，离心获得提 取液，沉淀部分重复提取一次，离心，合并上清液，50°C旋转蒸发浓缩至Ig花粉/ml，于磁力 搅拌下向浓缩水提液中缓慢加入95%乙醇至不再产生沉淀为止，静置，离心分离上清液， 50°C旋转蒸发脱去乙醇浓缩成浸膏，加入甲醇至恰好完全溶解，缓慢加入丙酮至不再产生 沉淀为止，离心取上清，50°C旋转蒸发至干。即获得该提取物。实施例2一种油菜蜂花粉提取物的制备方法，该制备方法依次包括以下几个步骤将新鲜蜂花粉真空干燥至水分含量为10. 0%，取300g干燥花粉装入IL萃取器，在 萃取釜温度45°C的条件下，用纯度为99%的二氧化碳进行升压至萃取釜压力45MPa ；保持 压力IOmin后打开萃取罐排气阀迅速排空二氧化碳，收集花粉即可。经电镜检测，花粉细胞
已破壁。称取上述已破壁的油菜蜂花粉100g，加入IOOOml蒸馏水，20°C超声辅助提取1小 时，离心获得提取液，沉淀部分重复提取一次，离心，合并上清液，60°C旋转蒸发浓缩至0. 5g 花粉/ml，于磁力搅拌下向浓缩液中缓慢加入95%乙醇至不再产生沉淀为止，静置，离心分 离上清液，35°C旋转蒸发脱去乙醇，升温脱去水分，浓缩成浸膏，加入甲醇至恰好完全溶解， 加入丙酮至不产生沉淀为止，滤去沉淀，将上清部分减压浓缩至干，即获得该提取物。实施例3一种油菜蜂花粉提取物的制备方法，该制备方法依次包括以下几个步骤
称取实施例2的破壁油菜蜂花粉100g，加入500ml蒸馏水，50°C超声辅助提取1小 时，离心获得提取液，沉淀部分重复提取一次，离心，合并上清，60°C旋转蒸发至0. 8g花粉/ ml，于磁力搅拌下向浓缩水提液中缓慢加入无水乙醇至不再产生沉淀为止，静置，离心分离 上清液，60°C减压浓缩成浸膏，加入甲醇至恰好完全溶解，缓慢加入丙酮至不再产生沉淀， 去除沉淀，将上清部分减压浓缩至干，即获得该提取物。实施例4一种油菜蜂花粉提取物的制备方法，该制备方法依次包括以下几个步骤称取油菜蜂花粉100g，加入500ml蒸馏水，50°C超声辅助提取1小时，离心固液分 离，固体部分重复提取一次，合并上清液，50°C旋转蒸发浓缩，获得浓缩水提液。向浓缩水提 液中缓慢加入5倍体积95%乙醇进行醇沉(乙醇终浓度约为80%)。离心，取上清液40°C 旋转蒸发脱去乙醇，再50°C旋转蒸发浓缩成浸膏，加入甲醇至恰好完全溶解，缓慢加入丙酮 至不再产生沉淀，去除沉淀，将上清部分减压浓缩至干，即获得该提取物。为了证明上述提取物的抗炎镇痛抑菌效果，发明人使用上述实施例中提供的方法 制备得到的油菜蜂花粉提取物进行了药效学实验，研究结果如下(为各个实施例的提取物 的试验结果的平均值)一、油菜蜂花粉提取物抗炎实验_人弹性蛋白酶(HLE)抑制实验在微量进样管中(250 μ 1)先后加入PBS缓冲液30 μ 1、HLE酶液50 μ 1和样品液 20μ 1，37°C平衡lOmin。再加入底物溶液50 μ 1。样品和空白都重复三次。37°C反应120!^11后加入20%的醋酸溶液5(^1终止反应，最后将各反应液在 405nm波长下进行HPLC分析，测定PNA生成量；空白组以DMSO代替样品液。反应体积 150 μ 1。液相条件色谱柱C18 (VP-0DS, 150mmX4. 6mm, 5 μ m)；流动相甲醇和水；梯度洗 脱(Omin IOmin 为 25% 甲醇，10 15min 为 25% 90% 甲醇，15 20min 为 90% 25% 甲醇，20 25min为25%甲醇)；流速:lmL/min ；检测波长:405nm ；柱温:40°C ；进样体积 40 μ 1。实验结果如图1所示，从图中可以得出，油菜蜂花粉提取物对HLE有抑制作用，浓 度为0. 25μ g/ml时，抑制率(% )为34. 67士 1. 58，该抑制活性随样品浓度的增加而增加， 在浓度为4yg/ml时，抑制率(％)为64. 76士4. 42，呈现出量效关系，经回归计算，该提取 物对HLE的半抑制浓度(IC5tl)为1. 15 μ g/ml。二、油菜蜂花粉提取物镇痛实验(1)热板实验将小鼠按体重随机分为5组空白组、阿斯匹林组、提取物组(840、420、 210mg · kg"1)。连续给药7天，试验当日，将小鼠置于55°C的热板上，以小鼠舔后足的潜伏 期为痛阈指标。试验当日分别测定给药后30min、60min、120min、240min的指标，并进行组 间差异比较。结果见表1。表 1组别剂量 mg/kgN3 Omin60min120min240min空白组-717.57±4.9619.00 士 9.3622.29士 6.0526.14 土 6.91阿司匹林500929.78±8.67**23.67士9.7230.44士 18.1741.89±16.84*大剂量8401025.20士 5.03**22.00士 12.7041.70±16.75**32.90士 12.02中剂量420929.11 士 21.5336.44士 18.27*41.33 士 19.48*32.22士 16.12小剂量210817.44 士 7.0624.00±16.5223.18 士 15.4341.44±12.33**与空白对照组比较*p < 0. 05 **p < 0. 01结果油菜蜂花粉提取物大、中剂量组的镇痛作用在给药后30min起效，其中大剂 量组与空白对照组比较有极显著差异(ρ <0.01) ；2h后镇痛作用达高峰，4h后尚有镇痛作 用；小剂量组显示出缓慢镇痛，4h后镇痛作用达高峰，与空白对照组比较有极显著差异(ρ < 0.01)。实验表明油菜蜂花粉提取物能提高热致痛小鼠的痛阈率，提示其可抵抗热致痛对 小鼠的影响，并使其痛感潜伏期明显延长，小剂量缓慢镇痛，大剂量快速镇痛，有量效关系； 其镇痛强度和镇痛持续时间与阿斯匹林相当。(2)扭体实验将小鼠按体重随机分为5组空白组、阿斯匹林组、提取物组(840、420、 210mg · kg"1)。连续给药8天，试验当日给药1小时后，各组小鼠腹腔注射0. 7%冰醋酸生 理盐水溶液。以15分钟内扭体次数以及抑制率作为观察指标，并进行组间差异比较。结果 见表2。表2
组别剂量(mg/kg)N给药1小时(次)镇痛百分率(% )空白组750. 57±12. 19阿司匹林50088. 00 ±5. 95**84. 18大剂量8401038. 20±13. 9724. 46中剂量420836. 75±6. 71*27. 33小剂量210830. 38±8. 18"39. 92与空白对照组比较*p < 0. 05 **p < 0. 01结果表明，油菜蜂花粉提取物中、小剂量组灌胃对醋酸引起的小鼠扭体次数与空 白对照组比较明显减少，经统计分析，中剂量组具有显著差异(P < 0. 05)，小剂量组具有极 显著差异(ρ <0.01)。提示油菜蜂花粉提取物能抑制醋酸刺激腹腔粘膜引起的痛反应，减 少小鼠的扭体次数，说明具有镇痛作用，小剂量(210mg/kg)即可起到镇痛效果。
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三、油菜蜂花粉提取物抑菌实验培养基配制按配比配制培养基，混勻，与牛津杯、移液管一同灭菌。每个平板注入 20ml灭菌培养基，干燥透待用。菌悬液制备取一环金黄色葡萄球菌溶于3ml无菌水中，用移液枪混勻。制成菌悬 液，利用血球计数板显微镜下计数，调整菌液浓度保持在106—7个/ml左右。取干燥平板，取菌悬液0. 2ml涂布平板，待干燥后在平板上均勻放置四个牛津杯。 取浓度为200mg/ml样品、甲醇，分别注入牛津杯中，对应位置一致，标注。37°C培养观察，24 小时观察，记录实验结果。结果见表3。表 3
编号浓度大肠杆 菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞 菌枯草芽孢杆 菌提取物200mg/ml17.8918.8521.7519.38苯甲酸钠100mg/ml13.3213.279.8112.85溶剂对照100%曱醇8.008.008.008.00注牛津杯外径8mm实验结果表明，油菜蜂花粉提取物具有良好的抑菌效果，在同浓度(200mg/ml)下 对不同菌种抑制能力有所差别，抑菌能力依次为铜绿假单胞菌 > 枯草芽孢杆菌 >金黄色葡 萄球菌>大肠杆菌，其中对铜绿假单胞菌抑制效果最强(抑菌圈直径21. 75mm)，对大肠杆 菌抑制效果最弱(抑菌圈直径17. 89mm)。溶剂(100%甲醇)在实验中未表现出抑菌作用， 而阳性对照(苯甲酸钠)表现出很好的抑菌效果，但是对于铜绿假单胞菌的敏感性逊于其 他三个菌种，这一点与油菜蜂花粉提取物正相反。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
权利要求
一种油菜蜂花粉提取物，其特征在于，其制备步骤为(1)取油菜蜂花粉，加入3～10倍体积蒸馏水或去离子水，超声辅助常温或加热进行水提，离心分离上清，沉淀重复提取，合并上清液，减压浓缩至0.5～1g花粉/ml；(2)向上述浓缩物中缓慢加入乙醇至沉淀不再产生，离心去沉淀，取上清液减压浓缩获得浸膏；(3)取上述浸膏，加入甲醇至恰好完全溶解，缓慢加入丙酮至沉淀不再产生，离心去沉淀，上清液减压浓缩并干燥后即得。
2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述步骤(1)在水提前还包括将油菜蜂花 粉进行破壁的过程。
3.如权利要求1或2所述的提取物，其特征在于，所述步骤(1)中，水提温度15 500C，提取时间1 4小时，重复提取次数2 4次；减压浓缩温度为40 60°C。
4.如权利要求1-3任一项所述的提取物，其特征在于，所述步骤(2)中，减压浓缩脱去 乙醇时的温度为35 50°C。
5.如权利要求1-4任一项所述的提取物，其特征在于，所述步骤(3)中干燥方式为常压 干燥、低温干燥、真空干燥或冷冻干燥。
6.一种抗炎组合物，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述的提取物。
7.一种镇痛组合物，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述的提取物。
8.一种抑菌组合物，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述的提取物。
全文摘要
本发明通过大量工艺研究从油菜蜂花粉中得到了一种具有抗炎、镇痛、抑菌活性的提取物。通过严谨的试验证明，该提取物具有抗炎、镇痛、抑菌作用，对人白细胞弹性蛋白酶有抑制作用；对醋酸所致的小鼠内脏疼痛和热板所致的体表疼痛均有良好的镇痛作用；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等细菌具有良好的抑菌作用。本发明可应用于植物源抗炎、镇痛、抑菌剂的开发。并且我国油菜花粉产量巨大，其作为生产植物源抗炎、镇痛、抑菌剂的原料，还具有成本低廉、工艺流程简单的优点。
文档编号A61K35/64GK101978864SQ20101029579
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者孙丽萍, 安仲姚, 徐响, 李春艳, 董捷 申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所