小鹅瘟活疫苗的制备方法及其制备的活疫苗的制作方法

专利名称：小鹅瘟活疫苗的制备方法及其制备的活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及小鹅瘟活疫苗的制备方法及其制备的活疫苗。
背景技术：
鹅瘟是由小鹅瘟病毒引起的20日龄以内的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病， 其发病率和死亡率可高达9(Γ100%，对养鹅业造成巨大经济损失的疫病。1956年方定一教 授首先在扬州发现此病，1961年方定一、王永坤等在扬州再次发现本病，并分离到病毒，命 名为小鹅瘟，其病原为小鹅瘟病毒。此病在全国各省份和世界养鹅国家均有暴发流行。根据国际兽医局(OIE)国际委员会通过的由OIE标准委员会编的哺乳动物、禽和 蜜蜂A和B类疾病“诊断试验和疫苗标准手册”(第三版，1996年)中未见有“小鹅瘟诊断试 验和疫苗”方面的内容及标准。八十年代末由广东省佛山兽医专科学校制订的“鸭胚化小鹅瘟弱毒苗”通过部规 程委员会。九十年代初有福建兽医生药厂和广东兽医生药厂生产供应。据了解，毒种接种 鸭胚死亡仅为7(Γ80% ；鸭胚含毒量低；每ml苗免疫羽份仅为鹅胚化疫苗的1/1(Γ1/100 ； 免疫效果差。本申请人于80年中期将已经研制的“鸭胚化小鹅瘟活疫苗”淘汰，其主要原 因包括在鸭胚传25代，毒种最高仅能使鸭胚死亡80%，不稳定；鸭胚死亡时间没有规律， 时间太长；鸭胚胚液少，产量低，成本高。

发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种小鹅瘟活疫苗 的制备方法，以实现用最简单的制备方法制备出产量高、稳定性好、成本低的疫苗。本发明 的另一目的是提供由上述方法制备得到的疫苗。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种制备小鹅瘟活疫苗的方法，将接种了小鹅瘟种毒的鹅胚孵化，收集48 144h内死 亡鹅胚的胚液，经冷冻真空干燥得到小鹅瘟活疫苗。所述的小鹅瘟病毒的毒株为SYG61毒株的26 35代毒或4广50代毒，SYG61为扬 州大学(原苏北农学院)方定一、王永坤教授在1961年在国际上首次报道、分离的小鹅瘟毒 株。所述的小鹅瘟病毒的毒株的接种量为将毒种用生理盐水作1:100倍稀释，0.2ml/胚。所述的鹅胚为无小鹅瘟抗体易感鹅胚。所述鹅胚为12 14日龄，接种途径为尿囊腔接种，孵化温度为37. 5°C
收集48 144h内死亡鹅胚的胚液，病毒含量应尝107_°ELD5Q/1.0ml，即可用于制苗。先将检验合格的胚液过滤于灭菌容器内，加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加 入青霉素、链霉素各1000单位/ml，充分摇勻，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。
3
上述的制备小鹅瘟活疫苗的方法所制得的活疫苗。本发明的小鹅瘟活疫苗的制备方法，包括小鹅瘟种毒SYG61的筛选，将小鹅瘟 病毒种毒用灭菌PBS作1:100稀释，接种12日龄发育良好的鹅胚，每胚绒尿腔0. 2ml，将 48^144小时死亡的鹅胚，置2、°C冰箱冷却圹24小时。分别将经冷却的鹅胚侵入于5%新 洁尔灭消毒液5 10分钟，擦干后放置无菌室内，先以5%碘酊消毒气室蛋壳部，以无菌手续 打开蛋壳，拨除蛋膜及撕破绒尿膜，吸出尿囊液和羊水，加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同 时加入青霉素、链霉素各1000单位/ml，充分摇勻，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干
O本发明的小鹅瘟活疫苗的制备方法，包括种鹅用小鹅瘟活疫苗和雏鹅用小鹅瘟活 疫苗制造，所述小鹅瘟活疫苗是将接种小鹅瘟种毒的鹅胚孵化，收集48 144小时内死亡鹅 胚的胚液，经冷冻真空干燥得到小鹅瘟活疫苗。种鹅用的活疫苗的种毒为SYG61毒株的 26 35代毒，代号为SYG26 35 ；制造雏鹅和雏鹅用的活疫苗的种毒为SYG61毒株的4广50代 毒，代号为SYG4广50。本发明的小鹅瘟活疫苗的制备方法，步骤少，易操作，所制备出的小鹅瘟活疫苗， 产量高、稳定性好、成本低，免疫保护效果好。种鹅在产蛋前15天左右用1 100稀释的鹅 胚化种鹅弱毒苗进行皮下或肌肉注射。在免疫12天后至100天左右，鹅群所产蛋孵化的雏 鹅群能抵抗人工及自然病毒的感染。未经免疫的种鹅群，或种鹅群免疫100天以上的所产 蛋孵化的雏鹅群，在出炕48小时内应用鹅胚化雏鹅弱毒疫苗进行免疫，免疫后7天内严格 隔离饲养，防止强毒感染，保护率达95%左右。在已被污染的雏鹅群作紧急预防，保护率达 70% 80%。


图1是小鹅瘟病毒攻毒结果表。 图2是安全试验结果表。 图3是攻毒试验结果表。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。实施例1毒种研究 一种毒的分离
病料1961年从扬州发生小鹅瘟的患病雏鹅的肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、脑、血液病毒分罔。病料处理无菌采集患病雏鹅的肝、脾、胰、脑等内脏器官病料和无菌采集患病雏 鹅的肝、胰、脾等病料，分别剪碎、磨细，用灭菌PBS液作1 5稀释，经3000转/分离心30分 钟，取离心的上清液按4:1加入分析纯氯仿充分混勻后放置37°C温箱作用60分钟，或4°C 冰箱过夜，经3000转/分离心30分钟，取上清液加入抗菌素，使之每毫升含有青霉素、链霉 素各1000单位，于37°C温箱作用30分钟，经细菌检验为阴性者，冻结保存作为病毒分离材 料。该方法因经氯仿处理后可清除其他病毒，尤其是清除囊膜病毒在病毒分离过程中 的干扰，可获较为可靠的小鹅瘟病毒。病毒分离接种将病毒组织上清液材料接种12日龄易感鹅胚，每胚绒尿腔接种 0.2ml。收获72小时以后死亡鹅胚绒尿液，经细菌检验合格，低温保存作为传代毒种。患病雏鹅分离的毒种简称为SYG61毒株，
传代将SYG61毒株鹅胚绒尿液分别在12日龄易感鹅胚绒尿腔传代。鉴定除了作细菌、霉菌和支原体常规检验外，外源病毒检验以鸡胚接种和红细胞 凝集试验。鸡胚接种鹅胚绒尿液毒分别接种10日龄SPF鸡胚和12日龄易感鹅胚，每枚绒尿 控接种0. 2ml，观察10天。红细胞凝集试验鹅胚绒尿液毒与1. 0%鸡红细胞试管或50孔板凝集反应。SYG61毒株初次分离时，仅能引起部分鹅胚在5 7天死亡。在易感鹅胚传10代后能 使12 14日龄易感鹅胚死亡，死亡率达95%左右。鹅胚死亡时间在48 120小时，大多数在 72 96小时之间。经细菌、霉菌、支原体检验证明不带细菌。经鸡胚接种不引起鸡胚死亡，鸡 胚无病变，绒尿液不凝集鸡红细胞。鹅胚绒尿液无凝集红细胞现象。雏鹅的小鹅瘟病毒的分离和传代所用的鹅胚必须未经免疫，琼扩抗体为阴性的健 康种鹅群，发育良好的12日龄。免疫过或琼扩阳性的种鹅群的胚胎对病毒不易感，不能作 为分离和传代用。制造种鹅用的活疫苗的种毒为SYG61毒株的26 35代毒，代号为SYG2fr35 ；制造雏 鹅和雏鹅用的活疫苗的种毒为SYG61毒株的4广50代毒，代号为SYG41~5Q。二种毒毒力返强试验
种毒=SYG26代鹅胚绒尿液毒、SYG 41代鹅胚绒尿液毒。雏鹅非疫区、未经免疫、琼扩检验抗体阴性的健康种鹅群后代的雏鹅。鹅胚非疫区、未经免疫、琼扩检验抗体阴性的健康种鹅群的胚胎。毒力返强试验
将SYG26和SYG41代制备的鹅胚绒尿液毒分别皮下注射5只5日龄健康雏鹅，每雏鹅注 射0. 5ml。72小时任取其中2只雏鹅扑杀，按无菌手续采取肝、脾组织，称重后混合置灭菌研 磨器中磨碎，用灭菌Hanks液作1:5稀释，每ml加入青霉素和链霉素各1000单位，置37°C 温箱作用30分钟。取上清液接种5只5日龄同一来源的易感雏鹅，每只皮下0. Iml0 72小 时任取其中2只雏鹅扑杀，按此方法，SYG26连续传4代，SYG41连续传5代。每代未扑杀的 雏鹅均隔离饲养观察10天。SYG26代制备的鹅胚绒尿液毒，经易感雏鹅连续传4代和SYG41代制备的鹅胚绒尿 液毒，经易感雏鹅连续传5代，每代扑杀的雏鹅内脏器官无肉眼可见病变，也无小鹅瘟组织 学显微病理变化，未扑杀的雏鹅未发生死亡，生长情况良好，无任何不良反应。上述结果说 明弱毒株对雏鹅具有安全可靠，无毒力返强现象。将SYG26代制备的鹅胚绒尿液毒皮下注射6只5日龄雏鹅，每雏鹅0. 5ml。72小时 任取其中3只雏鹅扑杀，按无菌手续采取肝、脾组织，称重后混合置灭菌研磨器中磨细，用 灭菌生理盐水作1 5稀释，每ml加青霉素和链霉素各1000单位，置37°C温箱作用30分钟。 取上清液接种6只5日龄同一来源的易感雏鹅，每只皮下0. Iml0 72小时任取其中3只雏 鹅扑杀，按此方法连续传5代。每代未扑杀的3只雏鹅均分别隔离饲养观察10天。SYG41代制备的鹅胚绒尿液毒，经易感雏鹅连续传5代，每代扑杀的雏鹅内脏器官 无肉眼可见的病变，也无组织学显微病理变化。未扑杀的雏鹅未发生死亡，生长良好，无任 何不良反应。上述结果说明本弱毒株对雏鹅具有安全可靠，无毒力返强现象。
病毒在鹅体内存留的测定
50只试验鹅，每只胸部肌肉注射1:10，0.1ml SYG26代制备的鹅胚绒尿液毒。注射24、 48、72、144和240小时5个不同时间杀死，每批扑杀5只。用无菌手续分别等量取5只鹅 肝、脾混合磨细，肠内容物和十二指肠肠管剪碎磨细，置 15°C冰箱内冻结保存。将被检材 料分别用灭菌生理盐水作1:5稀释，经离心取上清液每ml加入各1000单位青霉素和链霉 素，于37°C温箱作用1小时。每个被检材料接种5枚13日龄鹅胚，每胚绒尿腔0.2ml。在 48^144小时内死亡的鹅胚经无菌检验、血凝检测及病变检查，符合本病毒特性者为准。观察 10天。从SYG26代制备的鹅胚绒尿液毒注射24小时后首先在十二指肠组织检测到病毒， 48小时在十二指肠、肠内容物均可检测到病毒，96小时在十二指肠、肠内容物和肝、脾组织 均可检测到病毒，而144小时和240小时均没有检测到病毒。从上述结果，本弱毒株注射鹅 体后2Γ96小时病毒在十二指肠出现，96小时在肠内容物及肝脾组织出现，而144上时没能 检测到病毒。说明本病毒在鹅体内存留96小时左右；96小时肠内容物检测仅引起20%鹅 胚死亡，因此小鹅瘟弱毒株种鹅免疫注射后，对饲养场地污染是暂时，在产蛋前二周注射， 病毒对蛋壳的污染机会基本没有。从SYG26代和SYG41代制备的病毒液在易感雏鹅体内连续传4代和5代，经饲养观 察以及肉眼和显微病理学检查结果，证明无毒力返强现象。从SYG26R制备的病毒液在鹅体 内存留的测定结果，病毒在体内及肠内容物存留96小时左右，144小时已检测不到病毒。从SYG26代制备的病毒液在易感雏鹅体内连续传5代，经饲养观察以及肉眼和显微 病理学检查结果，证明无毒力返强现象。试验结果，说明具有可靠的安全性。实施例2小鹅瘟活疫苗的制备
本发明所使用的SYG61为扬州大学(原苏北农学院)方定一、王永坤教授在1961年在国 际上首次报道、分离的小鹅瘟毒株 毒种的繁殖
小鹅瘟病毒的毒种为在易感鹅胚连续传代的鹅胚绒尿液。制造种鹅用的活疫苗的种毒 为SYG26 35 ；制造雏鹅和雏鹅用的活疫苗的种毒为SYG4广50。将冻干毒种先加少许灭菌 PBS液乳化，吸出再稀释使其达1 100稀释。或将保存于 15°C的鹅胚绒尿液毒种用灭菌 PBS液作1:100稀释。将经稀释的毒种接种1(Γ20枚12日龄易感鹅胚，每胚绒尿腔0. 2ml。 选取接种48 120小时内死亡，病变典型的鹅胚，分别收获鹅胚液(尿囊液和羊水)，装于灭菌 容器内。将经检验无菌的胚液混合，定量分装，冷冻保存。注射收获日期、毒种代次等。毒种鉴定按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》，应符合规定。毒种保存在 15°C，使用期应不超过1年。毒种继代应不超过10代。制苗材料选择
制苗用的种鹅蛋，为非疫区、未经小鹅瘟疫苗免疫、小鹅瘟病毒琼扩诊断抗原检验抗体 阴性的和经鹅副粘病毒病灭活苗及禽流感灭活苗免疫的健康种鹅群。种蛋要新鲜和85%以 上受精率。经消毒后立即置37 38°C孵卵箱内孵化，相对温度为6(Γ70%之间。选择发育良 好的12日龄鹅胚作为小鹅瘟制苗材料。制苗毒液的繁殖
6取生产用小鹅瘟病毒种鹅用和雏鹅用毒种，分别用灭菌生理盐水作1:100倍稀释，接 种12日龄鹅胚，每胚绒尿腔0.2ml。接种后置37 38°C温室(孵化箱)继续孵化，不必翻蛋。小鹅瘟病毒接种的鹅胚，接种后每天照蛋一次，将48小时前死亡胚弃去，4纩144 小时间，每8小时照蛋一次，随时取出死亡鹅胚，置2 8°C冰箱冷却圹24小时。分别将冷却后的鹅胚浸泡于5%新洁尔灭消毒液5 10分钟，用消毒纱巾擦干后放 置无菌室内。先以5%碘酊消毒气室蛋壳部位，以无菌手续打开蛋壳，拔除蛋膜及撕破绒尿 膜，吸出尿液和羊水。每若干个胚的绒尿液(25(T500ml)混合为一组，置于灭菌瓶中，并加入 适量抗菌素，放2 8°C冰库处理，留样后，结冻保存。在收获过程中同时逐个观察胚体病变， 如胎儿腐败、液体混浊及有任何污染可疑的胚弃去不用。半成品检验
将每组留样按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001)附录301页进行，应 无细菌生长。病毒含量测定每ml含量，小鹅瘟病毒> 107_°。配苗及分装
先将检验合格的同一毒株的绒尿液混合。将雏鹅细小病毒液和小鹅瘟病毒液分别过滤 于两个灭菌容器内。再将两种病毒液等量混合后加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加入 适量抗菌素，充分摇勻，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。冻干完毕压塞、加盖、贴 签，置低温保存。成品检验
物理性状冻干苗为微黄色或白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。无菌检验按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》2001版附录301页进行， 应无细菌生长。支原体检验按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》2001版附录305页进 行，应无支原体生长。鉴别检验本品用抗小鹅瘟病毒血清等量混合进行中和后，尿囊腔接种10日龄易 感鹅胚6枚，每枚尿囊腔接种0. 2ml，应不发生感染死亡。外源病毒检验按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001)二版附录306 页检验外，2. 1. 1法进行。但在用SPF鸡胚检验的同时应加30个10日龄的鹅胚，同时分组 试验，观察判定。应无外源病毒污染。安全检验按瓶签注明羽份，疫苗用灭菌生理盐水稀释成每毫升含20羽份，皮下 注射5日龄雏鹅5只，每只皮下注射1ml，观察14天，应无临床反应。效力检验用2日龄健康易感雏鹅10只，每只皮下接种疫苗0. Iml (相当于1个 使用剂量)，免疫后9天，第一组连同条件相同的未免疫对照雏鹅10只，另一组连同条件相 同的未免疫对照雏鹅10只，各皮下注射小鹅瘟SYG61强毒1:50，0. 5ml。攻毒后均观察14 天，对照组至少8只发病死亡，各免疫组至少9只保护为合格。实施例3小鹅瘟活疫苗的效力检验 雏鹅疫苗保护效力检验
疫苗0607、0608、0609、0901、0902等5批冻干苗，每瓶苗为500羽剂量，保存于 15°C冰箱备用。雏鹅非疫区、未经免疫、琼扩抗体阴性的种鹅群的2日龄雏鹅。攻毒毒种小鹅瘟病毒SYG61强毒株。对一日龄雏鹅毒力，每ml应> 106LD50。0607、0608、0609等3批冻干苗，每批任取5瓶，每瓶加1. Oml灭菌生理盐水溶解， 抽取等量苗液作混合样。共免疫三群13010只，每只于出壳后48小时内用1:50稀释苗液， 皮下注射0. 1ml，隔离饲养9天。176只用SYG61毒株攻击，另设10只同日龄雏鹅作对照组， 每只皮下注射1:50稀释0. 5ml, 10只作空白对照组，隔离饲养观察14天。0901,0902等2批冻干苗，每批任取5瓶，每瓶加1. Oml灭菌生理盐水溶解，抽取等 量苗液作混合样。免疫两群各800余只雏鹅，每只于出壳后48小时内用1:50稀释苗液，皮 下注射0. 1ml，隔离饲养9天。每群任取50只用SYG61毒株攻击，另设10只同日龄雏鹅作 对照组，每只皮下注射1:50稀释0. 5ml, 10只空白对照组，隔离饲养观察14天。0607、0608、0609等3批冻干苗免疫后生长良好，无不良反应。免疫后9天用强毒 株攻击。小鹅瘟病毒SYG61毒株攻击结果，0607批冻干苗免疫的59只，存活56只，保护率 为94. 92% ；0608批冻干苗免疫的59只，存活55只，保护率为93. 22% ；0609批冻干苗免疫的 58只，存活54只，保护率为93. 10% ；而10只对照组雏鹅攻毒后死亡9只，死亡率为90% ； 10 只空白对照组全部健活。0901,0902等2批冻干苗免疫后生长良好，无不良反应。免疫后9天分别强毒攻 击。小鹅瘟病毒SYG61毒株攻击结果，9901批冻干苗免疫的50只，存活49只，保护率为 98% ；0902批冻干苗免疫的50只存活47只，保护率为94% ；而10只对照组雏鹅攻毒后死亡 9只，死亡率为90%。详细结果如图1所示。应用小鹅瘟SYG61弱毒株制备的5批冻干苗，每只2日龄雏鹅注射1 50，0. Iml苗 液，免疫9天后分别用1:50，0. 5ml强毒攻击。结果；用小鹅瘟病毒攻击的276只雏鹅，保护 261只，保护率为94. 57%，而20只对照组雏鹅死亡18只，死亡率为90%，20只空白对照雏鹅 全部健活。上述结果表明雏鹅出壳后48小时内用雏鹅用活疫苗免疫，免疫后9天有94%左 右保护率。小鹅瘟病毒SYG4广50弱毒株制备的0607、0901等5批冻干苗，共免疫14610只 2日龄雏鹅。免疫后9天；任取276只雏鹅用小鹅瘟病毒SYG61强毒攻击，每只皮下1:50， 0. 5ml。结果，保护261只，保护率为94. 57%，而20只对照组死亡18只，死亡率为90%，40只 空白对照组雏鹅全部健活。种鹅疫苗保护效力检验
抗小鹅瘟母源抗体是由种母鹅经卵传递给雏鹅，具有抵抗小鹅瘟病毒侵袭，保护雏鹅 不受感染发病的作用。本试验通过免疫监测及攻毒试验，测定由小鹅瘟活疫苗免疫后种鹅 后代雏鹅母源抗体的消长规律和对强毒攻击的保护效果。种鹅选一养鹅户饲养种鹅20只，供小鹅瘟疫苗免疫。其中10只隔离饲养，作为 安全性试验组。雏鹅来源于免疫鹅种蛋孵化鹅雏24只，为母源抗体检测组，供采血测定母源抗 体，另选无母源抗体雏鹅15只，隔离饲养，作为对照组。小鹅瘟活疫苗试验用疫苗为小鹅瘟活苗实验室试产品批号为0804，0806，0902。攻毒毒种小鹅瘟病毒SYG61强毒株。对一日龄 鹅毒力，每ml应> 106LD50。
8
抗体检测以常规琼脂免疫扩散试验法检测种鹅及雏鹅血清沉淀抗体。安全性试验组用制备好的活接种10只健康鹅，每只注射10羽份，隔离器内饲养， 观察15天。种鹅免疫种鹅以小鹅瘟活苗注射1羽份，两周后翅下静脉采血分离血清，检测抗 体滴度，同时开始集种蛋孵化。雏鹅分别于1，3，5，7，10，13，16，20日龄，随机经心脏采血5份，分离血清检测母 源抗体。攻毒试验分别于1，8，16日龄每组随机选取雏鹅只，隔离饲养，以小鹅瘟强毒 0. 2mL/只皮下注射攻毒，连续观察20d。安全性试验结果见图2。从图2可以看出，将制品以10倍使用剂量接种80日龄 鹅，在注射部位及全身均无不良反应，证明疫苗安全性良好。血清抗体检测
种母鹅血清抗体种母鹅小鹅瘟疫苗免疫前血清抗体为阴性，免疫后两周血清抗体转 阳性，抗体变化，种母鹅血清抗体滴度检测结果见表1。表1种母鹅血清抗体滴度检测结果
血清号12345免疫前00000免疫二周后24· 024· 025· 024· 023· 0
雏鹅血清母源抗体变化，见表2。
表2雏鹅血清母源抗体滴度平均值
日龄135710131620抗体量23· 223· 223· 022· 822· 021· 821· 22°· 8阳性率1001001001001001008040
攻毒试验结果，见图3。 从疫苗的免疫试验结果来看，小鹅瘟油乳剂疫苗在免疫后第14天即产生较高水 平抗体。从免疫攻毒试验来看，未免疫组全部发病，而免疫组完全健活。因此进一步证明了 该疫苗能有效地控制小鹅瘟病毒的流行和发生。
9
权利要求
一种制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于将接种了小鹅瘟种毒的鹅胚孵化，收集48 144h内死亡鹅胚的胚液，经冷冻真空干燥得到小鹅瘟活疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于所述的小鹅瘟病毒 的毒株为SYG61毒株的26-35代毒或41-50代毒。
3.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于所述的小鹅瘟病毒 的毒株的接种量为将毒种用生理盐水作1:100倍稀释，0. 2ml/胚。
4.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于所述的鹅胚为无小 鹅瘟抗体易感鹅胚。
5.根据权利要求1或4所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于所述鹅胚为 12-14日龄，接种途径为尿囊腔接种，孵化温度为37. 5°C。
6.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于收集48-144h内死 亡鹅胚的胚液，病毒含量应尝107_°ELD5Q/1.0ml，即可用于制苗。
7.根据权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法，其特征在于先将检验合格的胚 液过滤于灭菌容器内，加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加入青霉素、链霉素各1000单 位/ml，充分摇勻，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。
8.权利要求1所述的制备小鹅瘟活疫苗的方法所制得的活疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种小鹅瘟活疫苗的制备方法及其制备的活疫苗。该小鹅瘟活疫苗的制备方法包括小鹅瘟种毒SYG61的筛选，将小鹅瘟病毒种毒用灭菌PBS作1:100稀释，接种12日龄发育良好的鹅胚，每胚绒尿腔0.2ml，将48~144小时死亡的鹅胚，置2~8℃冰箱冷却4~24小时。分别将经冷却的鹅胚侵入于5%新洁尔灭消毒液5~10分钟，擦干后放置无菌室内，先以5%碘酊消毒气室蛋壳部，以无菌手续打开蛋壳，拨除蛋膜及撕破绒尿膜，吸出尿囊液和羊水，加入5%蔗糖脱脂牛奶作稳定剂，同时加入青霉素、链霉素各1000单位/ml，充分摇匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。本发明的小鹅瘟活疫苗的制备方法，步骤少，易操作，所制备出的小鹅瘟活疫苗，产量高、稳定性好、成本低，免疫保护效果好。
文档编号A61P31/20GK101972473SQ201010515949
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者周玉双, 尹松涛, 张建军, 陈清, 顾成钢 申请人:扬州威克生物工程有限公司