专利名称：一种修饰后的短肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种修饰后的短肽及其应用。
背景技术：
各种药物成瘾(包括阿片类物质药物成瘾、可卡因类物质药物成瘾、苯丙胺类物质药物成瘾和大麻类成瘾等)是一种严重的临床疾病，也是一个重大的社会问题。在我国， 滥用海洛因、苯丙胺类等精神药物的人群数量逐年攀升，尤其是阿片类物质成瘾戒除后的极高复吸率成为临床治疗阿片类物质成瘾中目前难以攻克的难题。药物成瘾的学习记忆假说认为药物成瘾是一种畸形记忆，这种畸形记忆的长期性导致了药物成瘾的易复发性， 体现在成瘾者长期戒断药物后仍会在药物本身或者相关线索的诱导下发生复吸。大量研究证明 Ca2+/钙调素依赖的蛋白激酶 n(Ca2+/Calmodulin-d印endent protein kinase II， CaMKII)是参与学习记忆过程的重要分子，提示CaMKII可能参与各种精神药物的成瘾。Autocamtide-2是CaMKII的一种高选择性的肽类底物，合成肽Autocamtide_2 Related Inhibitory Peptide (AIP, ^ ^5^ N-Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Val-Asp-Ala-Leu-OH)是Autocamtide_2的一种非磷酸化的类似物，因此AIP能够高效并且特异性的抑制CaMKII。有些短肽类难以透过血脑屏障进入脑内发挥作用，通过肉豆蔻酰化的多聚精氨酸片段(myristoylated polyarginine peptide, MPAP)修饰后，上述短肽类可以较容易透过血脑屏障进入脑内而发挥其作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种修饰后的短肽。本发明提供的修饰后的短肽，其为将肉豆蔻酰通过共价键连接在氨基酸残基序列的氨基端得到的短肽；所述肉豆蔻酰的结构式为CH3 (CH2) 12C0 ；所述氨基酸残基序列如下所示N， -Ala-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Al a-Val-Asp-Ala-Leu-C，；所述共价连接为将所述肉豆蔻酰的酰基与所述氨基酸残基序列中自氨基末端的第1位Ala的氨基连接形成酰胺键；所述氨基酸残基序列中自氨基末端的第1位Ala为氨基直接连接在β-碳原子上的Ala ；所述氨基酸残基序列的其他氨基酸残基为氨基直接连接在各自α -碳原子上的氨
基酸残基。本发明的另一个目的是提供一种抑制药物成瘾与复吸的产品。本发明提供的抑制药物成瘾与复吸的产品，其活性成分为所述的修饰后的短肽或修饰后的短肽溶液。
所述产品中，所述修饰后的短肽溶液为将所述修饰后的短肽溶解在生理盐水中得到的短肽溶液。所述药物成瘾为阿片类物质药物成瘾、可卡因类物质药物成瘾、苯丙胺类物质药物成瘾和/或大麻类物质药物成瘾。所述阿片类物质为吗啡、可待因、海洛因、哌替啶和/或美沙酮，所述可卡因类物质为可卡因，所述苯丙胺类物质为苯丙胺、甲基苯丙胺和/或摇头丸，所述大麻类物质为活性成分为四氢大麻酚、大麻二酚和/或大麻酚的制剂。阿片类物质包括天然和合成的各种阿片类物质，具体为从天然来源的阿片中提取的有效成分如吗啡，可待因等，以及将其有效成分加工获得的产品如海洛因，还有人工合成具有类似阿片作用的药物如哌替啶，美沙酮等。所述产品为药品。上述短肽在制备抑制药物成瘾与复吸的产品中的应用也是本发明保护的范围。所述应用中，所述药物成瘾为阿片类物质药物成瘾、可卡因类物质药物成瘾、苯丙胺类物质药物成瘾和/或大麻类成瘾。所述阿片类物质为吗啡、可待因、海洛因、哌替啶和/或美沙酮，所述可卡因类物质为可卡因，所述苯丙胺类物质为苯丙胺、甲基苯丙胺和/或摇头丸，所述大麻类物质为活性成分为四氢大麻酚、大麻二酚和/或大麻酚的制剂。所述产品为药物。本发明的实验证明本发明提供的能够透过血脑屏障的MPAI为将AIP的前端用 MPAP进行修饰得到的，本研究的结果证实了 MPAI能够有效抑制吗啡诱导的大鼠自身给药的重建，并且不影响大鼠的活动性。这一结果对于阿片类药物成瘾的理论研究和临床防治具有着重要的意义。
图1为静脉注射MPAI的大鼠和静脉注射生理盐水的大鼠在吗啡自身给药行为的获得，消退和吗啡诱导的自身给药行为重建过程中的有效鼻触和无效鼻触次数图2为静脉注射生理盐水的大鼠与静脉注射MPAI的大鼠在自身给药箱中的活动水平
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、预处理MPAI干扰大鼠自身给药行为的重新建立1、材料体重约300g的约65日龄SD雄性大鼠购自中国军事医学科学院实验动物中心。药品盐酸吗啡注射液(盐酸吗啡注射液为沈阳第一制药厂生产，吗啡浓度为 10mg/ml，使用时根据实验需要用无菌生理盐水将其稀释为所需要的浓度)，MPAI (由吉尔生化(上海)有限公司合成)MPAI为将肉豆蔻酰通过共价键连接在氨基酸残基序列的氨基端得到的短肽，
其中肉豆蔻酰的结构式为CH3(CH2)12CO,氨基酸残基序列如下所示N， -Ala-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Al a-Val-Asp-Ala-Leu-C，；共价连接为将所述肉豆蔻酰的酰基与所述氨基酸残基序列中自氨基末端的第1 位Ala的氨基连接形成酰胺键；所述氨基酸残基序列中自氨基末端的第1位Ala为氨基直接连接在β-碳原子上的Ala ；所述氨基酸残基序列的其他氨基酸残基为氨基直接连接在各自α -碳原子上的氨
基酸残基。大鼠自身给药装置(安来软件科技有限公司)由箱体和控制软件组成，箱内壁上有左右两个鼻触孔，每个鼻触孔内均有鼻触灯，箱内壁上方有一笼灯，插入大鼠颈静脉的插管通过与自身给药箱内的管系统与外面的药物泵连接起来，泵启动会将吗啡送入大鼠颈静脉内，所有的输入输出信号均与软件联系起来，进行实时记录。2、实验将体重约300g的约65日龄SD雄性大鼠分为两组生理盐水组、MAPI组，每组9
P(1)大鼠吗啡自身给药行为的获得(建立)两组在相同的条件下，采用同样的方法实验，具体方法如下有效鼻触定义大鼠接触有效鼻触孔，为有效鼻触(可以通过电脑程序设定自身给药箱内两个鼻触孔的任意一个为有效鼻触孔)；无效鼻触定义大鼠接触无效鼻触孔，为无效鼻触(设定有效鼻触孔后，另一个鼻触孔为无效鼻触孔)；自身给药数大鼠在每次3个小时的训练中通过有效鼻触得到的吗啡次数为每次训练的自身给药数(因为在不应期内的有效鼻触不会使大鼠获得吗啡，因此给药次数总是小于或者等于有效鼻触次数)；每天将18只大鼠放入自身给药箱训练一次，在动物暗周期内进行，每次3个小时。 在非不应期内大鼠伸入有效鼻触孔一次，会得到一次从颈静脉泵入的吗啡溶液(吗啡浓度为lmg/ml)，每次注射剂量设为0. 3mg (吗啡)/kg (大鼠体重)，有效鼻触孔可以设定为左右鼻触孔的任意一个，另一个即为无效鼻触孔。每次将大鼠放入给药箱开始训练时，笼灯亮， 预示着可以给药。当大鼠有效鼻触一次后，笼灯灭，有效鼻触灯亮5s，同时伴随有不连续的声音刺激& (响0.如后停顿0. Is)，这期间颈静脉给药一次，给药后有1 不应期。在不应期里，大鼠伸入有效鼻触孔不会有吗啡的注射和声光刺激。不应期后，笼灯再次亮起，预示可以再次给药。在任何时期无效鼻触均不会引起吗啡注射和声光刺激。如此循环到整个训练时间结束。训练18天后，统计第18天时大鼠的有效鼻触次数、无效鼻触次数和自身给药数如下，结果采用平均值士标准误的方式表示生理盐水组的有效鼻触次数24. 33士 2. 12 (次/3小时)；MPAI组的有效鼻触次数22. 22士 1. 76 (次/3小时)；生理盐水组的无效鼻触次数7. 44士3. 25 (次/3小时)；MPAI组的无效鼻触次数3. 89士 1. 38 (次/3小时)；
生理盐水组的自身给药数22. 67士2. 18 (次/3小时)；MPAI组的自身给药数20. 33士 1. 75 (次/3小时)；可以看出，两组大鼠均获得稳定的自身给药行为，有效鼻触次数和自身给药数远远高于无效鼻触次数。2)大鼠吗啡自身给药行为的消退消退训练的程序与建立时的程序相同，唯一的不同是大鼠在自身给药箱伸入原先的有效鼻触孔后不再得到吗啡注射，消退训练21天后统计第21天的有效鼻触次数和无效鼻触次数如下，结果采用平均值士标准误的方式表示生理盐水组的有效鼻触次数3. 78士 1. 82 (次/3小时)；MPAI组的有效鼻触次数2. 89士 1. 42 (次/3小时)；生理盐水组的无效鼻触次数2. 11 士 1. 40 (次/3小时)；MPAI组的无效鼻触次数3. 11 士 1. 33 (次/3小时)；可以看出，两组大鼠的有效鼻触次数明显降低，与无效鼻触数比较没有显著差异。3)吗啡诱导的大鼠自身给药行为的重新建立在消退训练完成M小时后，两组大鼠均腹腔注射吗啡溶液(5mg吗啡/kg大鼠体重)，注射完后放入自身给药箱中，进行大鼠自身给药行为的重建测试。在腹腔注射吗啡溶液进行大鼠自身给药行为的重新建立之前，颈静脉注射药物预处理45分钟。重建行为的测试时间为3小时，测试的程序和消退训练的程序相同。颈静脉注射预处理方法如下MPAI组颈静脉注射160ug MPAI/只大鼠(此时大鼠体重为380g_425g之间， 150ug MPAI/0. 4ml无菌生理盐水)生理盐水组颈静脉注射0. 4ml无菌生理盐水/只大鼠。实验结果采用平均值士标准误的方法表示A 鼻触实验生理盐水组的有效鼻触次数19. 11 士4. 47 (次/3小时)；MPAI组的有效鼻触次数5. 44士 1. 67 (次/3小时)；生理盐水组的无效鼻触次数1. 44士0. 53 (次/3小时)；MPAI组的无效鼻触次数1. 22士0. 52 (次/3小时)；将结果作图，如图1所示，其中图Ia为MPAI组大鼠和生理盐水组大鼠在自身给药行为的获得，消退和吗啡诱导的自身给药行为重建过程中的有效鼻触次数，图Ib为MPAI组大鼠和生理盐水组大鼠在自身给药行为的获得，消退和吗啡诱导的自身给药行为重建过程中的无效鼻触次数，“*”表示生理盐水组(n = 9)与MPAI组(n = 9)进行组间比较，经方差分析统计P < 0. 05。从图中看出，静脉给予MPAI能够有效降低大鼠在吗啡诱导的自身给药重建过程中的有效鼻触次数(图la)，而对无效鼻触数没有显著性影响(图lb)。方差分析的结果显示两组鼠在自身给药行为的获得和消退时的有效鼻触次数和无效鼻触次数均没有显著性差异(图la，b)。B 静脉注射MPAI组大鼠在自身给药箱中的活动性的测量每个自身给药箱中均装有测量大鼠活动性的八路光路探测系统，可以记录大鼠从建立、消退到重建的过程中每一天在箱内的活动性，活动性采用大鼠在自身给药箱内突破八路光路探测系统的总次数为衡量指标，单位为次。统计上述两组鼠在自身给药行为重建时的活动性，其中MPAI组的大鼠为8只，生理盐水组的大鼠为7只，实验结果采用平均值士标准误的方式表示。结果如图2所示，从图中看出，MPAI组的大鼠活动性为5225. 71 士717. 32 (次/3小时)；生理盐水组的大鼠活动性为5786. 13士566. 01 (次/3小时)；结果表明MPAI组和生理盐水组的大鼠在自身给药行为的重新建立过程中，活动性没有显著差异，即静脉注射MPAI后不影响大鼠的活动性。本研究的结果证实了 MPAI能够有效抑制吗啡诱导的大鼠自身给药行为的重建， 并且不影响大鼠的活动性。
权利要求
1.一种修饰后的短肽，其为将肉豆蔻酰通过共价键连接在氨基酸残基序列的氨基端得到的短肽；所述肉豆蔻酰的结构式为CH3(CH2)12CO,所述氨基酸残基序列如下所示N， -Ala-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Va I-Asp-Ala-Leu-C'；所述共价连接为将所述肉豆蔻酰的酰基与所述氨基酸残基序列中自氨基末端的第1 位Ala的氨基连接形成酰胺键；所述氨基酸残基序列中自氨基末端的第1位Ala为氨基直接连接在β-碳原子上的 Ala ；所述氨基酸残基序列的其他氨基酸残基为氨基直接连接在各自α -碳原子上的氨基酸残基。
2.一种抑制药物成瘾与复吸的产品，其活性成分为权利要求1所述修饰后的短肽或修饰后的短肽溶液。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于所述修饰后的短肽溶液为将所述修饰后的短肽溶解在生理盐水中得到的短肽溶液。
4.根据权利要求2或3所述的产品，其特征在于所述药物成瘾为阿片类物质药物成瘾、可卡因类物质药物成瘾、苯丙胺类物质药物成瘾和/或大麻类物质药物成瘾。
5.根据权利要求2-4中任一所述的产品，其特征在于所述阿片类物质为吗啡、可待因、海洛因、哌替啶和/或美沙酮，所述可卡因类物质为可卡因，所述苯丙胺类物质为苯丙胺、甲基苯丙胺和/或摇头丸，所述大麻类物质为活性成分为四氢大麻酚、大麻二酚和/或大麻酚的制剂。
6.根据权利要求2-5中任一所述的产品，其特征在于所述产品为药品。
7.权利要求1所述的修饰后的短肽在制备抑制药物成瘾与复吸的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述药物成瘾为阿片类物质药物成瘾、可卡因类物质药物成瘾、苯丙胺类物质药物成瘾和/或大麻类物质药物成瘾。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述阿片类物质为吗啡、可待因、海洛因、哌替啶和/或美沙酮，所述可卡因类物质为可卡因，所述苯丙胺类物质为苯丙胺、甲基苯丙胺和/或摇头丸，所述大麻类物质为活性成分为四氢大麻酚、大麻二酚和/或大麻酚的制剂。
10.根据权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于所述产品为药物。
全文摘要
本发明公开了一种修饰后的短肽及其应用。本发明提供的短肽，其为将肉豆蔻酰基团通过共价键连接在氨基酸残基序列的氨基端得到的短肽。本发明还提供了一种抑制药物成瘾与复吸的产品，其活性成分为所述修饰后的短肽。本发明的实验证明MPAI能够有效抑制吗啡诱导的大鼠自身给药的重建，并且不影响大鼠的活动性。这一结果对于阿片类物质(包括天然和合成的各种阿片类物质)成瘾的理论研究和临床防治具有着重要的意义。
文档编号A61P25/00GK102453080SQ20101051981
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者于龙川, 刘卓 申请人:北京大学