专利名称：地锦草提取物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脂肪酸合成酶抑制剂及其应用。
背景技术：
脂肪酸合酶原称脂肪酸合成酶，(EC 2. 3. 1. 85, fatty acid synthase，缩写为 FAS)，动物体内的脂肪酸合酶称为I型FAS，原核生物及植物中的脂肪酸合酶称为II型 FAS。国内外基础研究表明，脂肪酸合酶是可以用于治疗目的的潜在靶位。美国霍普金斯大学Loftus等对小鼠脂肪酸合成酶的研究结果证明，抑制脂肪酸 合成酶可造成丙二酰辅酶A的积累，而后者抑制与进食相关的下丘脑神经肽Y的表达，在不 影响小鼠活动能力的情况下使食欲下降，体重降低。T. Loftus等指出，脂肪酸合成酶可以作 为控制体重潜在的治疗靶位(Loftus. Τ. M. et al. ,2000. Science, 288 (5475) :2379-2381)。 以上结果表明，抑制脂肪酸合成酶的活性，可抑制体内脂肪的合成，而且还能抑制动物的食 欲，限制摄入的脂肪量并消耗体内脂肪。因此，研制和开发脂肪酸合成酶的抑制剂具有重大 的减肥降脂肪的潜力。目前为止，已报道的脂肪酸合酶抑制剂较少，只有合成的C75 (Kuhajda F. P.， PizerE. S.，Li J. N.，et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，97，3450-3454 (2000))，较早发现 ^^^/^^ ^ (cerulenin) (Vance D. ,Goldberg I. ,Mitsuhashi 0. et al. Biochem BiophysRes Commun. 48，649-656 (1972))和绿茶中的酯型儿茶素 EGCG (Wang X.，Tian W. X. Biochem. Biophys. Res. Commun, 288 (5) :1200-1206 (2001))和 ECG(Wang X·，SongK. S. , Guo Q. X.，et al. Biochem Pharmacol, 66 :2039-2047 (2003)) 这些抑制剂所具有的共 同缺点是抑制活性不够高，应用价值受到局限，因此寻找到抑制活性高的脂肪酸合酶抑制 剂具有重要的实际应用价值。本发明描述了地锦草提取物对FAS的抑制作用。地锦草(Euphorbia humifusa Wild.)，异称地锦、奶花草、奶草、铺地红、蜈蚣草、 红丝草、地马桑、红沙草、凉帽草、仙桃草、花被单、地瓣草等，为大戟科植物地锦Euphorbia hum ifusa Wi Ild或斑地锦Euphorbia maculata的干燥全草，一年生草本，含白色乳汁，生 于田野、路旁，我国各地均有分布。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酸合成酶抑制剂及其制备方法。本发明所提供的脂肪酸合酶抑制剂，是以地锦草为原料，用丙酮-水、乙醇-水浸 取得到；或用丙酮-酸水或乙醇-酸水混合溶剂经回流处理提取得到的。其中所述丙酮-水混合溶剂中丙酮的体积百分数可为50-70% ；所述乙醇-水 混合溶剂中乙醇的体积百分数可为50-70% ；所述混合溶剂与地锦草的重量份数比可为 8-30 1 ；所述酸水为无机酸，所述酸的浓度为lmol/L。所述浸取的方法可为在25_70°C下搅拌，或80_100°C下加热回流；所述在25_70°C 下搅拌浸取的时间可为3- 小时；所述80-100°C下加热回流的时间可为2-12小时。
为了提高所述提取物的纯度，所述浸取后还进行过滤和浓缩；所述浓缩的方法为 除去滤液中的丙酮或乙醇，然后用乙酸乙酯从水相中萃取，收集乙酸乙酯提取液，再除去所 述乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，得到地锦草提取物。本发明的另一个目的是提供所述脂肪酸合成酶抑制剂的用途。本发明的所提供的脂肪酸合成酶抑制剂的用途是脂肪酸合成酶抑制剂在制备减 肥药中的应用，以及在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。本发明的所提供的脂肪酸合成酶抑制剂还可以作为食品添加剂、日用化学品添加 剂及保健品添加剂等得到广泛应用。以本发明所提供的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分制备减肥药物以及预防和/ 或治疗癌症的药物也属于本发明的保护范围。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载 体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面 活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂、和着色剂等。用地锦草提取物制备的减肥药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服 液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本发明的脂肪酸合酶抑制剂将在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助 治疗方面，在制备控制体重、防治与肥胖相关的疾病等方面的药物，特别是在制备防治癌症 等方面的药物中发挥巨大作用。同时，本发明的脂肪酸合酶抑制剂在保健品及化妆品德生 产中也会有较大的应用价值。
图1为地锦草最佳溶剂的选择图；图1中图IA是地锦草对脂肪酸合酶的抑制率比较 (乙醇体系)、图IB为不同比例丙酮提取地锦草对FAS的抑制率；
图2为地锦草提取物IC5tl的测定曲线图；图2A是70%丙酮提取地锦草IC5tl的测定； 图2B为地锦草乙醇萃取物IC5tl的测定。
具体实施例方式下述实施例中，所用的脂肪酸合酶均为用常规方法(W.X. Tian et al. , 1985. J. Biol. Chem. ,260(20) :11375-11387 ；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝 脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2) =234-236)自新鲜鸭肝中分离提纯的， 并经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一带。脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法 测定(W. X. Tian et al.，1985. J. Biol. Chem. , 260 (20) :11375-11387 ；田维熙等，1996.不同生 长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12 (2) =234-236) 0实施例1、脂肪酸合酶抑制剂地锦草有效物质的制备
将地锦草粉碎，用下述方法提取有效物。 用乙醇-水混合溶剂(乙醇的体积百分数为50% )与上述粉碎的地锦草按重量份 数比8 1混合，室温25°C下搅拌浸取12小时，用普通滤纸过滤；在同样条件下再浸取12 小时，然后用普通滤纸过滤，将两次滤液合并。在0.09MPa，4(TC (减压)低温蒸发除去乙醇，得到含有效物质的水相，用等体积的石油醚脱去其中的脂类物质，再用等体积乙酸乙酯 萃取3次，合并乙酸乙酯层，如上减压低温蒸发除去有机溶剂，得到浸膏，将该浸膏(真空) 干燥(50°C)得到固态的地锦草提取物，将该固态地锦草提取物称为地锦草提取物A。实施例2、脂肪酸合酶抑制剂地锦草有效物质的制备将地锦草粉碎，用下述方法提取有效物。用丙酮-水混合溶剂(丙酮的体积百分数为70% )与上述粉碎的地锦草按重量 份数比为15 1混合，80°C加热回流3小时，进行普通滤纸的过滤；在同样条件下再加热回 流2小时，进行普通滤纸的过滤，将两次滤液合并。在0.09MPa，35°C (减压)低温蒸发浓 缩，除去其中的有机溶剂，得到有效物质水相，对水相中的有效物进一步浓缩，具体方法为 先用等体积的石油醚分3-4次进行萃取，除去其中的脂类物质，再用乙酸乙酯进行萃取，将 乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (减压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂得到经浓缩的有效 物浸膏，即地锦草提取物。将此浸膏进一步在40-50°C (真空)干燥得到固态的地锦草提取 物，将该固态地锦草提取物称为地锦草提取物B。实施例3、脂肪酸合酶抑制剂地锦草有效物质的制备将地锦草粉碎，用下述方法提取有效物。用乙醇-水混合溶剂(乙醇与水的体积份数比为70 30)与上述粉碎的地锦草按 重量份数比为20 1混合，100°C加热回流3小时，然后进行普通滤纸的过滤，在同样条件下 再加热回流2小时，然后进行普通滤纸的过滤，将两次滤液合并。在0.09MPa，4(TC (减压)低 温蒸发浓缩，除去其中的有机溶剂，得到含有效物质的水相，即地锦草提取物。对水相中的有 效物进一步浓缩，具体方法为用乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯提取液在0.09MPa，4(TC (减 压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂得到经浓缩的有效物浸膏，将此浸膏在40°C进一步(真空) 干燥得到固态的地锦草提取物，将该固态地锦草提取物称为地锦草提取物C。实施例4、脂肪酸合酶抑制剂地锦草有效物质的制备将地锦草粉碎，用下述方法提取有效物。用丙酮-酸水混合溶剂(丙酮的体积百分数为70%，酸的浓度为lmol/L)与上 述粉碎的地锦草按重量份数比为15 1混合，100°C加热回流3小时，进行普通滤纸的过 滤；在同样条件下再加热回流2小时，进行普通滤纸的过滤，将两次滤液合并。在0. 09MPa, 35°C (减压)低温蒸发浓缩，除去其中的有机溶剂，得到有效物质水相，对水相中的有效物 进一步浓缩，具体方法为先用等体积的石油醚分3-4次进行萃取，除去其中的脂类物质， 再用乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (减压)低温蒸发浓缩，除去 有机溶剂得到经浓缩的有效物浸膏，即地锦草提取物。将此浸膏进一步在40-50°C (真空) 干燥得到固态的地锦草提取物，将该固态地锦草提取物称为地锦草提取物D。实施例5、脂肪酸合酶抑制剂地锦草有效物质的制备将地锦草粉碎，用下述方法提取有效物。用乙醇-酸水混合溶剂(乙醇与水的体积份数比为70 30，酸的浓度为lmol/L) 与上述粉碎的地锦草按重量份数比为20 1混合，100°C加热回流3小时，然后进行普通滤 纸的过滤，在同样条件下再加热回流2小时，然后进行普通滤纸的过滤，将两次滤液合并。 在0.09MPa，40°C (减压)低温蒸发浓缩，除去其中的有机溶剂，得到含有效物质的水相，即 地锦草提取物。对水相中的有效物进一步浓缩，具体方法为用乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯提取液在0.09MPa，40°C (减压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂得到经浓缩的有效物浸 膏，将此浸膏在40°C进一步(真空)干燥得到固态的地锦草提取物，将该固态地锦草提取物 称为地锦草提取物E。实施例6、对脂肪酸合酶抑制活性的检测37°C下，在2毫升石英比色皿中加入该酶底物0. 2mM乙酰辅酶A溶液25微升， 0. 4mM,丙二酸单酰辅酶A溶液50微升和1. 3mM NADPH溶液50微升，再加入0. 1M，pH 7. 0 磷酸盐缓冲液1. 85毫升及FAS溶液30微升混勻，启动酶促反应。用分光光度计监测单位 时间内340nm波长处吸光值A的变化，以(ΔΑ/min)来表示FAS的活力。地锦草药材粉碎， 过40目筛，加入溶剂(1 20)，室温搅拌4小时后，离心分离上清液，稀释十倍后测定提取 液对FAS的抑制率。在一定浓度地锦草提取物存在下，FAS全酶反应的活力下降，当其活力 下降一半时所需槭叶提取物的浓度即IC5tl值，用该数值表示地锦草提取物对FAS的抑制能 力，上述测活体系中FAS的终浓度为7微克/毫升。测定结果表明在上述测活条件下，地锦草70%丙酮溶液提取液对FAS的抑制率 最高，达到59. 01%，测活体系中原药浓度为37. 5(yg/ml)(见图1A-B)。地锦草提取物的 IC50分别为11-23微克/毫升(见图2A-B)。实施例7、肿瘤细胞实验细胞培养将肝癌BEL-7402、乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3M、宫颈癌Hela、食道 癌CAES-17五种癌细胞株(均购自医科院药物研究所)培养于含10%小牛血清、青霉素 (100yg/ml)和链霉素(100yg/ml)的RPMI-1640培养液中，在适当湿度，含5% CO2的培 养箱中37°C单层贴壁传代培养。收集对数生长期的五种肿瘤细胞，分别接种于96孔板中，2 X IO4个/孔，贴壁培养 24小时换成分别含有按照实施例1、实施例2和实施例3方法获得的地锦草提取物的培养 液，按不同地锦草提取物浓度分成7组(设0、5、10、20、40、60、80 μ g/ml共7个实验组，每 个浓度设3个复孔，实验结果取平均值)。继续培养M小时，换成不含提取物的培养液，同时加入20 μ 1 MTT (四甲基偶氮唑 蓝，5mg/ml)继续培养4小时。弃上清液，每孔加入200 μ 1 二甲基亚砜(DMSO)(对照组加 入等量培养液和二甲基亚砜)，水平震荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪测定吸光 值(A)，波长570nm，并按下述公式计算提取物对癌细胞生长的抑制作用，结果如表1、表2、 表3、表4、表5所示，细胞生长抑制率(％ ) = (1-实验组A57tl/对照组A57tl) X 100%表1不同浓度地锦草槭提取物(作用M小时)对肿瘤细胞生长的抑制率(％ )
权利要求
1.地锦草提取物在制备脂肪酸合成酶抑制剂中的应用，所述脂肪酸合成酶抑制剂是以 地锦草为原料，用丙酮-水、乙醇-水浸取得到；或用丙酮-酸水或乙醇-酸水混合溶剂经 回流处理提取得到的；其中所述丙酮-水混合溶剂中丙酮的体积百分数可为50-70% ；所述乙醇-水混合溶 剂中乙醇的体积百分数可为50-70%;所述混合溶剂与地锦草的重量份数比可为8-30 1 ； 所述酸水为无机酸，所述酸的浓度为lmol/L。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述浸取的方法可为在25-70°C下搅拌， 或80-100°C下加热回流；所述在25-70°C下搅拌浸取的时间可为3- 小时；所述80-100°C 下加热回流的时间可为2-12小时。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述浓缩的方法为除去滤液中的丙酮或 乙醇，然后用乙酸乙酯从水相中萃取，收集乙酸乙酯提取液，再除去所述乙酸乙酯提取液中 的乙酸乙酯，得到地锦草提取物。
4.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂在制备减肥药中的应用。
5.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂在作为食品添加剂中的应用。
6.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂在作为保健品添加剂中的应用。
7.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂在日用化学品添加剂中的应用。
8.一种预防和/或治疗癌症的药物，其活性成分为权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑 制剂。
9.一种减肥药，其活性成分为权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂。
全文摘要
本发明是一种地锦草提取物的应用。本发明公开了一种脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法与应用，其目的是提供一种脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法与其在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗中的应用。该脂肪酸合酶抑制剂，是以地锦草为原料，用丙酮-水或乙醇-水混合溶剂浸取得到的。本发明所提供的以地锦草为原料制备的脂肪酸合酶抑制剂，具有较高的脂肪酸合酶抑制活性，本发明将在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗方面，特别是在制备防治癌症等方面的药物中发挥巨大作用。
文档编号A61K8/97GK102119953SQ20101054610
公开日2011年7月13日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者宋学英, 张英侠, 杨华, 田维熙, 赵文华, 陈月 申请人:首都医科大学