专利名称：一种map疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物疫苗，尤其涉及一种MAP疫苗及其应用。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，而肿瘤的浸润和转移是肿瘤患者死亡 的主要原因。传统的手术、放、化疗的疗效又不尽人意，随着对肿瘤生物学行为的深入研究 及生物技术的迅速发展，以肿瘤免疫治疗为主的肿瘤的生物治疗已成为肿瘤治疗的第四种 模式，而肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗的重要方法。大量研究证明，利用肿瘤疫苗有效激活特异 性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，是实现肿瘤主动免疫治疗的关键。 但目前发现的肿瘤相关抗原大多具有组织特异性，如PSA只针对前列腺癌、AFP只针对肝癌 等，以这些抗原来进行免疫治疗，只能对相应的肿瘤起作用，限制了以这些抗原为靶标的肿 瘤疫苗的广泛应用。肿瘤抗原可以诱导机体的免疫应答，是肿瘤免疫治疗中疫苗研发的分 子基础，寻找肿瘤特异性的共有抗原成为肿瘤免疫治疗关键问题。⑶8+T细胞所识别的靶抗原需先经抗原递呈后，以“抗原肽-MHC I类分子”复合物 的形式呈现于抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)或靶细胞表面，才能被⑶8+T 细胞所识别。相应的与主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC) I类分子结合的抗原肽即为CTL表位，随着对免疫应答分子机制的深入研究，人们已意识到 机体的免疫细胞并不是一一对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各 种各样抗原分子的抗原表位(印itope)，蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。 CTL表位作为抗肿瘤的新一代多肽疫苗，尤其是负载CTL表位的树突状细胞疫苗，被认为是 最有希望的新一代肿瘤免疫治疗策略，已在临床实验中显示出一定的疗效。理想的肿瘤共有抗原(universaltumor-associated antigen)应符合(1)在绝 大多数肿瘤组织中表达从而可以广泛应用；(2)只表达于肿瘤细胞以避免自身免疫反应； (3)不表达于正常成熟组织以避免免疫耐受；(4)在肿瘤的发生发展过程中具有不可替代 的作用，以避免抗原缺失；(5)能诱导足够强度的免疫反应并导致肿瘤消退；(6)同时包含 有MHC I和MHC II类分子，从而可诱导⑶4+和⑶8+T细胞反应。近年来的研究表明，人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)可作为共有抗原靶标设计肿瘤疫苗。其原因如下l、hTERT为端粒酶活性的限速成分，是癌细胞永生化的必要途径，在维持肿瘤继续 分裂、增殖和生存中发挥重要作用。以hTERT制备疫苗，即便出现免疫逃逸而使hTERT表达 下调，此变化本身就起到抑制肿瘤生长、转移的作用，同时也避免了抗原缺失的问题。2、hTERT在85%以上的恶性肿瘤及其癌前病变中过度表达，其异常表达或激活是 肿瘤形成的重要原因之一，目前已筛选出hTERT的CTL表位包含有HLA(人类主要组织相容 性抗原)_A2、A3或A24限制性，而大于75 %的人群是HLA-A2、A3、A24限制性。因此如以 hTERT为靶标的肿瘤疫苗，将具有更广泛的应用人群。3、hTERT在人体内少数正常的细胞组织(如某些上皮细胞、胸腺等)内有表达。理论上，针对这类自身蛋白的免疫治疗有可能产生hTERT阳性正常组织的自身免疫反应或 特异性CTL的免疫耐受。但目前相关实验观察到的自身免疫反应或CTL自体耐受很少或没有。4、hTERT同时包含有MHC II和MHC I类分子，并可诱导CD4+和CD8+T细胞反应。5、有研究发现，hTERT的高表达与肿瘤的不良预后、浸润转移均密切相关[Yu ST, et al. Int J Oncol 2009 ；35 (2) :329_36·]。6、发现带有hTERT全长基因的腺病毒载体负载DC，以及带有hTERT全长基因和隐 性表位的颗粒疫苗，在体内外均可以诱导产生hTERT特异性的细胞毒T淋巴细胞(CTLs)， 对hTERT阳性的胃癌、结肠癌等多种癌细胞具有一定的杀伤效应，而对表达hTERT阴性的淋 巴细胞和 DC 不具有杀伤效应[1、Chen L. JPathol. 2009 ；217 685 ；2、Guo H, et al. BBRC, 2007 ；357 1090]。由此可见，hTERT可以作为一种广谱的肿瘤相关抗原用于恶性肿瘤的免 疫治疗，且具有特异、有效、安全的特点。过去几年中，已经筛选出的hTERT表位包括MHC-I类分子等位基因的 HLA-A2、A3等限制性的显性(高亲和力)表位如P865 (RLVDDFLLV)等；隐性表位如 P572 (RLFFYRKSV)等；MHC- II 类分子等位基因限制性表位 L766 (LTDLQPYMRQFVAHL)和 R672(RPGLLGASVLGLDDI)等[Vonderheide RH. Prospects and challenges of building a cancer vaccine targeting telomerase. Biochimie, 2008 ；90(1) :173_180·]ο 针对这 些表位的研究发现最高亲和力的CTL表位如Ρ530等缺乏免疫原性，无法激发相应CTL ； 低亲和力(隐性)表位如P572(HLA-A2+)，改良为异形肽(heteroclitical peptide)后， 可增强其免疫原性及与MHC I类分子的结合力，却不会破坏其抗原特异性[Scardino A， Gross DA, Alves P, Schultze JL, Graff-Dubois S, Faure 0, Tourdot S, Chouaib S, Nadler LM,Lemonnier FA,Vonderheide RH,Cardoso AA,Kosmatopoulos K. HER-2/neu and hTERT Cryptic Epitopes as Novel Targets for Broad Spectrum Tumor Immunotherapy. JImmunol, 2002,168(11) =5900-5906.]；也已证实异形肽P572Y(第一位氨基酸用酪氨酸 替代)可激活特异性CTL,杀伤hTERT+、HLA-A2+的肿瘤细胞[Guo H，etal. BBRC, 2007 ； 357(4) :1090-1095]。目前处于研究阶段的肿瘤疫苗传递方式分别以细胞、蛋白质、多肽、载体为基础。 多肽疫苗因其具有生产、储存、传递方便，化学性稳定，无传染性、无遗传、整合或重组风险 等优点而备受关注。当前的研究也发现，与hTERT全基因序列腺病毒负载DC疫苗相比，多 肽疫苗没有腺病毒载体的参与，不必考虑载体及其整合的安全性，也不必考虑全长蛋白中 某些非优势表位或病理表位的毒副作用；而且，抗原肽长度仅8-15个左右的氨基酸序列， 体外可以合成，临床应用前景更广阔。但是，多肽疫苗常有其不足之处最大的问题在于一 个多肽疫苗只能代表一个CTL表位，分子量小，结构单一，免疫原性较弱，在体内容易降解。以往为解决这一弊端，研究者采用耦联蛋白载体、添加佐剂、修饰多肽等方法提高 其免疫原性，最终多抗原肽(multiple antigen peptides, MAP)的设计方案脱颖而出。多聚抗原肽(multipleantigen peptides,MAPs)是 1988 年由美国的 Tam教授首 先提出并应用的。它是一种呈放射分支状的聚合肽大分子物质，由一个分支状的肽核和以 共价键连接的表面活性肽组成，与传统的连接在线形串联氨基酸骨架上的肽复合体不同。 MAPs通过肽核远端赖氨酸的α，ε位ΝΗ2聚合同型或不同型的合成抗原肽，然后再以肽核的近端吸附到不同免疫介质上，发挥靶向和信息传递作用。其聚赖氨酸核心构成一种十 分紧密有序的树状结构，它在加强了抗原表位肽链结构特异性的同时，还增大其分子质量， 不仅很好的模拟了天然表位的空间构象，而且还不需要再耦联载体蛋白就能诱发较强的免 疫反应；同时，其稳定的二级结构不易反转，故降解速度减缓，延长抗原刺激时间，获得更好 的杀伤活性。多聚抗原肽技术在各种生物技术和生物化学方面的应用日益增多，如生物医 学诊断试剂、仿蛋白质构象抗癌制剂及抗病毒制剂、疫苗、药物基因的传输载体等。作为一 种免疫原激发机体产生抗体，多聚抗原肽被运用于针对某些细菌，如大肠杆菌、弓形虫、霍 乱弧菌、绿脓杆菌、链球菌等；病毒，如乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病 毒、HIV病毒等；寄生虫，如伯氏疟原虫、曼氏血吸虫、约氏疟原虫、恶性疟原虫等抗体产生； 以及其他一些人、动物的相关蛋白研究。而基于hTERT的CTL表位的MAP疫苗未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种MAP疫苗，其包含如SEQ ID NO :1_5所示的多肽序列。所述MAP疫苗的多肽序列如SEQ ID N0:l_3所示。所述MAP疫苗的多肽序列如SEQ ID NO :4_5所示。所述MAP疫苗是基于人端粒酶逆转录酶的T细胞表位MAP疫苗。所述的MAP疫苗，SEQ ID NO 1所示的多肽选自HLA-A2限制性显性表位P540。所述的MAP疫苗，SEQ ID NO 2所示的多肽选自HLA-A2限制性显性表位P865。所述的MAP疫苗，SEQ ID NO 3所示的多肽选自HLA-A2限制性显性表位P572Y。所述的MAP疫苗，，SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示的多肽选自HLA-A2限制性 显性表位P988Y和HLA-A2限制性显性表位P38。所述的MAP疫苗可以用于制备抗肿瘤制剂。本发明还提供一种抗肿瘤制剂，其包含上述的MAP疫苗。本发明提供的MAP疫苗，抗肿瘤活性明显，且对于仅表达HLA-A2+或hTERT+的肿瘤 细胞，无杀伤效应；MAP疫苗诱导的CTL反应对自体淋巴细胞及DC无任何杀伤的副作用，使 用安全。MAP疫苗所激活的特异性T淋巴细胞数量明显增多。本发明针对的是在大于75%的人群中表达的HLA-A2限制性。其中HLA-A2表位序 列为 P540、P865、P572Y、P988Y、P38 等序列。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图认、让、1(分别是？540、？865、？572￥所设计的4分支多聚抗原肽结构图；图2是肽P540的纯度分析图谱；
图3是肽P540-MAP4的纯度分析图谱；图4是肽P865的纯度分析图谱；图5是肽P865-MAP4的纯度分析图谱；图6是肽P572Y的纯度分析图谱；图7是肽P572Y-MAP4的纯度分析图谱；
图8是肽P540的分子量鉴定图谱；图9是肽P540-MAP4的分子量鉴定图谱；图10是肽P865的分子量鉴定图谱；图11是肽P865-MAP4的分子量鉴定图谱；图12是肽P572Y的分子量鉴定图谱；图13是肽P572Y-MAP4的分子量鉴定图谱；图14A-14G是人hTERT特异性CTL活性检测图；(图例中，阴性肽为来源于流感 病毒的HLA-A2限制性表位NYKHCFEI，单肽1表示P540 ；MAPI表示MAP4-P540 ；单肽2表示 P865 ；MAP2 表示 MAP4-P865 ；单肽 3 表示 P572Y ；MAP3 表示 MAP4-P572Y ；)图15A-15B是人hTERT优势T细胞表位MAP疫苗诱导的CTL反应图；(图例中， 阴性肽为来源于流感病毒的HLA-A2限制性表位NYKHCFEI，单肽1表示P540 ；MAPI表 示 MAP4-P540 ；单肽 2 表示 P865 ；MAP2 表示 MAP4-P865 ；单肽 3 表示 P572Y ；MAP3 表示 MAP4-P572Y ；)图16是人ELISP0T检测IFN- γ的分泌图；(阴性肽为来源于流感病毒的HLA-A2 限制性表位NYKHCFEI，)图17A-17G是小鼠体内hTERT特异性CTL活性检测图；(图例中，阴性肽为来源于 流感病毒的HLA-A2限制性表位NYKHCFEI，单肽1表示P540 ；MAPI表示MAP4-P540 ；单肽2 表示 P865 ；MAP2 表示 MAP4-P865 ；单肽 3 表示 P572Y ；MAP3 表示 MAP4-P572Y ；)图18A-18B是小鼠体内hTERT MAP疫苗诱导的hTERT特异性CTL反应图；(图 例中，阴性肽为来源于流感病毒的HLA-A2限制性表位NYKHCFEI，单肽1表示P540 ；MAPI 表示MAP4-P540 ；单肽2表示P865 ；MAP2表示MAP4-P865 ；单肽3表示P572Y ；MAP3表示 MAP4-P572Y ；)图19是小鼠体内ELISP0T检测IFN- γ的分泌图。(阴性肽为来源于流感病毒的 HLA-A2限制性表位NYKHCFEI)
具体实施例方式试剂RPMI-1640 培养基购于 Hyclone 公司胎牛血清购于Hyclone公司培养小鼠骨髓来源DC所用重组小鼠单核巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)及重 组小鼠白介素4 (rmIL-4)(购于R&D System, Inc.，USA)，在培养小鼠骨髓来源DC中所需浓 度分别为 rmGM-CSF 500U/ml、rmIL_41000U/ml。培养人外周血来源DC所用重组人单核巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重组 人白介素4(rhIL-4)(均购于R&D System, Inc.，USA)，在培养人外周血来源DC所需浓度分 别为 rhGM-CSF 800U/ml、rhIL_41200U/ml。刺激DC 成熟的肿瘤坏死因子(TNF)(购于 R&D System, Inc.，USA) 1000U/ml。标准51Cr释放实验所用Cr购于美国PE公司。ELISP0T试剂盒购于深圳达科为生物技术有限公司。源于hTERT 的 P540、P865、P572Y 及其对应的 Ρ540-ΜΑΡ4、Ρ865-ΜΑΡ4、Ρ572Υ_ΜΑΡ4，由上海强耀生物科技有限公司代为完成。实施例IhTERT优势T细胞表位MAP疫苗的设计由于大于75%的人群是HLA-A2限制性，本申请中拟选用A2限制性表位 P540(ILAKFLHWL, Vonderheide RH，Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity 1999 ; 10 :673_679)-SEQ IDNO :1、P865 (RLVDDFLLV， Minev B, Hipp J, Firat H, Schmidt JD, Langlade-Demoyen P, Zanetti M. Cytotoxic T cell immunity against telomerase reverse transcriptase in humans. Proc Natl Acad Sci USA 2000 ；97 :4796_4801)-SEQID NO :2、隐性表位异形肽 P572Y (YLFFYRKSV，Scardino A, Gross DA, Alves P, Schultze JL, Graff-Dubois S, Faure 0, Tourdot S, Chouaib S, Nadler LM,Lemonnier FA,Vonderheide RH,Cardoso AA,Kosmatopoulos K. HER-2/neu and hTERT cryptic epitopes as novel targets for broad spectrum tumor immunotherapy. J. Immunol 2002 ； 168 =5900-5906)-SEQ ID NO :3设计其四分支抗原肽进行抗肿瘤活性研 究。P540、P865、P572Y所设计的4分支多聚抗原肽结构如图1A-1C所示。实施例2hTERT优势T细胞表位MAP疫苗的合成1. MAP肽的合成及纯化(由上海强耀生物科技有限公司代为完成)采用标准的 Fmoc方法，精氨酸采用两次偶联；采用高压液相色谱仪(RP-HPLC)法，对纯化后多肽的分子 量测定在API2000型质谱仪上进行；纯化后的收集液在常温下低压蒸发至完全干燥或蒸发 至l_2ml后，用50ml乙醚沉淀，玻砂漏斗收集沉淀，真空干燥，所得多肽纯品-20°C储存备用。2. MAP肽的鉴定采用反相高压液相色谱仪(RP-HPLC)鉴定其纯度(如图2_7所 示)，采用液相色谱/质谱技术(LC/MS)鉴定其分子量(如图8-13所示)。实施例3人hTERT优势T细胞表位MAP疫苗体外抗肿瘤活性1.人外周血来源树突状细胞的制备通过FicolI-Hypaque比重梯度离心法将 HLA-A2阳性健康献血者(由第三军医大学西南医院输血科提供)外周血的单核细胞分离出 来，以含10%胎牛血清(购于Hyclone公司)的RPMI-1640培养基(购于Hyclone公司)重 悬细胞被置于37°C孵箱中孵育2小时后，未贴壁细胞被收集冻存以作之后效应细胞制备之 用。贴壁的细胞继续培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并在其中加入重组人 单核巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重组人白介素4(rhIL-4)(均购于R&D System, Inc.，USA)，使其终浓度分别为800U/ml、1200U/ml。在细胞培养的第3、5、7天分别给予半量 换液，同时补充rhGM-CSF、rhIL-4。在培养的第8天，在培养基中加入肿瘤坏死因子(TNF) (购于R&D System, Inc.，USA) 1000U/ml，促进其成熟。培养第9天收集成熟的树突细胞。2.效应细胞的制备从HLA-A2阳性健康献血者(由第三军医大学西南医院输血 科提供)的PBMC细胞中分离DC细胞，分别加入30 μ g/ml的hTERT抗原肽，同时负载hTERT 全长基因腺病毒(由第三军医大学西南医院消化病研究所陈陵博士构建，Chen L，Liang GP, Tang XD,Chen T，Cai YG,Fang DC,Yu ST,Luo YH,Yang SM(2006)In vitro anti-tumor immune response induced by dendritic cells transfected with hTERT recombinant denovirus)DC，之后加入冻存的人外周血淋巴细胞以制备效应细胞，效应细胞需连续刺激 三次，每周一次。
3.靶细胞的准备ΚΑΤ0-ΙΙΙ 胃癌细胞(hTERT+，HLA-A2+)、！fepG2肝癌细胞(hTERT+， HLA-A2_)、转染了 HLA-A2 基因的!fepG2 肝癌细胞 0fepG2/HLA_A2) (hTERT+，HLA-A2+)、U20S 骨肉瘤细胞(hTERr，HLA-A2+)、SW480结肠癌细胞(hTERT+，HLA-A2+)、MCF-7乳腺癌细胞 (hTERT+，HLA-A2+)(以上细胞均由第三军医大学西南医院消化病研究所提供)，均重悬于含 10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37°C，5% CO2孵箱中孵育。4. hTERT特异性CTL活性检测将效应细胞按照不同效靶比(E/T) =80 1、 40 1,20 UlO 1，加入到靶细胞平板中，培养孵育，最大释放组和最小释放组分别由 100 μ 1靶细胞和100 μ 1 2Ν HCLUOO μ 1靶细胞和100 μ 1 RPMI640培养基组成。之后用 Y计数器分别测定各自51Cr释放量。51Cr释放率(％ )=(实验组Cpm平均值-最小释放 cpm平均值)/ (最大释放cpm平均值-最小释放cpm平均值)X 100 %。采用51Cr释放法检 测CTL活性。实验结果请参考图14A-14G:由标准51Cr释放实验结果可以看出，对于HLA-A2+ 且 hTERT+ 的肿瘤细胞，如 ΚΑΤ0-ΙΙΙ、SW480、MCF-7、H印G2/HLA-A2、U20S/hTERT+ 细胞，基于 hTERT的CTL表位的单肽疫苗、MAP4疫苗及腺病毒载体疫苗均有抗肿瘤活性，其中腺病毒载 体疫苗活性最高，相较于单肽疫苗，与之相对应的MAP4疫苗的抗肿瘤活性明显提高18%以 上。而对于仅表达HLA-A2+或hTERT+的肿瘤细胞，如H印G2、U20S细胞无杀伤效应。5.人hTERT优势T细胞表位MAP疫苗诱导的CTL反应对自体淋巴细胞及DC的毒 副作用检测由于hTERT也少量表达于人体内少数正常的细胞组织(如某些上皮细胞、激活的 淋巴细胞、胸腺等)，故本申请也采取以上同样的方法检测了人hTERT优势T细胞表位MAP 疫苗诱导的CTL反应对自体淋巴细胞及DC有无杀伤效应，具体结果请参照图15A-15B 由 标准51Cr释放实验结果可以看出，人hTERT优势T细胞表位MAP疫苗诱导的CTL反应对自 体淋巴细胞及DC无任何杀伤的副作用。6. ELISP0T检测IFN- γ的分泌采用购于深圳达科为生物科技技术有限公司的检 测人IFN-r试剂盒，严格按照说明书进行，以检测对hTERT抗原产生特异性反应的特异性T 淋巴细胞数量。检测结果请参照图16 从图中可以看出，含hTERT全长序列的腺病毒所激活的特 异性T淋巴细胞数量最多，相较于单肽疫苗，与之相对应的MAP4疫苗所激活的特异性T淋 巴细胞数量明显增多，这与标准51Cr释放实验结果一致。实施例4人hTERT优势T细胞表位MAP疫苗体内抗肿瘤活性1. C57BL/6-Tg(HLA-A2+)小鼠骨髓源性DC的分离培养(mDC)分离 C57BL/6-Tg(HLA-A2+)小鼠(购于第三军医大学实验动物中心)的股骨与胫骨，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基冲洗骨髓腔，离心获得的细胞用红细胞裂解液(Sigma， St. Louis, MO, USA)裂解，再反复用不含血清的RPMI-1640培养基清洗两次之后，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，被加入重组小鼠单核巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF)及重组小鼠白介素4 (rmIL-4)(购于R&D System, Inc.，USA)使其终浓度分别 为500U/ml、1000U/ml。在细胞培养的第3、5、7天分别给予半量换液，同时补充rmGM-CSF、 rmIL-4。在培养的第8天，在培养基中加入肿瘤坏死因子(TNF)(购于R&D System, Inc., USA) 1000U/ml，促进其成熟。培养第9天收集成熟的小鼠骨髓来源树突细胞。
2.效应细胞的制备以hTERT MAP疫苗负载mDC，同时以载有hTERT全长基因的 腺病毒感染mDC，然后免疫C57BL/6-Tg小鼠，每周一次，连续三次，在最后一次免疫后的第5 天取C57BL/6-Tg小鼠脾淋巴细胞与人hTERT优势T细胞表位MAP肽共孵育后，制备效应细 胞。3.靶细胞的准备同前。4. hTERT特异性CTL活性检测采用标准51Cr释放法，具体方法同前。实验结果请参照图17A-17G 由标准51Cr释放实验结果可以看出，在小鼠体内对于 HLA-A2+ 且 hTERT+ 的肿瘤细胞，如 KATO-III、SW480、MCF_7、H印G2/HLA-A2、U20S/hTERT+ 细 胞，基于hTERT的CTL表位的单肽疫苗、MAP4疫苗及腺病毒载体疫苗对均有抗肿瘤活性，其 中腺病毒载体疫苗活性最高，相较于单肽疫苗，与之相对应的MAP4疫苗的抗肿瘤活性明显 提高20%以上。而对于仅表达HLA-A2+或hTERT+的肿瘤细胞，如H印G2、U20S细胞无杀伤 效应。5. hTERT MAP疫苗诱导的hTERT特异性CTL对自体淋巴细胞和DC免疫杀伤效应检 测小鼠体内hTERT MAP疫苗诱导的hTERT特异性CTL对自体淋巴细胞和DC免疫杀 伤效应结果请参照图18A-18B 由标准51Cr释放实验结果可以看出，在小鼠体内hTERT MAP 疫苗诱导的hTERT特异性CTL对自体淋巴细胞和DC无免疫杀伤效应。6. ELISP0T检测IFN- γ的分泌采用购于深圳达科为生物科技技术有限公司的检 测小鼠IFN-r试剂盒，严格按照说明书进行，以检测对hTERT抗原产生特异性反应的特异性 T淋巴细胞数量。检测结果请参照图20，从图中可以看出，在小鼠体内含hTERT全长序列的腺病毒 所激活的特异性T淋巴细胞数量最多，相较于单肽疫苗，与之相对应的MAP4疫苗所激活的 特异性T淋巴细胞数量明显增多，这与标准51Cr释放实验结果与体外结果一致。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术 领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明 的保护范围当视权利要求所界定者为准。
权利要求
一种MAP疫苗，其特征在于，其包含如SEQ ID NO1 5所示的多肽序列。
2.根据权利要求1所述的MAP疫苗，其特征在于，所述MAP疫苗的多肽序列如SEQID NO 1-3 所示。
3.根据权利要求1所述的MAP疫苗，其特征在于，所述MAP疫苗的多肽序列如SEQID NO 4-5 所示。
4.根据权利要求1或2或3所述的MAP疫苗，其特征在于，所述MAP疫苗是基于人端粒 酶逆转录酶的T细胞表位MAP疫苗。
5.根据权利要求4所述的MAP疫苗，其特征在于，SEQID NO 1所示的多肽选自HLA-A2 限制性显性表位P540。
6.根据权利要求4所述的MAP疫苗，其特征在于，SEQID NO :2所示的多肽选自HLA-A2 限制性显性表位P865。
7.根据权利要求4所述的MAP疫苗，其特征在于，SEQID NO :3所示的多肽选自HLA-A2 限制性显性表位P572Y。
8.根据权利要求3所述的MAP疫苗，其特征在于，SEQID NO 4和SEQ IDNO 5所示的 多肽选自HLA-A2限制性显性表位P988Y和HLA-A2限制性显性表位P38。
9.权利要求1或2或3所述的MAP疫苗在制备抗肿瘤制剂中的应用。
10.一种抗肿瘤制剂，其特征在于，包含权利要求1或2或3所述的MAP疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种MAP疫苗及其应用，其多肽序列如SEQ ID NO1-3所示。所述MAP疫苗是基于人端粒酶逆转录酶的T细胞表位MAP疫苗。SEQ IDNO1-3所示的多肽分别选自HLA-A2限制性显性表位P540、P865、隐性表位异形肽P572Y。本发明还提供一种抗肿瘤制剂，其包含上述的MAP疫苗。本发明提供的MAP疫苗，抗肿瘤活性明显，且对于仅表达HLA-A2+或hTERT+的肿瘤细胞，无杀伤效应；MAP疫苗诱导的CTL反应对自体淋巴细胞及DC无任何杀伤的副作用，使用安全。MAP疫苗所激活的特异性T淋巴细胞数量明显增多。
文档编号A61P35/00GK101991843SQ20101055388
公开日2011年3月30日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者周圆圆, 周媛, 宁琳红, 廖忠莉, 张朋彬, 杨仕明, 杨武晨, 柏健鹰, 汤旭东, 赵晓晏, 郭红 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院