专利名称：壳寡糖单一化合物在免疫增强药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及增强免疫的药物，具体地说是壳寡糖单一化合物在制备免疫增强药物中的应用，更进一步说是两种壳寡糖单一化合物在制备治疗与免疫相关疾病的药物或保健食品中的应用。
背景技术：
众所周知，免疫系统是人体不可缺少的防御系统，具有识别“自身”和“异己”及排斥“异己”的免疫应答功能，它可保护机体抗御病原体，免受有害物及癌变细胞等致病因子的侵害。同时清除损伤和衰老细胞，保持自身稳定，与神经内分泌系统共同维护，相互调节机体生理平衡。高等动物的免疫系统可分为天生免疫系统与获得性免疫系统。中性粒细胞 (polymorphonuclear neutrophil, PMN)和巨噬细胞一起作为专职性吞噬细胞在高等动物的天生免疫中发挥了重要作用。PMN是人体和哺乳动物抵御外来微生物入侵的第一道防线，能够快速激活并迁移到炎症部位，通过释放炎症介质和吞噬作用消灭感染的病原微生物，是非特异性免疫和体液免疫的主要效应细胞。但是中性粒细胞的过度激活及其凋亡障碍使其同时具备了造成机体组织损伤的功能，严重时可导致失控性炎性反应，如全身炎症综合症(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，代偿性抗炎反应综合症 (compensate anti~inf lammation response syndrome, CARS)，甚至造成多器官功能障石导 (multiple organ dysfunction syndrome, MODS)等，因而中性粒细胞的功能必须被严格调节，以使中性粒细胞既可以有效地清除病原体，同时又不会造成病变部位的进一步损伤。由于中性粒细胞相比巨噬细胞难分离、没有成熟的可传代的细胞系，因此中性粒细胞一般无法传代培养，其获得可以从外周血中分离得到。文献1阐述了采用密度梯度离心法从肝素抗凝无菌兔血中分离中性粒细胞。(文献1. Catini, C., 0. Rontani, and G. Mayer, A simple method for the isolation of highly purified neutrophil granulocytes from human peripheral blood Arch Ital Anat Embriol, 1985. 90 (4): 261-6)0MPO-H2O2可以使TMB氧化成蓝色产物，加入硫酸终止反应后呈黄色，于450nm有最大吸收。TMB的氧化产物在单位时间内的生成量与MPO活性成正比，因而0D450nm反映MPO 活性。文献2介绍了细胞释放的髓过氧化物酶(MPO)的测定。(文献2. Reumaux, D., et al. , Expression of myeloperoxidase (MPO) by neutrophils is necessary for their activation by anti-neutrophil cytoplasm autoantibodies (ANCA) against ΜΡ0. J Leukoc Biol, 2003. 73(6): 841-9)。中性粒细胞有两条代谢途径产生效应分子氮代谢途径产生一氧化氮、氧代谢途径产生超氧阴离子来抵抗病原的侵袭。文献3介绍了超氧阴离子产生用NBT还原方法测定。(文献 3. Durakj I.，et al.，A methodological approach to superoxide dismutase (SOD) activity assay based on inhibition of nitroblue tetrazolium
3(NBT) reduction· Clin Chim Acta, 1993. 214(1) : 103-4)。
发明内容
本发明的目的在于提供单一聚合度壳寡糖在制备免疫增强药物中的应用，更进一步说是两种壳寡糖单一化合物一壳五糖和壳六糖在制备治疗与免疫相关疾病的药物或保健食品中的应用。壳寡糖单一化合物通过对静息的或是激活的中性粒细胞，促进静息的中性粒细胞活力、NO释放和吞噬大肠杆菌的能力，抑制PMA过度激活的中性粒细胞的呼吸爆发、脱颗粒等一种或多种活性从而发挥免疫增强的作用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 单一聚合度壳寡糖在制备免疫增强药物中的应用。所述单一聚合度壳寡糖是指通过分离得到的聚合度分别为5和6的壳寡糖，即分别为壳五糖和壳六糖。所述单一聚合度壳寡糖为纯度> 70wt% ；所述单一聚合度壳寡糖于患处体液中的有效作用浓度可以为25-100 mg/mL。所述单一聚合度壳寡糖与药物学上可接受的药物辅料混合形成各种形式的散剂、 膏剂，粉剂，针剂、水剂或注射剂；所述药物辅料为聚乙烯吡咯烷酮、微硅胶粉等。在使用时可以采取皮下、静脉注射或肛肠给药；注射液的使用可以任意选用生理盐水、葡萄糖、稳定剂、防腐剂、悬浮剂或乳化剂等。本发明的优点为
1.根据实施例1 中性粒细胞在分离之后48h，若没有外界刺激，细胞基本全部趋于凋亡。本实验中壳五糖、壳六糖在一定浓度下表现出较好的促进细胞活力的活性。其中壳五糖在25、75 mg/mL的浓度下均明显提高了细胞的活力(p<0. 01)，壳六糖在50、100mg/ mL的浓度下均明显提高了细胞的活力(p<0. 05)，75mg/mL浓度下呈现出极为显著性差异 (p<0.01)。因此，壳五糖、壳六糖具有潜在的增强静息的中性粒细胞活力作用，有望开发成免疫增强的药物及与免疫增强相关的保健食品及食品添加剂等。2.根据实施例2 髓过氧化物酶MPO是嗜苯胺蓝性颗粒中独有的酶类，也是该颗粒中含量最高的酶类。MPO催化的底物主要为H2O2，可与氯离子共同生成次氯酸。ΜΡ0、次氯酸与H2A —起组成了髓过氧化物酶系统，是中性粒细胞最为有效的杀灭微生物的途径之一。但同时这个系统在炎症发生时对机体自身也会造成一定损伤，因此研究单一聚合度壳寡糖对PMA过度激活的中性粒细胞释放髓过氧化物酶的影响，是对这种过度反应的重要调节指标。实验发现壳五糖、壳六糖在浓度25、50μ g/mL时能够显著性抑制过度激活的PMA 释放髓过氧化物酶(P<0. 01)，壳六糖在浓度75 μ g/mL时也具有抑制作用(p<0. 05)，具有显著的调节作用。因此，壳五糖、壳六糖具有更明显的提高机体杀菌能力以及抵抗力，有望开发成免疫增强的药物及与免疫增强相关的保健食品及食品添加剂等。3.根据实施例3 :PMA过度激活的中性粒细胞自身释放大量超氧阴离子，超氧阴离子不稳定，在髓过氧化物酶的作用下生成过氧化氢，进一步与氯离子共同生成杀菌力极强的次氯酸。这种过度激活的状态对自身也有很强的损伤作用。实验结果表明，壳五糖在25、75μ g/mL的浓度下对过度激活的中性粒细胞超氧阴离子(02_)产生具有明显的抑制 (p<0. 05)，壳六糖在50、100 μ g/mL的浓度时对过度激活的中性粒细胞超氧阴离子的产生有显著的抑制(P<0. 05)，从而具有显著的调节作用。因此，壳五糖、壳六糖具有更明显的提高机体杀菌能力以及抵抗力，有望开发成免疫增强的药物及与免疫增强相关的保健食品及食品添加剂等。
图1单一聚合度的壳寡糖对静息中性粒细胞活力的影响(* p<0. 05 ；** p<0. 01)。图2单一聚合度壳寡糖对PMA过度激活的中性粒细胞释放MPO的影响(* p<0. 05 ； ** ρ<0·01)。图3单一聚合度壳寡糖对过度激活的中性粒细胞02_产生的影响(* ρ<0. 05)。
具体实施例方式本发明采用分离得到的质量含量> 70%的单一聚合度壳寡糖，通过细胞生物学方法发现其能够通过对静息的或是激活的中性粒细胞，促进静息的中性粒细胞活力、NO释放和吞噬大肠杆菌的能力，抑制PMA过度激活的中性粒细胞的呼吸爆发、脱颗粒等一种或多种活性从而发挥免疫增强的作用。参照文献 1 (Catini, C. , 0. Rontani, and G. Mayer, A simple method for the isolation of highly purified neutrophil granulocytes from human peripheral blood Arch Ital Anat Embriol, 1985. 90 (4) : 261-6)，采用密度梯度离心法从肝素抗凝无菌兔血中分离中性粒细胞。肝素抗凝的新西兰兔外周血用PH7. 4的磷酸盐缓冲液 PBS(100 mmol/L) 1:1稀释，然后等体积加到6%的右旋糖酐上，静置30分钟，取上层清液， 500g,离心lOmin，所得沉淀用NH4Cl溶液破碎红细胞后，500g，离心lOmin，所得沉淀用PBS 重悬，加到密度为1.087 Wpercoll分离液上层，以同样的离心条件得到的细胞沉淀即为中性粒细胞，用Giemsa染色液染色确定细胞纯度大于90%，台盼蓝染色确定活细胞百分率 >95%。实施例1
采用MTT法检测细胞活力，新鲜分离的中性粒细胞分为以下处理组(1)空白对照，(2) 单一聚合度壳寡糖处理25yg/mL，C3)单一聚合度壳寡糖处理50 μ g/mL，(4)单一聚合度壳寡糖处理75 μ g/mL, (5)单一聚合度壳寡糖处理100 μ g/mL, (6)聚合度为2飞的混合壳寡糖作为阳性对照，终体积为100μ1，37° C孵育20h，然后加入10μ1浓度为5mg/ml 的MTT继续孵育4h，将96孔板离心后倒掉上清，每孔加入100 μ 1DMS0,缓摇溶解IOmin后， 570nm检测吸光值，参考波长630nm。MTT的配制=MTT 0. 5g，溶于pH 7. 4的PBS缓冲液中， 0.22 μ m微孔滤膜过滤，避光存放于4° C。由图1可以看出，壳五糖、壳六糖在一定浓度下表现出较好的促进细胞活力的活性。壳五糖在25、75mg/mL的浓度下均明显提高了细胞的活力(p<0.01)，壳六糖在50、 100mg/mL的浓度下均明显提高了细胞的活力(p<0. 05)，75mg/mL浓度下呈现出极为显著性差异(p<0. 01)，壳四糖在25、50mg/mL的浓度下也明显提高了细胞的活力。实施例2
MPO-H2O2可以使TMB氧化成蓝色产物，加入硫酸终止反应后呈黄色，于450nm有最大吸收。TMB的氧化产物在单位时间内的生成量与MPO活性成正比，因而0D450nm反映MPO活性。以D-Hank' s液调节兔中性粒细胞密度至2X 105/ml。90 μ 1中性粒细胞悬液中加入10 μ L 细胞松弛素B (浓度lOyg/ml)，37° C孵育30min。离心，弃上清，将中性粒细胞重悬于 D-Hank's液中。实验分组80 μ 1中性粒细胞悬液+10 μ L单一壳寡糖溶液(浓度0、25、50、 75μ g/mL)+ 10口1^嫩(10^\0，371孵育30111土11。离心，弃上清。细胞重悬于 100 μ LHank，s 液中，37°C孵育30min。孵育结束后，收集上清80 μ L加入96孔板中，每孔加入TMB底物液 80 μ L，37°C孵育15min，加入50 μ L2mol/L的硫酸终止显色反应，震荡均勻后测定0D450nm。 空白对照组以Hank’ s液代替100 μ L中性粒细胞上清液，细胞总MPO活性组用100 μ L中性粒细胞含钙裂解液(100 μ L中性粒细胞悬液用0. 06%50 μ ICTAB裂解)代替中性粒细胞培养上清液，其余操作与实验组相同。MPO释放百分率公式
MPO 释放百分率(％) =100 X (OD450,实验-OD450，对照)/ (OD450,总-OD450，对照)。由图2，壳五糖、壳六糖在浓度25、50μ g/mL时能够显著性抑制过度激活的PMA释放髓过氧化物酶(P<0. 01),壳六糖在浓度75 μ g/mL时也具有显著的抑制过度激活的PMA释放髓过氧化物酶作用(P<0. 05)。实施例3
超氧阴离子产生用NBT还原方法测定。NBT掺入到中性粒细胞中可被02_还原产生蓝黑色颗粒物甲臜(formazan)，生成量与02_成正比。中性粒细胞在呼吸爆发过程中生成的(V还原NBT而生成的甲臜溶解于DMS0，在570nm处有吸收，吸光度与甲臜含量成正比， 测定A570nm反映甲臜的生成量即中性粒细胞的02_的产量。用PBS调兔中性粒细胞密度至2X 105/mL。实验分组80 μ L中性粒细胞悬液+10 μ L单一壳寡糖溶液(浓度0、25、50、 75、100 μ g/mL)+ 10 μ LPMA (IO-7M)0 37° C 孵育 30min。离心弃上清，加入 NBT (终浓度 0. ^))100μ L，37°C继续孵育20min。离心弃上清，以100 μ LDMSO充分溶解，震荡均勻后测定 A570nm。以100 μ L/孔的DMSO作为空白。由图3，壳五糖在25、75 μ g/mL浓度下对PMA过度激活的中性粒细胞超氧阴离子(02_)的产生具有明显的抑制作用(P<0. 05)，壳六糖在50、 100 μ g/mL浓度下对PMA过度激活的中性粒细胞超氧阴离子(02_)的产生具有明显的抑制作用(P<0. 05)。
权利要求
1.壳寡糖单一化合物在制备免疫增强药物中的应用，其特征在于所述壳寡糖单一化合物具体指聚合度分别为5或6的单一聚合度壳寡糖，即为壳五糖或壳六糖。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述壳寡糖单一化合物能够通过部分的通过促进静息的中性粒细胞活力、抑制PMA过度激活的中性粒细胞的呼吸爆发、脱颗粒活性从而体现其具有免疫增强的作用，即壳寡糖单一化合物可进一步用于制备免疫增强的药物中。
3.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述壳寡糖单一化合物在细胞生存环境或培养体系中的有效作用浓度为25-100 μ g/mL。
4.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述壳五糖或壳六糖与药物学上可接受的药物辅料混合形成各种形式的散剂、膏剂， 粉剂，针剂、水剂或注射剂。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物辅料为聚乙烯吡咯烷酮或微硅胶粉。
6.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述免疫增强药物是指壳寡糖单一化合物作为活性成份用于制备治疗与免疫相关疾病的药物或保健食品中。
7.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述与免疫相关疾病可以是自身免疫性甲状腺疾病、溶血性贫血、血小板减少、肾损害、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、糖尿病、肿瘤等。
全文摘要
本发明涉及生物医药，具体地说是壳寡糖单一化合物在制备免疫增强药物中的应用；所述壳寡糖单一化合物能够部分的通过促进静息的中性粒细胞活力、NO释放和吞噬大肠杆菌的能力，抑制PMA过度激活的中性粒细胞的呼吸爆发、脱颗粒活性从而发挥免疫增强的作用，即壳寡糖单一化合物可进一步用于作为免疫增强的药物。本发明以中性粒细胞为研究模型，实验发现，壳寡糖单一化合物—壳五糖和壳六糖能够显著增强免疫活性。
文档编号A61K31/702GK102475714SQ20101056298
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者吴迪, 杜昱光, 白雪芳, 谭成玉 申请人:中国科学院大连化学物理研究所