专利名称:Btg2基因制备放疗增敏药物的应用的制作方法
BTG2基因制备放疗增敏药物的应用技术领域
本发明属于放疗增敏药物领域,具体涉及BTG2基因(B细胞迁移基因幻在制备放 疗增敏药物领域的应用。
背景技术:
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在欧美国家,其发病率为100/10万。乳腺 癌发病率已成为我国大中城市中死亡率增长最快的癌症,而且发病年龄表现为逐渐年轻 化,已成为严重危害我国妇女健康的疾病之一。乳腺癌治疗目前以手术为主,术后根据病理 和临床情况辅以放射治疗和化疗,随着保乳手术的进展,放射治疗在乳腺癌治疗中的地位 更加重要。
放射治疗是肿瘤治疗的常规手段之一,70% 80%的恶性肿瘤患者在治疗过程中 需接受放疗。肿瘤对辐射不敏感或对辐射产生抗拒性,是放射治疗难以根治恶性肿瘤的主 要原因之一。近年来,随着对肿瘤发病分子机制及细胞生长调控机理研究的深入,肿瘤基 因治疗已取得一些令人振奋的成果,但针对单一环节的转基因治疗常常不能达到令人满意 的治疗效果。Weichselbaum等于1994年提出肿瘤基因-放射治疗的新思路,其原理是将 辐射诱导型基因的调控序列与肿瘤杀伤基因相耦联,转染肿瘤细胞,对肿瘤实施局部照射 同时诱导基因表达,通过射线与基因的双重作用杀伤肿瘤,以达到降低照射剂量、缓解正常 组织损伤的目的。因此,将放射治疗与基因治疗相结合,事半功倍,已成为肿瘤治疗研究的 重要方向之一,目前肿瘤基因联合放射治疗的有关机制主要有如下几种(参见田玥,苏成 海.国际放射医学核医学杂志.2008 32(1))①免疫基因治疗与放射治疗的联合;②抑癌 基因与放射治疗的联合;③自杀基因治疗与放射治疗的联合;④抗血管生成基因治疗与放 射治疗的联合;⑤特异性启动子基因治疗与放射治疗的联合;⑥辐射保护性基因治疗与放 射治疗的联合。
现有技术中,关于BTG2基因的报道,主要集中在其抑制肿瘤方面的应用,例如
1、张林等人将BTG2基因插入载体PCDNA3. 1构建PC-BTG2真核表达载体,以脂质 体介导转染MKN45胃癌细胞,经G418压力筛选法筛出稳定表达的阳性克隆,经流式细胞仪、 生长曲线法、平板克隆形成和细胞迁徙等实验分析稳定表达株相关生物学特性变化,每种 检测实验均设立PC-BTG2稳定转染细胞组、P⑶NA3. 1稳定转染细胞组和空白MKN45细胞组, 结果发现BTG2基因有较显著的抑制细胞生长增殖作用,同时可影响细胞周期,减少分裂期 细胞,促进细胞凋亡,并具有降低肿瘤细胞侵袭转移能力的作用(参见张林、侯艳红、王孟 薇、吴本俨、李楠.中华肿瘤防治杂志.2008 15(16));
2、马晓明、倪克樑等利用RT-PCR法研究31例人胰腺癌及同例癌旁组织BTG2mRNA 的表达,利用免疫沉淀法检测其BTG2蛋白的表达,用pcDNA3. 1-BTG2质粒转染人胰腺癌 细胞株swl990,用MTT法测定质粒转染后swl990/pcDNA3. 1-BTG2细胞生长曲线;应用 ArmexinV-FITC凋亡检测试剂,用流式细胞仪测定SW1990/pcDNA3. 1-BTG2细胞凋亡的情 况,结果发现BTG2基因在人胰腺癌中的表达下调可能与其恶性行为有关;BTG2基因的过度3表达可通过诱导凋亡而抑制人胰腺癌细胞株swl990的生长(参见马晓明、倪克樑.世界 肿瘤杂志· 20-24)。
然而BTG2基因在制备放疗增敏剂中的应用国内外至今未见报道。 发明内容
本发明目的是提供BTG2基因的新应用,即BTG2基因在制备放疗增敏药物中的应用。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案是BTG2基因在制备放疗增敏药物中的 应用,具体的,脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-BTG2在制备放疗增敏药物中的应用。
本发明同时要求保护一种放疗增敏药物,所述放疗增敏药物的活性成分包括携带 BTG2基因的真核表达质粒。
上述技术方案中,所述携带BTG2基因的真核表达质粒为脂质体介导的真核表达 质粒 pcDNA3-BTG2。
本发明还提供了一种应用脂质体介导的真核表达质粒pCDNA3-BTG2增强肿瘤细 胞对放疗敏感性的方法,放疗前将脂质体介导的真核表达质粒PCDNA3-BTG2导入肿瘤细 胞,使BTG2基因在肿瘤细胞中表达,然后进行放疗。
上述技术方案中,真核表达质粒pcDNA3-BTG2的制备方法为现有技术,可以参见 文献张林、侯艳红、王孟薇、吴本俨、李楠.中华肿瘤防治杂志.200815 (16)。
上述技术方案中,所述肿瘤细胞包括但不限于乳腺癌肿瘤细胞。
由于上述技术方案运用,本发明与现有技术相比具有下列优点
1、本发明所述脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-BTG2转染到人类乳腺癌MCF-7 细胞、MDA-MB-231细胞中,成功表达,并且BTG2蛋白可以上调促凋亡的Bax蛋白,下调细胞 周期调节蛋白Cyclin D1,通过促进细胞凋亡,促使细胞发生G0/G1期阻滞,增加乳腺癌细 胞对辐射的敏感性,且BTG2蛋白的这种调节作用与p53蛋白的状态无关。
2、BTG2基因还可以通过下调Ku_70蛋白、FEN-I蛋白和XRCCl蛋白这些辐射相关 的DNA损伤修复蛋白,抑制受照细胞的DNA损伤修复,增加了乳腺癌细胞的辐射敏感性,且 这种调节作用在发生照射之前就已经产生,在受到照射后更为明显。
3、本发明所述pcDNA3-BTG2转染联合放疗对乳腺癌细胞的细胞毒作用和诱导凋 亡的作用高于pcDNA3-BTG2单纯组和单一放疗组或其效果之和,呈现明显放疗增敏协同效 应。
图1为实施例达情况;
图2为实施例达水平;
图3为实施例
图4为实施例
图5为实施例 一中转染BTG2质粒后MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞BTG2 mRNA表一中转染BTG2质粒后MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞BTG2蛋白表一中BTG2基因转染MDA-MB-231和MCF-7细胞生存曲线; 一中照射后细胞G0/G1期细胞比例; 一中照射后细胞G2/M期细胞比例;
图6为实施例一中BTG2基因转染MDA_MB_231细胞照射后细胞周期变化;
图7为实施例一中BTG2转染对MDA_MB_231细胞照射后细胞周期相关、凋亡和辐 射相关蛋白的影响;
图8为实施例一中BTG2转染对MCF-7细胞照射后细胞周期相关、凋亡和辐射相关 蛋白的影响。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
材料人乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MCF-7购于美国细胞收藏中心(ATCC),并 由本实验室保存和培养;D-MEM培养基干粉,小牛血清,胰酶粉末购自Gibco公司;标准蛋 白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、IOX转膜液、30% Acry-Bis、Tris-HCl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏 碧云天生物技术研究所;二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工 程有限公司;抗 BTG2、P53、Bax、cyclin DU Ku_70、FEN-I 和 XRCCl 等抗体购自美国 Santa Cruzs 生物技术公司。RNase A 和 10 μ g/mL proteinase K 购自美国 Sigma Aldrich 公司。
1)细胞培养MDA-MB_231及MCF-7细胞培养于含10%小牛血清,谷氨酸胺及100 万U/L青霉素和链霉素的D-EME培养基。细胞置于5% CO2, 37°C培养箱内培养,每2_3天 传代1次,取对数生长期细胞用于实验。
2)细胞的转染和克隆筛选转染前一天,将细胞用胰酶消化、计数,以合适的密度 接种6孔板,置于CO2培养箱中培养过夜,使转染当日细胞融合度为70% 90%。在铺板 和转染期间避免使用抗生素。
转染溶液配制按照质粒:Lipofectamine2000用量比为1 μ g/孔:2. 5 μ 1/孔。 2 μ g/孔 DNA 加入 100 μ 1/孔 DMEM 混勻,室温静置 5min,备用;5 μ 1/孔 Lipofectamine2000 加入100 μ 1/孔基础DMEM混勻,室温静置5min,备用;将稀释的DNA同稀释的脂质体试剂混 合,在室温保温30min后,加入800 μ 1/孔基础DMEM,备用。用PBS及无抗生素的基础DMEM 洗涤细胞,每孔加入Iml转染混合液,5% C02,37°C培养证。证后,弃去含转染试剂的培养 液,加入新鲜的完全培养基,继续培养后,72小时内完成实验即为瞬时转染;如果细胞继续 培养4 后,更换含G418的培养基,大约两周后,筛选阳性稳定克隆,即为稳定转染。
应用脂质体转染的方法,将前述所构建的真核表达质粒pCDNA3-BTG2分别转染到 人类乳腺癌MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞,同时转染“空”的pcDNA3质粒作为阳性对照。 MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞转染BTG2基因后的RT-PCR电泳图见图1。从图中可以看 出,MCF-7/BTG2细胞和MDA-MB-231/BTG2细胞中BTG2 mRNA明显高表达,而相应的母细胞 和空质粒细胞中BTG2 mRNA均为极低表达。MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞转染BTG2基因 后的Western blot电泳图见图2。从图中可以看出,MCF-7/BTG2和MDA-MB-231/BTG2细胞 中的BTG2蛋白表达水平明显高于相应的母细胞和转染“空”质粒的细胞,同时,母细胞和转 染“空”质粒的细胞BTG2蛋白表达水平相同。
以上结果从RNA水平和蛋白水平均证明,BTG2基因已经转染进入乳腺癌细胞 MCF-7和MDA-MB-231细胞,并且可以使乳腺癌细胞高表达BTG2蛋白,同时“空”的pcDNA3 质粒没有影响BTG2蛋白表达。
3) BTG2基因增加乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7细胞的辐射敏感性
应用不同剂量的χ -射线对MDA-MB-231和MCF-7细胞的BTG2稳定转染株进行照 射,照射后进行细胞克隆形成实验,结果如图3所示。从图3中可以看出,MDA-MB-231/BTG2 细胞存活曲线明显低于MDA-MB-231和MDA-MB-231/Neo细胞,说明MDA-MB-231细胞的放射 敏感性较后两种细胞高,同时,MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/Neo细胞存活曲线没有明显 变化,说明这两种细胞放射敏感性相同。MCF-7细胞也有同样情况,说明MCF-7/BTG2细胞的 放射敏感性明显较MCF-7细胞和MCF-7/Neo细胞高,同时MCF-7细胞和MCF-7/Neo细胞放 射敏感性没有差别。
上述照射条件为细胞置于直线加速器下,射线性质为高能6兆伏X-射线,照射 野为IOcmX 10cm,源皮距为100cm,剂量率为200cGy/min。照射时培养皿面上覆盖1. 5cm厚 等效蜡板以调整照射剂量。
4)BTG2基因影响了 x -射线照射后的乳腺癌细胞的细胞周期
对BTG2转染的MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞分别进行0,2,4,6,8Gy的χ -射线 照射,照射后M小时收集细胞样品,应用流式细胞术进行细胞周期分析,结果如图4,图5所7J\ ο
图4是细胞χ -射线照射后G0/G1期细胞比例,从图中可以看出,MDA_MB_231三 种细胞和MCF-7三种细胞在照射后,G0/G1期细胞比例总的趋势是随照射剂量增加,细胞比 例呈下降趋势。在MCF-7细胞,MCF-7/BTG2细胞在所有照射剂量G0/G1期细胞比例均高于 MCF-7和MCF-7/Neo细胞(ρ < 0. 05)。而在MDA-MB-231三种细胞中,G0/G1期细胞比例没 有明显差异(P >0.05),这些结果说明,BTG2基因在χ-射线照射后促进MCF-7细胞发生 了更明显的Gl期细胞阻滞。
图5是细胞照射后G2/M期细胞比例,从图中可以看出,MDA-MB-231三种细胞和 MCF-7三种细胞在照射后,G2/M期细胞比例总的趋势是随照射剂量增加,细胞比例呈升高 趋势。在MDA-MB-231细胞,MDA-MB-231/BTG2细胞在所有照射剂量G2/M期细胞比例均高于 MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/Neo 细胞,其中,0Gy,4Gy 和 8Gy 剂量有统计学意义(ρ < 0. 05)。 在MCF-7的三种细胞中,G2/M期细胞比例没有统计学上的差别(ρ > 0.05)。这些结果说 明,在照射后BTG2基因促使MDA-MB-231细胞发生更多G2期细胞阻滞。
图6为典型的流式细胞周期结果图,从图中可以看出,相对于对照细胞,照射后的 转染BTG2基因的MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞均出现了明显的sub Gl峰,说明BTG2基 因在乳腺癌细胞照射后促进了凋亡的发生。
上述流式细胞技术分析细胞周期的方法包括以下步骤将待测细胞以IXlO5个 /ml密度接种于六孔板,加正常培养液;24h后加不含FBS的DMEM进行细胞周期同步化 12-24h ;用不含EDTA的0. 25%胰酶进行消化,IOOOrpm离心5min ;用PBS液洗两遍,弃上 液;向IOml试管内加2. 5ml盐水G溶液重新悬浮细胞,然后缓慢加入4°C预冷的70%酒精 5ml,冰浴30min(也可放4°C冰箱过夜);检测前进行PI单染吹散细胞后用300目尼龙滤 膜过滤,除去成团的细胞群,然后IOOOrpm离心5min,去上液;加100 μ 1 5mg/ml RNA酶溶 液,37°C保温30min,然后冰浴终止酶作用;加PI染液(100 μ g/ml)避光染色30min ;应用 FCM测细胞周期用EPICSXL流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)进行细胞周期分析,氩 离子激发PI荧光,激发光波长为488nm,用620nm波长滤器检测对数红色荧光,收集数据待分析。最后用Multicycle分析软件进行细胞周期的分析分别计算Gl期,S期和G2期的 相对比例。
5)研究BTG2基因对细胞周期、凋亡和辐照相关蛋白相关蛋白表达的影响
将转染BTG2的MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞以及他们的母细胞和转染“空”质粒细 胞分别进行4Gy的χ-射线照射,照射后M小时常规收集细胞蛋白样,应用Western blot 对细胞和凋亡相关的蛋白进行检测。
如图7结果所示,在MDA-MB-231三种细胞,与照射前比,三种细胞BTG2蛋白表达 均有增加,MDA-MB-231/BTG2增加的更为明显;照射后的三种细胞中,与母细胞和“空”质粒 细胞相比,MDA-MB-231/BTG2细胞BTG2蛋白表达也明显增高。MDA-MB-231三种细胞均表 现为,伴随BTG2蛋白表达增高,Bax蛋白表达也增加,Cyclin Dl蛋白表达略有降低,但p53 蛋白没有明显变化。在4Gy χ-射线照射后,MDA-MB-231/BTG2的BTG2蛋白和Bax蛋白表 达上调最为明显,Cyclin Dl蛋白表达下调也最为明显,但p53蛋白没有明显变化。在照射 前,与母细胞和“空”质粒细胞相比,MDA-MB-231/BTG2细胞BTG2蛋白上调,XRCCl蛋白下 调。受到4Gy χ -射线照射后,MDA-MB-231/BTG2细胞BTG2蛋白明显上调,同时辐射相关 蛋白Ku-70蛋白、FEN-I蛋白和XRCCl蛋白均表达下调。
MCF-7三种细胞也表现出相同的规律,结果如图8所示。照射后,MCF-7/BTG2细 胞的BTG2蛋自、Bax蛋白表达明显上调,Cyclin Dl蛋白表达明显下调。但与MDA-MB-231 细胞不同的是,MCF-7/BTG2细胞的p53蛋白表达也明显上调。在MCF-7三种细胞,在照射 前,MCF-7/BTG2细胞即表现为BTG2蛋白表达上调,辐射相关蛋白Ku_70蛋白、FEN-I蛋白和 XRCCl蛋白表达下调,在照射后,这种表现更为明显。
另外,结果也可以看出,乳腺癌细胞照射后,野生型p53蛋白(MCF-7)表达上调,突 变型P53蛋白(MDA-MB-231)没有变化,说明x -射线可以引起野生型p53蛋白的表达上调, 而对突变型P53蛋白没有影响。
上述flfestern-blot法包括以下步骤收集细胞并转至于1. 5ml的Eppendorf管中 离心O500转/分)5分钟,弃上清,并加入100μ 1 IP裂解液,置于冰上2小时。4°C离心 5分钟(2,500转/分钟),转移上清液至新的Eppendorf管,并采用分光光度计检测样品蛋 白含量。加入蛋白上样缓冲液(5X)混勻,置于恒温混勻器上,100°C 5分钟,蛋白电泳后 转至醋酸纤维膜上。膜采用封闭液(5%脱脂奶粉,IXT-BST缓冲液)封闭lh。洗涤,并分 别加入一抗β-Actin,BTG2,Cyclin Bi, Cyclin D1,经封闭液处理的醋酸纤维膜室温抚育 1小时。T-BST缓冲液洗膜3次,加入二抗(1 1000稀释)抚育1小时。T-BST缓冲液洗 膜3次,最后加ECL发光剂,显影、定影,胶片洗涤和干燥后,扫描分析。
6)细胞克隆形成法5μπι01/ ΒΤ62基因处理4小时的细胞接受不同剂量的-辐 射照射,然后接种到IOOmm培养皿。连续培养三周后,采用甲醇固定,加姬姆萨液染色30分 钟,流水洗净,最后观察和记录含有>50细胞的克隆个数。采用克隆形成率(PE)=(对照 组克隆数/实验组细胞数)X 100%公式计算克隆形成率,采用存活分数=实验组克隆形成 率/对照组克隆形成率公式计算存活分数,计算放射增敏比SER =对照组DO/实验组DO。
对以上实验数据根据多靶单击模型拟合曲线,所得DpDc^N等参数结果见表1。
表1. . BTG2基因转染MDA-MB-231和MCF-7多靶单击模型参数
权利要求
1.BTG2基因在制备放疗增敏药物中的应用。
2.脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-BTG2在制备放疗增敏药物中的应用。
3.一种放疗增敏药物,其特征在于,所述放疗增敏药物的活性成分包括携带BTG2基因 的真核表达质粒。
4.根据权利要求3所述放疗增敏药物,其特征在于,所述携带BTG2基因的真核表达质 粒为脂质体介导的真核表达质粒PCDNA3-BTG2。
全文摘要
本发明属于放疗增敏药物领域,具体涉及BTG2基因(B细胞迁移基因2)在制备包括χ-射线在内的电离辐射作为肿瘤放疗增敏药物领域的应用。本发明公开了脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-BTG2在制备放疗增敏药物中的应用,将所述脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-BTG2转染到人类乳腺癌MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞中,成功表达,并且BTG2蛋白可以上调促凋亡的Bax蛋白,下调细胞周期调节蛋白Cyclin D1,通过促进细胞凋亡,促使细胞发生G0/G1期阻滞,增加乳腺癌细胞对χ-射线在内的电离辐射的敏感性。
文档编号A61P35/00GK102028957SQ20101058588
公开日2011年4月27日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者樊赛军, 胡旭东 申请人:苏州大学