专利名称：肌红蛋白免疫吸附剂及免疫吸附装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫吸附剂及含有该吸附剂的免疫吸附装置，特别是可应用于横纹肌溶解的现场急救的免疫吸附装置。
背景技术：
横纹肌溶解可以导致急性肾损伤，肌红蛋白是致病的关键蛋白，能够导致肾小管上皮细胞的凋亡。清除血中的肌红蛋白，是治疗横纹肌溶解的有效方法。肌红蛋白多肽链的疏水侧链大都在分子内部，形成一袋形空穴，亲水侧链多位于分子表面，因此其水溶性较好，可经肾小球自由滤过。在异常增高时，通常采用血液透析或血液滤过进行治疗。但传统的血液透析对肌红蛋白清除不足，而采用血液滤过，特别是高通量血滤可以达到较好的清除效果。但在特殊条件下，如地震、泥石流、战争、大型事故的现场，常因存在交通障碍、电力中断、供水设施破坏等，使血液透析等水电消耗量较大的治疗手段在灾难现场无法展开实施，从国际上几次大地震的文献报道，以及国内汶川大地震的实际抢救经验来看，许多伤员因为在现场没有能够展开的有效救治设施，而在转往后送途中或之后死亡。因此，开发能在灾害现场有效展开的救治模式，早期快速清除血液中高浓度的肌红蛋白，是救治的关键。血浆分离是非常有效的治疗模式，但因为血浆处理量有限，总清除量不高。尝试直接对全血灌流吸附或双重血浆滤过吸附是很有前景的治疗模式。而在现场，全血灌流更加可行。它是一种基础的血液净化模式，利用吸附原理，将血液循环的毒素清除体外。它的体外循环相对简单，仅需要一个动力泵，容易建立，最适合在现场急救中应用。在适当情况下， 甚至可以不用动力泵，靠伤员的动静脉压力差进行，更便于现场展开。本发明立足于血液灌流的治疗模式，利用抗原抗体特异性结合的吸附原理，构建免疫吸附装置，实现对肌红蛋白特异的吸附清除。关于肌红蛋白吸附清除的文献较少， Kuntsevich等对商品化的吸附器X-Sorb进行了肌红蛋白吸附测试，发现吸附率尚好，但该吸附器并非专为肌红蛋白设计，不能实现肌红蛋白特异性的清除，可能会影响其它血液成分。本研究提出以抗体为配基构建免疫吸附装置的肌红蛋白特异性清除方法，尚无文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有优良的对肌红蛋白特异性吸附清除作用的免疫吸附剂，以及含有该免疫吸附剂且大大减少对水电能源的依赖的、适用于横纹肌溶解的现场急救的肌红蛋白免疫吸附装置。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种肌红蛋白免疫吸附剂，它由固相载体和与之偶联的肌红蛋白多克隆抗体组成，所述肌红蛋白多克隆抗体为以钥孔虫戚血蓝蛋白和抗原肽交联形成的复合物为免疫原得到的多克隆抗体，所述抗原肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID :No. 5所示。
如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂，其中，所述固相载体为树脂载体。如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂，其中，所述固相载体为D-380树脂载体。如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂作为吸附柱填料的肌红蛋白免疫吸附柱。含有如上所述的肌红蛋白免疫吸附柱的肌红蛋白免疫吸附装置，它还包括导管、 血泵、空气监测器和静脉夹；所述导管依次连接血泵、肌红蛋白免疫吸附柱、空气检测器和静脉夹。含有如上所述的肌红蛋白免疫吸附柱的急救工具包，它还包括导管、血泵、血管穿刺针、手套、敷料、碘伏和电池。一种用于制备如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂中的肌红蛋白多克隆抗体的免疫原，它是由钥孔虫戚血蓝蛋白和氨基酸序列如序列表SEQ ID :No. 5所示的抗原肽交联形成的复合物。如上所述的肌红蛋白免疫吸附剂，是按照步骤如下的制备方法制成的a.将所述树脂载体用乙醇浸泡2 4小时，反复洗涤后，稀盐酸浸泡30分钟，将树脂载体激活；b.将所述肌红蛋白多克隆抗体与激活的树脂载体混合，15rpm下旋转反应2小时， 使抗体与载体交联；c.反复洗去未与载体交联的抗体；d.加入pH8. 0的Tris缓冲液封闭过夜；e.用PBS洗涤，0. 02% g/mL的叠氮钠4°C存放。如上所述的肌红蛋白免疫吸附柱，是按照步骤如下的制备方法制成的a.将所述吸附柱填料用双蒸水浸泡M小时，置于双蒸水中成为吸附柱填料水悬液；b.将层析柱垂直固定于架台，关闭层析柱下方出口，由上口灌入所述吸附柱填料水悬液；c.吸附柱填料水悬液灌注完毕后，继续灌入双蒸水至液面到达层析柱的上口，插入柱芯至柱芯下端与填料上表面平齐，固定柱芯；d.层析柱上口接恒流泵，放开下口，以2mL/min的流速冲洗；e.反向冲洗多次至层析柱中无气泡；r改为正向冲洗，逐渐增加液相流速至20mL/min压柱；g.重新调整柱芯深度至其下端与填料上表面平齐后固定，再以20mL/min的流速恒流压柱30分钟；h.再调整柱芯深度至其下端与填料上表面平齐后固定，关闭下方出口，加入 20vt%乙醇备用。本发明的有益效果为1、本发明利用抗原和抗体特异性结合的原理，将抗体固定于载体上并装配吸附柱，当血液流经吸附柱时，血液中的肌红蛋白可以被吸附柱内载体上交联的抗体吸附，使得本发明的清除作用具有高度的特异性。2、由于本发明采用了简单的血液灌流模式，与传统的血滤模式相比较，对水电能源的依赖程度低，更适合灾难事故的现场救治需要。
3、通过吸附实验检测本发明吸附效果上样蛋白量为4000. 02ug，流穿蛋白量为3090. 80ug，本发明肌红蛋白免疫吸附柱的平台期瞬时清除率为27. 95%，总清除量为 909. 23ug,总清除率为22. 73%。图7a中可见流穿液OD值较吸附前降低，而图7b中可见空白柱对肌红蛋白没有明显清除作用，流穿液与吸附前溶液的OD值无显著降低。可知免疫吸附柱对肌红蛋白有较好的清除作用。4、将肌红蛋白免疫吸附柱反复洗脱至基线平稳后，再测试其清除功能肌红蛋白样本总量为1971. 1 lug，流穿量为1136. 4!3ug，总清除量为834. 68ug，总清除率为42. 35%. 如图8所示，其总清除量与首次吸附的总清除量相近，说明该免疫吸附柱是可以复用的。5、比较免疫吸附柱对肌红蛋白等三种蛋白的吸附率，结果如表2所示，免疫吸附柱对肌红蛋白的吸附率显著高于其它两种蛋白，而另两种蛋白吸附率无显著差异。说明本发明免疫吸附柱的清除作用具有高度特异性。本发明与常规的血液透析或血液滤过治疗模式不同，它立足于便捷的血液灌流治疗模式，以肌红蛋白抗体做配基，交联树脂载体，装配肌红蛋白免疫吸附柱，可实现肌红蛋白高度特异性的吸附，尤其适合应用于横纹肌溶解的现场救治。与血液透析或滤过模式相比较，全血灌流模式水电消耗较小，更易实现，更符合灾难事故现场救治的需要。
图1为检测纯化后抗体纯度的SDS-PAGE电泳图。图2为纯化后的抗体的Wfestern blot检测样本，图加为抗D-12抗体，图2b为抗 L-12抗体。图3为纯化后的抗体在肌溶解模型大鼠肾脏进行免疫组化的染色照片，图3a为抗 D-12抗体，图3b为抗L-12抗体。图4为D-380树脂孵育对血清电解质的影响的柱状图。
图5为408nm吸光度检测肌红蛋白浓度的标准曲线。图6为模拟体外循环的实验系统的模式图。图7为免疫吸附柱与空白柱吸附测试结果的比较，图7a为免疫吸附柱吸附测试结果，图7b为空白柱吸附测试结果。图8为免疫吸附柱洗脱再生后复用测试结果。图9为在3种不同吸附条件下、3种不同样本的FPLC检测结果，图9a_i分别示出吸附条件和样本的各种不同组合的检测结果。图10为本发明免疫吸附装置的构建模式图。图11为横纹肌溶解救治的不同血液净化方法的模式图，图Ila为血液透析模式图，图lib为血液灌流模式图。
具体实施例方式实施例1、肌红蛋白多克隆抗体的制备一、设计、合成抗原短肽1、获得肌红蛋白全长氨基酸序列信息在NCBI蛋白数据库中检索肌红蛋白全长氨基酸序列，其如SEQ ID :No. 1所示
MGLSD GEffQM VLNIff GKVEG DLAGH GQEVL ISLFK AHPET LEKFD KFKNL KSEEE MKS SE DLKKH GCTVL TALGT ILKKK GQHAA EIQPL AQSHA TKHKI PVKYL EFISE VIIQV LKKRY SGDFG ADAQG AMSKA LELFR NDIAA KYKEL GFQG2、抗原表位预测参考NCBI 网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上 bl2seq 蛋白同源检测结果，利用DNAMar7. 10软件辅助设计多肽抗原。根据以下原则选择抗原肽①尽可能位于蛋白的表面；②亲水性好；③N端或C端优于中间段；④一般不含重复序列。选择了两条肽段作为抗原肽，其氨基酸序列分别如SEQ ID:No. 2和SEQ ID =No. 3 所示SEQ ID :No. 2 =GLSDG EffQMV LSEQ ID :Νο· 3 =KKRYS GDFGA D3、人工合成多肽短链以筛选的肽段氨基酸序列为模板合成短肽，并在N端加半胱氨酸，得到两条合成的短肽，分别命名为L-12和D-12，其序列分别如SEQ ID =No. 4和SEQ ID =No. 5所示L-12(SEQ ID :Νο· 4) =C-GLSD GEffQM VLD-12(SEQ ID :Νο· 5) =C-KKRY SGDFG AD上述短肽由生物公司按常规方法合成。4、偶联大分子形成复合物用活化的KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin，钥孔虫戚血蓝蛋白)与上述两种短肽分别交联，生成2种大分子复合物①KLH-L-12 ；②KLH-D-12。交联KLH的步骤如下(1)活化将 KLH 与交联剂 SMCC[Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, 4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸琥珀酰亚胺酯] 混合，室温旋转反应30min，使KLH充分活化。用多肽偶联缓冲液平衡的kphadex G-25柱层析除去游离成分；(2)偶联将短肽加入已活化的KLH中室温旋转反应2小时。二、制备多克隆抗体1、获得肌红蛋白抗血清用上述得到的两种KLH-短肽复合物KLH-L-12和KLH-D-12分别免疫动物获得抗血清。本实施例采用兔子作为免疫动物，免疫程序如下第1次免疫(第O天)800ug/只，抗原溶液加等体积弗氏完全佐剂(Freimd' s complete adjuvant，FCA)乳化后皮下多点注射(6点)；第2次免疫(第21天)400ug/只，抗原溶液加等体积弗氏不完全佐剂 (Freund' s incomplete adjuvant，FIA)乳化后皮下多点注射(4 点)；第3次免疫(第35天)400ug/只，抗原溶液加等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射G点)；第4次免疫(第49天)200ug/只，静脉注射；第5次免疫(第63天)400ug/只，抗原溶液加等体积弗氏不完全佐剂乳化后点多点注射G点)。
2、抗血清效价检测免疫10天后，每只兔子耳缘静脉取血0. 5-lmL,分离抗血清，间接法ELISA检测免疫后抗血清OD值。检测结果按0Dra/0Dra>2. 1标准判断。间接法ELISA操作如下(1)孵育一抗一抗为抗血清，稀释比例为1 IOOOU 5000,1 25000、 1 125000以及1 625000 ；阴性对照为免疫前血清，稀释比例为1 10000 ；空白对照为 0. 01M，ρΗ7· 2 的 PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)；(2)孵育二抗二抗为HRP (Horseradish peroxidase，辣根过氧化物酶)标记的山羊抗兔IgG，稀释比例为1 10000。3、抗血清的纯化A.蛋白G纯化使用蛋白G(Pr0tein G)对获得的抗血清进行初步纯化。纯化步骤如下(1)平衡用Binding Buffer (结合缓冲液)平衡ftOtein G亲和柱至基线平稳；(2)上样将用Binding Buffer稀释的血清样品负载上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳；(3)洗脱加入Elution Buffer (洗脱缓冲液)洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测纯度；(4)用0. 01M，pH7. 2 PBS透析收集的洗脱峰，使纯化后的IgG保存在0. 01M，pH7. 2 的PBS环境中；(5)用蛋白定量检测仪测定纯化后总IgG浓度。其中，BindingBuffer 为 0. 05M, ρΗ7· 0 的 PBS ；Elution Buffer 为 0. 1M, ρΗ2· 6 的甘氨酸-盐酸缓冲液。B.抗原亲和纯化制备溴化氰活化的kpharose 4B凝胶亲和柱，分别以D-12和L-12两种短肽为抗原，进行抗原特异性亲和纯化。纯化步骤如下(1)平衡用Binding Buffer平衡抗原亲和柱至基线平稳；(2)上样将用ftOteinG纯化的总IgG负载上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳；(3)洗脱加入Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE检测纯度；(4)用0. 01M, pH7. 2PBS透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在0. 01M, pH7. 2PBS环境中；(5)浓缩透析后的抗体；(6)用蛋白定量检测仪测定特异抗体浓度。其中，BindingBuffer 为:0. 05M, ρΗ7· 0 的 PBS ；Elution Buffer 为0. 1M, ρΗ2· 6 的 Glycine。三、纯化后抗体的检测1、抗体纯度检测抗体IgG分别进行还原样和非还原样SDS-PAGE电泳，还原样电泳在50kd左右只有一条带，没有杂带，则抗体纯度> 90%。SDS-PAGE电泳操作如下(1)配制10% (g/mL)聚丙烯酰胺凝胶；
(2)分别以还原样抗D-12多抗、还原样抗L-12多抗、非还原样抗D_12多抗、非还原样抗L-12多抗上样；(3)电泳及图象分析。示例的检测样本的电泳图谱如图1所示，其中各道加样如下1 道蛋白 Marker;2道抗D-12多抗(还原样)；3道抗L-12多抗(还原样)；4道抗D-12多抗(非还原样)；5道抗L-12多抗(非还原样)。由图1可见，抗D-12多抗和抗L-12多抗的还原样电泳均只在50kd左右有一条带， 且没有杂带，抗体纯度符合要求。2、抗体效价检测用间接ELISA检测纯化后肌红蛋白抗体效价。间接ELISA的操作如下(1)孵育一抗一抗为纯化后抗体；抗D-12多抗的稀释比例为(稀释比例为体积比，下同)1 2000,1 4000、 1 8000、1 16000、1 32000 以及 1 64000;抗L-12 多抗的稀释比例为1 1000、1 4000、1 16000、1 64000 以及 1 256000 ；空白对照为0. 01M，pH7. 2PBS ；(2)孵育二抗二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG，稀释比例为1 10000。3、抗体特异性检测A. Western blot 检测分别用合成的两种多抗为一抗，进行Western blot，检测肌红蛋白标准品。成功结合的抗体可以检测到条带。操作如下(1)配制15% (g/mL)聚丙烯酰胺凝胶；(2)分别以肌红蛋白标准品、正常大鼠血清、横纹肌溶解造模后7d大鼠血清、大鼠肌肉勻浆蛋白为样本，上样；(3)电泳并转膜；(4)分别以纯化的抗D-12多抗和抗L-12多抗为一抗(1 300稀释)，山羊抗兔 IgG为二抗(1 2000稀释)，进行免疫印迹；(5)显色、曝光；(6)结果分析。检测样本图谱如图2所示，其中各道加样如下1道肌红蛋白标准品(10g/L)2道正常大鼠血清3道横纹肌溶解造模7d大鼠血清4道大鼠肌肉勻浆蛋白由图加可见，抗D-12抗体可以检测到条带，而图2b所示的抗L-12抗体未见条带， 因而选择抗D-12抗体进行进一步实验。
B.免疫组化检测将合成的2种多抗，按不同比例稀释作为一抗，对横纹肌溶解病变的肾脏组织，进行免疫组化检测。成功结合的抗体有明显的阳性着色区。免疫组化的步骤如下(1)取甘油诱导的横纹肌溶解模型大鼠肾脏，制备石腊切片；(2)切片经脱蜡、水化、抗原修复、封闭；(3)分别按1 20、1 IOOU 150,1 200比例稀释纯化后的抗D-12多抗及抗L-12多抗；(4)以上述不同比例稀释的抗体为一抗进行孵育，4°C过夜；(5)洗片；加入生物素化二抗，室温孵育1小时；(6)洗片；力卩入 ABC(ABC 技术，即 Avidin Biotinylated Enzyme Complex Technology,是广泛用于免疫组化的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术)试剂，室温孵育30分钟；(7)洗片；DAB (3, 3' -Diaminobenzidine, 3, 3' _ 二氨基联苯胺)显色；(8)图象分析。其中，所述ABC试剂购自Vector公司。图3为示例的纯化后抗体在肌溶解模型大鼠肾脏进行免疫组化的染色照片，其中一抗均以1 100孵育。图3a为抗D-12多克隆抗体，其在横纹肌溶解大鼠肾脏组织可有染色阳性；图北为抗L-12抗体，其无明显着色，因而选择抗D-12抗体进行进一步实验。实施例2、肌红蛋白免疫吸附实验治疗装置的构建及功能验证一、装配肌红蛋白免疫吸附柱1、载体的选择按以下基本条件选择树脂载体①材料带有-NH2基团；②中性或弱酸碱性；③具有一定强度；④溶胀率较低；⑤不释放生物毒性物质。本实施例选用弱碱性阴离子交换树脂D-380作为树脂载体。对D-380树脂进行血清孵育试验，发现D-380树脂浸泡对血清中几种主要电解质的浓度无显著影响，如图4所示，因此可作为载体使用。2、抗体偶联以纯化的肌红蛋白多抗为配基，与D-380树脂载体偶联，制备吸附柱填料，具体步骤如下(1)激活将树脂载体用无水乙醇浸泡2 4小时，反复洗涤后，0. IM稀盐酸浸泡 30分钟。(2)交联将抗体与树脂载体混合，15rpm下旋转反应2小时。(3)洗涤用超纯水反复洗去未交联的抗体。(4)封闭力ΠρΗ8·0 Tris [Tris (Hydroxymethyl) aminomethane，三羟甲基氨基甲烷]缓冲液封闭过夜。(5)洗涤0. OlM PBS 洗涤，0. 02% (g/mL)叠氮钠 4°C存放。3、填料装柱以吸附柱填料装填吸附柱，其中，以偶联肌红蛋白抗体的填料装填抗体柱，以未偶联的D-380填料装填空白柱，装填的具体步骤如下(1)将填料用双蒸水浸泡M小时，充分溶胀，置于双蒸水备用，双蒸水以刚好淹没过填料为准；(2)取干净的玻璃层析柱1支(20Xlcm)，垂直固定于架台；(3)关闭层析柱下方出口，由上口灌入填料水悬液；(4)填料水悬液灌入完毕后，继续灌入双蒸水，直至液面到达玻璃层析柱的上口 ；(5)插入塑料柱芯至其下端与填料上表面平齐后，固定柱芯；(6)层析柱上口接恒流泵，放开下方出口，以2mL/min左右的低流速冲洗；(7)反向冲洗并重复多次，直至层析柱中无气泡为止；(8)改为正向冲洗，逐渐增加液相流速至20mL/min左右，压柱；(9)重新调整柱芯深度使其下端与填料上表面平齐后固定；(10)再以20mL/min左右的流速恒流压柱30分钟；(11)再调整柱芯至其下端与填料上表面平齐后固定；(12)关闭层析柱下方出口，加入20vt%乙醇备用。二、验证肌红蛋白免疫吸附柱的吸附功能1、建立吸光度检测肌红蛋白浓度标准曲线肌红蛋白浓度按408nm吸光度的计算公式如下肌红蛋白浓度(ug/mL)= 408nm 吸光度(OD) X 142. 9408nm吸光度检测肌红蛋白浓度的标准曲线如图5所示。2、模拟体外循环，进行吸附实验A.用泵管系统构建单室、开放的吸附实验体系，模拟体外循环，进行吸附测试及洗脱再生后复用测试。该体系的模式图如图6所示，是将蛋白样本一恒流泵一免疫吸附柱一部分收集器顺序依次连接构成。B.模拟体外循环的吸附实验的步骤如下(1)构建如图6所示的吸附实验体系；(2)设置恒流泵速，优选为0. 5-2mL/min ；(3)蛋白样本经恒流泵泵入免疫吸附柱进行吸附；(4)吸附前样本检测OD值；(5)吸附后的流穿液经部分收集器收集；(6)检测各流穿样本的OD值；(7)按OD值绘制吸附曲线。C.通过吸附实验检测本发明吸附效果上样蛋白量为4000. 02ug，流穿蛋白量为3090. 80ug，本发明肌红蛋白免疫吸附柱的平台期瞬时清除率为27. 95%，总清除量为 909. 23ug,总清除率为22. 73%。如图7所示，图7a中可见吸附柱的流穿液OD值较吸附前明显降低，而图7b中空白柱对肌红蛋白没有明显清除作用，流穿液与吸附前溶液的OD值无显著降低。可知免疫吸附柱对肌红蛋白有较好的清除作用。D.将肌红蛋白免疫吸附柱反复洗脱至基线平稳后，再测试其清除功能肌红蛋白样本总量为1971. 1 lug，流穿量为1136. 4!3ug，总清除量为834. 68ug，总清除率为42. 35%。 如图8所示，免疫吸附柱的总清除量与首次吸附的总清除量相近，说明该免疫吸附柱是可以复用的。3、用快速蛋白液相色谱仪(FPLC)分析免疫吸附柱的清除功能使用肌红蛋白、白蛋白和溶菌酶3种蛋白样本，分别测试免疫吸附柱、空白柱和不加任何柱3种吸附条件下FPLC流穿峰与洗脱峰的特点。测试此吸附装置对肌红蛋白清除的特异性。A. FPLC体系配置采用ImL样本一次性推入的上样方式，上样蛋白浓度3. 6g/L。液体流速lmL/min， A液配洗脱缓冲液，B液配上样缓冲液。B.数据处理电脑记录流穿峰及洗脱峰，FPLC自带软件处理流穿及洗脱曲线，寻找流穿/洗脱峰，并计算各峰峰值(AU值)、达峰时间(min或mL)、各峰曲线下面积(AU · mL)。C.采用流穿率和洗脱率两个参数评价各柱的吸附功能。流穿量=流穿峰曲线下总面积；洗脱量=洗脱峰曲线下总面积之和；流穿率=流穿量/(流穿量+洗脱量)X 100% ；洗脱率=流穿量/(流穿量+洗脱量)X 100%。D.各组的FPLC检测结果如图9及表1所示表1.各组样本的流穿率与洗脱率
权利要求
1.一种肌红蛋白免疫吸附剂，其特征在于，它由固相载体和与之偶联的肌红蛋白多克隆抗体组成，所述肌红蛋白多克隆抗体是以钥孔虫戚血蓝蛋白和抗原肽交联形成的复合物为免疫原所得到的多克隆抗体，所述抗原肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID :No. 5所示。
2.如权利要求1所述的肌红蛋白免疫吸附剂，其特征在于，所述固相载体为树脂载体。
3.如权利要求1所述的肌红蛋白免疫吸附剂，其特征在于，所述固相载体为D-380树脂载体。
4.以权利要求1-3中任意一项所述的肌红蛋白免疫吸附剂作为吸附柱填料的肌红蛋白免疫吸附柱。
5.含有权利要求4所述的肌红蛋白免疫吸附柱的肌红蛋白免疫吸附装置，其特征在于，它还包括导管、血泵、空气监测器和静脉夹；所述导管依次连接血泵、肌红蛋白免疫吸附柱、空气检测器和静脉夹。
6.含有权利要求4所述的肌红蛋白免疫吸附柱的急救工具包，其特征在于，它还包括 导管、血泵、血管穿刺针、手套、敷料、碘伏和电池。
7.一种用于制备权利要求1所述的肌红蛋白免疫吸附剂中的肌红蛋白多克隆抗体的免疫原，其特征在于，它是由钥孔虫戚血蓝蛋白和氨基酸序列如序列表SEQ ID :No. 5所示的抗原肽交联形成的复合物。
8.如权利要求2或3所述的肌红蛋白免疫吸附剂，其特征在于，所述肌红蛋白免疫吸附剂是按照步骤如下的制备方法制成的a.将所述树脂载体用乙醇浸泡2 4小时，反复洗涤后，稀盐酸浸泡30分钟，将树脂载体激活；b.将所述肌红蛋白多克隆抗体与激活的树脂载体混合，15rpm下旋转反应2小时，使抗体与载体交联；c.反复洗去未与载体交联的抗体；d.加入ρΗ8·0的Tris缓冲液封闭过夜；e.用PBS洗涤，0.02% g/mL的叠氮钠4°C存放。
9.如权利要求4所述的肌红蛋白免疫吸附柱，其特征在于，所述肌红蛋白免疫吸附柱是按照步骤如下的制备方法制成的a.将所述吸附柱填料用双蒸水浸泡M小时，置于双蒸水中成为吸附柱填料水悬液；b.将层析柱垂直固定于架台，关闭层析柱下方出口，由上口灌入所述吸附柱填料水悬液；c.吸附柱填料水悬液灌注完毕后，继续灌入双蒸水至液面到达层析柱的上口，插入柱芯至柱芯下端与填料上表面平齐，固定柱芯；d.层析柱上口接恒流泵，放开下口，以2mL/min的流速冲洗；e.反向冲洗多次至层析柱中无气泡；f.改为正向冲洗，逐渐增加液相流速至20mL/min压柱；g.重新调整柱芯深度至其下端与填料上表面平齐后固定，再以20mL/min的流速恒流压柱30分钟；h.再调整柱芯深度至其下端与填料上表面平齐后固定，关闭下方出口，加入20vt%乙醇备用。
全文摘要
本发明公开了一种肌红蛋白免疫吸附剂，它由固相载体和与之偶联的肌红蛋白多克隆抗体组成，所述肌红蛋白多克隆抗体为以钥孔虫戚血蓝蛋白和抗原肽交联形成的复合物为免疫原得到的多克隆抗体，所述抗原肽的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.5所示。本发明还公开了以上述的肌红蛋白免疫吸附剂为填料的肌红蛋白免疫吸附柱，以及含有该肌红蛋白免疫吸附柱的肌红蛋白免疫吸附装置和急救工具包。本发明的免疫吸附剂及装置立足于便捷的血液灌流治疗模式，可实现肌红蛋白高度特异性的吸附，尤其适合应用于横纹肌溶解的现场救治。与血液透析或滤过模式相比较，全血灌流模式水电消耗较小，更易实现，更符合灾难事故现场救治的需要。
文档编号A61P21/00GK102526726SQ20101058851
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者周建辉, 孙雪峰, 张利, 陈香美 申请人:中国人民解放军总医院