以蛋白质降解途径为靶点的抗疟药物的制作方法

专利名称：以蛋白质降解途径为靶点的抗疟药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及以蛋白质降解途径为靶点的抗疟药物。具体而言，本发明涉及雷公藤红素或其衍生物在制备治疗疟疾用的药物中的用途。
背景技术：
对于蛋白质降解的研究人们最初集中在对动物消化蛋白质食物过程的理解。这是在细胞外发生的不需要消耗能量的过程。如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等参与这些细胞外蛋白质降解过程的蛋白水解酶一直是研究蛋白质的常用工具。对于发生在细胞内的蛋白质降解过程，在很长时间里人们关注的焦点是发生在溶酶体中的蛋白质的降解过程。 这是一种降解包括蛋白质、核酸、糖类和脂类等主要生物大分子的酸性环境下的水解酶作用的过程。对于发生在溶酶体中蛋白质降解，人们关心的是细胞内什么样的蛋白质被运输到溶酶体中，又是怎么被运送进去的等问题。
对于细胞内耗能性的(即依赖于ATP的)主动蛋白质降解过程，尽管在20世纪 50年代就已经被发现，但在很长时间里蛋白质降解方面的工作主要集中在溶酶体上，所以对这种发生在细胞内的能量依赖的蛋白质降解过程的机制长期都无进展。直到1977年， Goldberg及其同事在这个领域迈出了第一步。他们从不成熟的红血球及网状细胞中获得了一种提取液，这种提取液在催化异常细胞降解时需要ATP的参与。正是应用这种提取物， Ciechanover,Hershko,Rose在70年代晚期和80年代早期进行了一系列研究，分析清楚了参与这种蛋白质降解过程的各种蛋白质成分，揭示出细胞内耗能性的蛋白质降解的分子机制。
细胞内蛋白质水平的动态变化是细胞保持活力和进行生命活动的基本特征和必要前提。任何时间点，细胞内特定蛋白质的水平取决于其合成与降解过程之间的动态平衡。 蛋白质的适时降解代表蛋白质功能的一种终端调控。正常的蛋白质降解是细胞基本的生命过程所必需的。真核细胞中含有6000至30000个蛋白质合成基因，编码至少同等数量的蛋白质，主要有两种蛋白质降解途径一种是溶酶体途径，主要降解经胞吞细胞中的胞外蛋白质；另一种是非溶酶体途径，主要是通过细胞颗粒中的蛋白酶体降解泛素化的细胞内蛋白质。已有的研究发现，蛋白质降解途径的不正常会导致如癌症，神经退行性疾病等。
泛素存在于所有真核细胞中，是一种高度保守的76个氨基酸残基的蛋白质，游离存在或共价缀合到各种细胞浆、核及整合到膜蛋白上。生物体内泛素化过程主要由泛素连接酶催化完成。泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应 (Wolf DH, 2004)首先在ATP供能的情况下泛素激活酶El激活泛素，然后将其转移到泛素结合酶E2上通过硫酯键与E2的活性位点的半胱氨酸相连。E2可以在泛素连接酶E3的介导下将泛素转移到靶蛋白的赖氨酸残基上，进而完成对特异性蛋白质的泛素化标记。
蛋白酶体是一种分布在细胞核和细胞浆，具有糜蛋白酶样、胰蛋白酶样及caspase 样酶活性的蛋白酶复合体，是细胞降解内源性蛋白质的场所，对维持细胞正常生理功能具有极其重要的作用。蛋白酶体的组分通常根据它们的斯韦德贝里沉降系数(以“S”来标记)来命名。最普遍的蛋白酶体的形式是26S蛋白酶体，其分子量约为2000kDa，包含有一个20S核心颗粒和两个19S调节颗粒。核心颗粒为中空结构，包括一个由四个堆积在一起的环所组成的“核心”，核心中空，形成一个空腔。其中，每一个环由七个蛋白质分子组成。中间的两个环各由七个β亚基组成，并含有六个蛋白酶的活性位点。这些位点位于环的内表面，所以蛋白质必须进入到蛋白酶体的“空腔”中才能够被降解。外部的两个环各含有七个 α亚基，可以发挥“门”的作用，是蛋白质进入“空腔”中的必由之路。这些α亚基是由结合在它们上的“帽”状结构(即调节颗粒)进行控制；将核心颗粒的两端敞开，目的蛋白质就可以进入“洞”中。核心颗粒的每一端都连接着一个19S调节颗粒，每个调节颗粒都含有多个ATP酶活性位点和泛素结合位点；调节颗粒可以识别多泛素化的蛋白质，并将它们传送到核心颗粒中，启动降解过程。包括泛素化和蛋白酶体降解的整个系统被称为“泛素-蛋 (Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP) ”。
泛素-蛋白酶体途径是细胞质和细胞核内依赖ATP不同于溶酶体途径的蛋白质降解通路，80%以上的细胞内蛋白质，包括调节细胞周期的多种蛋白的降解均由此途径完成。 通常蛋白酶体只识别和降解被泛素化的蛋白。泛素连接酶E3对靶蛋白的特异性识别起关键作用。酵母细胞中大约有30多种E3连接酶，人类细胞中大约有600多种。许多功能筛选试验发现E3连接酶调控了众多的生命过程。但是这些E3连接酶是通过调控哪些底物进而影响这些生命过程的却不为人知，介导许多生命活动中的关键蛋白的降解也少见报道。现阶段，蛋白质降解领域所面临的最大挑战就是理解在特殊的细胞环境中蛋白质组是如何被重构的以及如何确立E3连接酶与其底物的对应关系。
对蛋白质降解过程的研究近年来已经发展成为现代生物学的一个非常重要的研究领域。这是因为所有的蛋白都必须被适时的降解，细胞的基本的生命过程例如细胞周期的进行才得以成为可能。无数的证据表明，许多受到损伤的或者折叠错误的蛋白也都必须被降解掉，否则正常的细胞功能就会受到影响，从而导致如癌症，神经退行性疾病等。很多疾病的病理过程都与蛋白质降解途径的不正常有关，许多肿瘤细胞与病毒也是利用泛素蛋白酶体系统扰乱蛋白质的降解，从而达到肿瘤细胞的扩散或对宿主细胞的入侵。泛素-蛋白酶体通路不仅是一种去除错误折叠的蛋白质的重要机制之一，而且还参与调节细胞周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原呈递、细胞增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程。泛素-蛋白酶体通路的异常与诸多疾病如恶性肿瘤、神经变性疾病、遗传性疾病、炎症、心肌病有关。阐明泛素-蛋白酶体通路将有助于制定治疗这些疾病的新策略。
目前许多影响蛋白质降解途径的药物已经或正在发展之中。已有的研究结果和临床试验的数据都显示这类药物对很多目前难以治愈的疾病都具有极高的潜在药用价值。蛋白酶体抑制剂对于人工培养的细胞具有有效的抗肿瘤活性，通过降解受调控的促生长细胞周期蛋白来诱导肿瘤细胞的凋亡。研究表明肿瘤细胞比正常细胞更依赖泛素-蛋白酶体系统，使得肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂更为敏感。在肿瘤的发生上，相当值得注意的即是和转录因子NF-kB有关的细胞转录过程。NF-kB的活性在免疫细胞以及肿瘤细胞常常很活跃，在正常情况下细胞内多余的NF-kB会在细胞质中和一种抑制性蛋白质IkB结合，而无法进入细胞核中表现其功能。但在癌细胞中，磷酸化的IkB会和泛蛋白结合而被蛋白酶体所辨识及分解，因此NF-kB就可以进入细胞核中，进一步启动许多与细胞周期进展及抗凋亡因子 (anti-apoptotic factors)产生有关的基因，使肿瘤细胞得以进一步增殖、壮大。但当使用4蛋白酶体抑制剂(如bortezomib)后，IkB被蛋白酶体破坏的程度减少，因此NF_kB就会一直处于和IkB结合的状态，无法进入细胞核中发挥其转录功能，因而抑制癌细胞的生长，并促进其凋亡。
小分子蛋白酶体抑制剂通常是通过其COOH端的反应基团利用蛋白酶体亚基独特的催化机理来实现其特异性的类肽物。例如经常使用到的研究试剂 MG-132(Z-Leu-Leu-Leu-al)是一种肽醛，它可以可逆性抑制蛋白酶体的糜蛋白酶位点，在高浓度时也能抑制溶酶体的自溶酵素。抑制剂的其他种类可以对蛋白酶体抑制达到更高的特异性和药效，例如肽硼酸盐(P印tide boronates)，乳胞素和印oxomcin，可作为药物研发选择。
化合物PS341/BorteZomib是一种二肽硼酸衍生物，这是一种缓慢作用于糜蛋白酶位点的可逆抑制剂，可强烈而可逆地抑制蛋白酶体的功能，导致一些本应被清除的蛋白质在细胞内大量堆积，进而引起细胞凋亡。硼替佐米(Bortezomib)是第一种用作化学治疗药物的蛋白酶体抑制剂，由千年制药公司(Millennium Pharmaceuticals)开发，市场名称为Velcade，2003年被美国食品药品监督管理局(the Food and Drug Administration, FDA)批准用于治疗复发、难治性多发性骨髓瘤(multiple myeloma)病人。数据显示PS-341 可靶向作用于细胞内蛋白酶体的亚基(β 5和β )及相应的免疫蛋白酶体组分(i3 5i和 β Ii)，抑制其活性，从而抑制蛋白酶体功能，值得一提的是，多发性骨髓瘤会导致血清中蛋白酶体水平的提高，而成功的化疗可以将蛋白酶体的水平恢复到正常范围，在临床上硼替佐米治疗多发性骨髓瘤可显著延长患者生存期。动物研究显示硼替佐米可能对死亡率极高的胰腺癌也有显著的临床效果。对于硼替佐米在治疗B细胞相关癌症的临床前和早期临床研究已经开始，特别是一些类型的非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma) 0 PS341/ Bortezomib在临床试验的巨大成功说明蛋白酶体是一个可靠并且有效的肿瘤治疗新靶点。
利托那韦(ritonavir)，市场名称为Norvir，是用于治疗艾滋病的一种蛋白酶抑制剂。近期的研究发现，利托那韦不仅可以抑制蛋白酶，对蛋白酶体也有抑制作用，特别是对类胰凝乳蛋白酶型的蛋白酶体，但对类胰蛋白酶的蛋白酶体则有部分的促进作用。对于动物模型的研究表明利托那韦可能对神经胶质瘤(glioma)细胞的生长有抑制作用。
将蛋白酶体抑制剂应用于自体免疫性疾病也大有前景。目前这一方面的研究主要是利用动物模型来进行。例如，在对植有人类皮肤的小鼠的研究中发现，用蛋白酶体抑制剂处理过后，原本因患牛皮癬而受损的皮肤所有减少；在一些啮齿动物模型中发现，蛋白酶体抑制剂对于哮喘也有一定的治疗作用。
蛋白酶体抑制剂在临床上的成功不仅给病人以希望，它更提出了一种观念，通过调整泛素-蛋白酶体通路能达到治疗的效果。药物研究发现已经向抑制E3连接酶引起的底物泛素化及DUBs (去泛素化酶)催化的逆反应方面发展。重点是辨别并证实，在数以百计的E3s或DUBs中存在的新靶点。进一步弄清它们的反应机制和底物特异性。针对这些混合物筛选并设计小分子抑制剂。鉴于基础和应用研究中对UPS领域的活性的开发，我们有理由期待，就像几十年前的蛋白激酶一样，或者更为激动人心的时刻就要到来——药物研发定位于蛋白降解。
疟疾是严重危害人类健康的疾病之一，也是全球最为严重的公共卫生问题之一。 疟疾是一种由疟原虫造成的，通过疟蚊传播的全球性急性寄生虫传染病。临床以周期性寒战、发热、头痛、出汗和贫血、脾肿大为特征。疟疾患者多呈现高热发烧症状，由于早期迹象与流行性感冒有相似之处，许多对该疾病不熟悉的外来旅游者容易将疟疾误认为感冒，从而因为没有得到及时的药物治疗而使得病情恶化。疟原虫生活周期具有很明显的生理节奏，这使得病患的发烧症状呈现周期性反复的特征。举例来说，因为间日疟原虫 (Plasmodium falciparum)导致的疟疾发热周期为48小时。疟疾患者常有的其他症状包括疟原性贫血，酸毒症，呼吸窘迫等等。如果疟原虫侵入脑部血管，则会导致最为严重的脑部疟疾，这通常会造成病者昏迷。按照疟疾病征的严重程度不同，疟疾可以分为非重症疟疾 (uncomplicated malaria)禾口重症症疾(complicated /severe malaria)，會邑有效治疗这两类疟疾的药物不太相同。如果没有得到及时和有效的治疗，疟疾患者的死亡率会非常高。
疟原虫属(Plasmodium)是一类单细胞、寄生性的原生动物。感染人的疟原虫主要有恶性疱原虫(Plasmodium falciparum)、间日疱原虫(Plasmodium vivax)、卵形疱原虫 (Plasmodium ovale)及三间疟原虫(Plasmodium malariae)，大部分疟疾的死亡是由恶性 _原虫(Plsamodium falciparum) $) 白勺。
寄生于人体的4种疟原虫生活史基本相同，需要人和按蚊二个宿主。在人体内先后寄生于肝细胞和红细胞内，进行裂体增殖(schizogony)。在红细胞内，除进行裂体增殖外，部分裂殖子形成配子体，开始有性生殖的初期发育。在蚊体内，完成配子生殖 (gametogony)，继而进行孢子增殖(sporogony)。疟原虫可通过表膜的渗透或经胞口以吞饮方式摄取营养。在肝细胞内寄生的红细胞外期疟原虫，以肝细胞的胞质为营养。
据世界卫生组织(WHO)统计，目前世界上仍有90多个国家为疟疾流行区，处于疟疾疫区的人数达到22亿，超过世界人口的三分之一。世界范围内，仅是呈现临床症状的患者病例每年就在3亿到5亿之间，而每年因患疟疾而死亡的人数则则在100万到300万之间，这其中大部分为儿童。儿童、孕妇、旅游者和各地的新移民对本地流行的疟原虫免疫力较差，故是易患疟疾的高危人群。疟疾主要的流行地区是非洲中部、南亚、东南亚及南美北部的热带地区，这其中又以非洲的疫情最甚。就中国而言，疟疾主要的流行地带为华中华南的丛林多山地区，但疫情远较非洲为轻。
1946年DDT杀灭成蚊的试验取得成效后，使得消灭疟疾成为可能，1955年第8届世界卫生大会把以前的控制疟疾策略改为消灭疟疾策略，随着时间的推移，人们发现利用杀虫剂消灭媒介按蚊面临着越来越多的问题，诸如耐药蚊种的出现，杀虫剂造成的环境污染以及生态平衡等问题，终使全球灭疟规划受到严重挫折。1978年第31次世界卫生大会决定放弃全球限期灭疟的规划，把对疟疾的防治对策改回到控制的策略。
目前各国对于疟疾的控制主要采取预防和治疗并举的方式。预防包括个体预防和群体预防。预防措施有蚊媒防制和预防服药。蚊媒防制包括杀灭蚊和使用蚊帐及驱蚊剂。 预防服药是保护易感人群的重要措施之一。常用的预防性抗疟药有氯喹(chloroquine)， 对抗氯喹的恶性疟，可用哌喹(piperaquine)或哌喹加乙胺嘧啶(pyrimethamine)或乙胺嘧啶加伯氨喹啉(primaquine)。不论个体或群体进行预防服药，每种药物疗法不宜超过半年。疟疾治疗应包括对现症病人的治疗(杀灭红细胞内期疟原虫)和疟疾发作休止期的治疗(杀灭红细胞外期休眠子)。休止期的治疗是指在疟疾传播休止期，对1 2年内有疟疾史和带虫者的治疗，以控制间日疟的复发和减少传染源。按抗疟药对疟原虫不同虫期的作用，可将其分为杀灭红细胞外期裂子体及休眠子的抗复发药，如伯氨喹啉；杀灭红细胞内裂体增殖期的抗临床发作药，如氯喹、咯萘啶(pyronaridine)、青蒿素(artmi sinin)类和杀灭子孢子抑制蚊体内孢子增殖的药，如乙胺嘧啶。磷酸氯喹(Chi oropui ne phosphate)简称氯喹，该药吸收快且安全，服后1 2小时血浓度即达高峰；半衰期120小时；疗程短；毒性较小，是目前控制发作的首选药。该类药还有羟基哌基(Hydroxypiperaquine)及磷酸羟基喊Rf (Hydroxypiperaquine phosphate)。it酸查宁(Quinine sulfate)系金鸡 内丰对皮中的一种生物碱，抗疟作用与氯喹大致相同，除较迅速杀灭红内期原虫外，还有退热作用。硝喹(Nitro quinum,CI679)对各种疟疾及抗氯喹虫株均有效。青蒿素，该药作用于原虫膜系结构，损害核膜、线粒体外膜等而起抗疟作用，其吸收特快，很适用于凶险疟疾的抢救。
在全球控制疟疾的过程中，疟原虫——特别是恶性疟原虫抗药性的产生是疟疾流行不断死灰复燃的一个重要原因。20世纪50年代在泰国和哥伦比亚同时发现恶性疟原虫对氯喹(chl0r0quine，CQ)产生抗性[21，22]后以来，对多种抗疟药具有抗药性的恶性疟原虫迅速出现并扩散，成为全球疟疾控制面临的最大挑战之一，除了海地岛和西南亚的部分地区外，其抗性几乎遍布全球。氯喹作为一种高效、廉价的抗疟药，因其良好的安全性和耐受性曾在临床上发挥重要作用，但抗药性的产生限制了其使用。青蒿素类复方药作为各国抗击疟疾的保留用药，曾被认为是“治疗疟疾的最大希望”。然而，2008年在泰国和柬埔寨边境首次发现，恶性疟原虫对青蒿素类药物产生了耐药性。
因此，发现针对新靶标和新作用机制的抗疟药物和发展新的治疗疟疾的策略具有重要的现实意义。疟疾疫苗就是正在发展中有重大应用前景的抗疟策略。在抗疟小分子化合物筛选上，2009年，中国科学院上海药物研究所蒋华良课题组与华东理工大学药学院李洪林、李剑和德国吕贝克大学RolfHilgenfeld教授等合作，在解析出恶性疟原虫半胱氨酸蛋白酶falcipain-2的晶体结构后，综合运用计算药物设计、药物化学和分子生物学方法和技术，发现了 20余个活性及多样性较好的falcipain-2非肽类小分子抑制剂。近年来， 以蛋白质降解途径为靶点的抗肿瘤药物的开发正逐渐兴起。考虑到蛋白质降解过程在生物体生命活动过程中的重要作用，并且疟原虫作为红细胞内寄生虫，其生长繁殖所需包括氨基酸在内的营养物质更多依赖宿主血红蛋白等蛋白质降解，因此蛋白质降解途径对其生命活动有很大的影响，而该过程中有很大的可能发现能够用于抗疟药物开发的新靶点。发明内容
本申请提供雷公藤红素或其衍生物在制备治疗疟疾用的药物中的用途。
在一个具体实施方式
中，所述衍生物选自下式II
权利要求
1.雷公藤红素或其衍生物在制备治疗疟疾用的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述衍生物选自下式II其中 η = 10 20，m = 2n+l,2n-l 或 &1-3。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述衍生物选自雷公藤红素十六醇酯、雷公藤红素十醇酯、雷公藤红素十八醇酯、雷公藤红素十二醇酯和雷公藤红素二十醇酯。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述衍生物选自雷公藤红素甲酯、雷公藤红素苄酯、雷公藤红素环氧丙酯和雷公藤红素酰胺。
5.雷公藤红素或其衍生物在制备用于抑制蛋白酶体的药物中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途为制备用于抑制疟原虫的蛋白酶体的药物的用途。
7.雷公藤红素或其衍生物在制备用于抑制疟原虫用的药物中的用途。
8.如权利要求5 7中任一项所述的用途，其特征在于，所述衍生物选自下式II其中 η = 10 20，m = 2n+l,2n-l 或 &1-3。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述衍生物选自雷公藤红素十六醇酯、雷公藤红素十醇酯、雷公藤红素十八醇酯、雷公藤红素十二醇酯和雷公藤红素二十醇酯。
10.如权利要求5 7中任一项所述的用途，其特征在于，所述衍生物选自雷公藤红素甲酯、雷公藤红素苄酯、雷公藤红素环氧丙酯和雷公藤红素酰胺。
全文摘要
本发明涉及以蛋白质降解途径为靶点的抗疟药物。具体而言，本发明涉及雷公藤红素或其衍生物在制备治疗疟疾用的药物中的用途，以及所述雷公藤红素或其衍生物在制备抑制蛋白酶体用的药物中的用途。本申请也涉及含有雷公藤红素或其衍生物的药物组合物。
文档编号A61K31/56GK102526067SQ20101059625
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月20日 优先权日2010年12月20日
发明者眭飞, 胡荣贵 申请人:中国科学院上海生命科学研究院