专利名称：红色诺卡氏菌细胞壁骨架增强树突状细胞功能的方法
技术领域：
本发明涉及免疫治疗领域。具体而言，本发明涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架的免疫调节的方法。
背景技术：
红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为一种免疫调节剂可以有效调动和激活机体的树突状细胞，树突状细胞是机体免疫系统中专职的抗原递呈细胞，是启动机体特异性免疫的关键细胞。1、树突状细胞的作用在机体免疫系统中树突状细胞是一个很重要免疫信号传递细胞，对于特异性免疫系统的启动担负专职的免疫信号传递作用，在特异性免疫中T细胞是定向清除病原体的重要的免疫细胞，但是T细胞的活化必须依赖树突状细胞的免疫信号传递作用，所以树突状细胞是免疫系统中的关键细胞，关系到机体特异性免疫功能有效发挥的成败。近几年，业内专业人士关注的目光转向了人体免疫系统的研究，人们更注重对于免疫功能低下的原因的分析，进而注意到树突状细胞的功能作用弱化的现象，如树突状细胞呈现个体小、树突少、细胞分布密度低等现象，人们认识到树突状细胞不发挥作用是免疫功能低下的重要原因。因此国内外争相开发各类树突状细胞疫苗，广泛用于增强树突状细胞的功能，其设计思想是通过树突状细胞功能的增强，进而启动特异性免疫功能。到目前为止，临床上仍然没有理想的针对树突状细胞功能的免疫调节剂，各项树突状细胞疫苗的开发研究也没有通过临床试验。因此，有效激活和调动树突状细胞的功能仍是一个业内共同的研究课题，人们期待一个能有效的激活和调动树突状细胞功能的新的制剂诞生。2、临床上相关的适应症目前，临床上许多疾病的原因就是机体的免疫功能低下，而免疫功能的低下都与免疫系统不能正常发挥细胞免疫作用有关，而且免疫系统没能发挥细胞免疫作用又与树突状细胞不能正常发挥正常免疫信息传递作用有关。目前人体大部分的肿瘤的发生，都与机体树突状细胞功能减弱有关，由于树突状细胞功能的弱化，使得机体的特异性免疫功能不能有效启动。因为树突状细胞功能的弱化，使得病原体的信号不能通过树突状细胞有效的传递给T细胞，因此导致T细胞不能被激活而发挥作用。而体内的肿瘤主要依靠T淋巴细胞的清除作用，才能有效控制肿瘤的发展。因此， 可以说临床上肿瘤的发生和发展，与机体的免疫系统中的树突状细胞的功能正常与否有关。所以，临床上有关预防肿瘤发生和控制肿瘤发展的关键，就是能否有办法调动和激活树突状细胞的功能，这已经成为临床上的焦点难题。
3、临床上的现状针对肿瘤的免疫治疗是继手术、放疗、化疗之后第四种治疗肿瘤的新方法。肿瘤的免疫治疗是当前的研究热点，树突状细胞与肿瘤的发生和发展有关联，若患者体内树突状细胞功能缺陷或低下，不能有效递呈肿瘤抗原，无法激活特异性免疫T细胞，则导致机体免疫无能和免疫耐受，使得肿瘤得以发生和发展。树突状细胞的不成熟状态，不能有效提呈抗原，成为能否有效启动特异性免疫的关键环节。目前，人们主要采用开发树突状细胞疫苗的方法，用以解决树突状细胞功能弱化的问题。许多实例证明，由树突状细胞激活的T细胞在抗肿瘤免疫过程中起主导作用。以树突状细胞为基础的免疫治疗将来会成为未来抗肿瘤治疗的主要手段之一。本领域的主流研究方向是寻找能够在体内外运用，相容性好，更安全和高效的抗肿瘤树突状细胞疫苗方式。与火热的研发疫苗的情况对比；还没有特定的药物能够用来调动和激活树突状细胞。4、树突状细胞疫苗应用及存在的问题以树突状细胞为基础的肿瘤疫苗成为肿瘤免疫治疗的新策略和主攻方向。通过体外负载树突状细胞，回输体内免疫治疗策略；体内致敏树突状细胞的策略在树突状细胞疫苗应用中，收到很多疗效，但是也遇到许多问题①、体外培养易于污染；②、体外培养成本高；③、容易引发自身免疫性疾病；④、 药效不稳定；⑤、尚待寻找最佳的制备方法；⑥、继续筛选理想的肿瘤抗原负载的方式；⑦、 技术难度较大；⑧、大规模培养制备有难度；⑨临床治疗方案差异性大；⑩、瘤苗回输注意避免T细胞耗竭；树突状细胞肿瘤疫苗已经显示出来广阔的临床应用前景，将会是一种很有前途和使用价值的抗肿瘤策略。但同时也应该看到，当前研究的树突状细胞抗肿瘤疫苗远远没有达到人们期待的效果，尚处于临床试验阶段，主要是许多重要的分子免疫机制如治疗免疫逃逸、免疫耐受、细胞毒T细胞(CTL)活性降低、或无反应，以及树突状细胞递呈抗原时所受周围环境的影响，等问题有待深入研究和阐明。另外，如何寻找最佳的树突状细胞制备的方法选择最佳的树突状细胞成熟和激活的状态及肿瘤抗原的负载的方法等问题目前还没有公认的答案。总之，树突状细胞疫苗尚未达到人们的理想要求，仍处于临床试验阶段，树突状细胞疫苗的研发还属于未成熟状态。
发明内容
通过多次生物等效性实验，发明人发现作为生物制剂的红色诺卡氏菌细胞壁骨架可以有效调动和活化树突状细胞，树突状细胞是机体免疫系统中专职的递呈细胞，树突状细胞能否活化对于启动机体特异性免疫非常重要。因此这一实验结果可以说明红色诺卡氏菌细胞壁骨架通过激活和调动树突状细胞，进而有利于树突状细胞发现和识别致病抗原并加以处理，因此更利于活化T细胞，使人体的特异性免疫更易于被有效激活。本发明的实验结果说明，红色诺卡氏菌细胞壁骨架可以明显增加树突状细胞的密度和迅速改善树突状细胞的形态和功能，使树突状细胞处于激活状态。
红色诺卡氏菌细胞壁骨架作用人体后，能够有效激活和强化树突状细胞的功能， 进而利于调动人体特异性免疫功能，使得T细胞易于被激活，促使人体细胞免疫系统的活化，引起人体特异性免疫抗肿瘤免疫应答。红色诺卡氏菌细胞壁骨架通过纠正机体免疫缺陷，启动患者自身特异性肿瘤杀伤机制，依靠激活自身的免疫功能清除肿瘤细胞。红色诺卡氏菌细胞壁骨架这一活化树突状细胞作用的发现，填补了临床上对于树突状细胞功能低下症状没有安全有效治疗药物的空白，结束了医生们面对众多树突状细胞功能低下的患者尚无良策的尴尬局面，使人们针对免疫低下的病症有了新的治疗手段。
因此，本发明一方面涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备用于调节哺乳动物树突状细胞功能的免疫制剂中的用途，其中所述的调节包括红色诺卡氏菌细胞壁骨架激活、调动和增强哺乳动物机体树突状细胞的功能。本发明所述的哺乳动物包括人。本领域已知许多疾病与树突状细胞功能低下有关，例如，通过本发明红色诺卡氏菌细胞壁骨架治疗的树突状细胞功能低下病症。在本发明涉及的用途中，树突状细胞可以是朗格汉斯细胞。在本发明涉及的用途中，所使用免疫制剂的有效量可以由本领域技术人员根据需要确定，例如所需免疫制剂的剂量可以为5ug-1200ug。在本发明涉及的用途中，免疫制剂可以通过体内、皮下或者接触途径给药，优选为与皮肤和/粘膜接触给药。在本发明涉及的用途中，免疫制剂可以包含药学上可接受的载体或赋形剂。本领域技术人员所知的任何适当的载体或赋形剂都可用于本发明。优选地，可使用的赋形剂包括冻干剂型、乳膏剂型或者擦剂。本发明还涉及一种调节哺乳动物树突状细胞功能的方法，包括向哺乳动物直接使用有效剂量的红色诺卡氏菌细胞壁骨架，其中所述的调节包括红色诺卡氏菌细胞壁骨架激活、调动和增强哺乳动物机体树突状细胞的功能。因此，本发明的内容涉及下述方面1、通过红色诺卡氏菌细胞壁骨架的作用体内和皮肤以及粘膜，使得机体树突状细胞全面被激活，进而使机体的免疫功能大为加强；2、树突状细胞功能的增强体现在，树突状细胞的密度增大，树突状细胞的形态改变成激活状态；3、通过树突状细胞功能的增强，使得机体的特异性免疫功能的启动有了良好的基石出；4、在红色诺卡氏菌细胞壁骨架作用机体过程中，药物为微克级，安全可靠迅速发生作用；本发明具有下述特点1、红色诺卡氏菌细胞壁骨架微量成分作用机体后，能够几个小时后迅速有效激活树突状细胞，用药后药效反应迅速；2、在红色诺卡氏菌细胞壁骨架微量成分的作用下，机体的树突状细胞的密度明显增加，树突状细胞形态展开饱满，树突状细胞能够被充分激活；
3、红色诺卡氏菌细胞壁骨架适量成分作用机体过程中，机体无毒副作用，显示良好的安全性；4、红色诺卡氏菌细胞壁骨架在临床上应用操作简便，方便患者使用。
图1 朗格汉斯细胞染色图。a为288X，b为1152X。图2 纳可佳组给药小鼠和右旋糖酐对照组小鼠朗格汉斯细胞图。图3 纳可佳组和右旋糖酐组对小鼠耳部LC细胞的影响折线图。
具体实施例方式试验材料1.药品红色诺卡氏菌细胞壁骨架(纳可佳)，来源辽宁纳可佳生物制药有限公司，批准文号国药准字S20030009。2.动物:6 8周健康雌性BALB/c小鼠，SPF级，14只，体重(20士2) g。来源北
京云菱动物繁育厂。3.鼠抗人HLA-DR，250 μ 1编号ΖΜ-0136，北京中杉金桥生物技术有限公司生产。4.鼠ABC试剂盒l/4kit，北京中杉金桥生物技术有限公司(美国VECTOR公司)。5.兔抗人 HLA-DR (Rabbit Anti-HLA-DR)，0. 2ml，编号 BS-1198R，北京博奥森生物技术有限公司。6.兔免疫组化染色试剂盒dml，编号SP-0023，北京博奥森生物技术有限公司。7.大鼠抗人 HLA-DR，0. 25ml，编号 MCA71R，serotec 公司生产。8.生物素化兔抗大鼠IgG(H+L)，编号观_2040，北京中杉金桥生物技术有限公司生产。9. AEC酶底物试剂盒anl，编号zli-9036，批号K106718A，有效期08Λ011，北京中
杉金桥生物技术有限公司。10. PBS缓冲液2000ml/袋，北京中杉金桥生物技术有限公司。11. GVA封片剂5ml，编号ζ 1 i-9051，批号P92304H，有效期07/2011，北京中杉金桥生物技术有限公司。试验设计本发明的验证思路是利用生物等效性的原则，采用动物实验的方式，发明人选择了中国医科大学国家重点学科实验室的实验方法，通过多次多组小鼠体内实验，经过先进的检测手段检测和科学的统计计算方法的计算，证明红色诺卡氏菌细胞壁骨架可以调动和激活树突状细胞的效能。动物试验方案和步骤实验方案的思路和设计原则采用小白鼠进行生物等效性实验，随即分成若干个实验组和两个对照组，参照专业论文的相关实验方法，结合发明人自身实验的特点，制定验证本发明的动物实验方案。实施例1试验步骤
1.分组取3只小鼠随机分为三组并编号，即空白组(1号)、20yg纳可佳组O 号)及右旋糖酐赋形剂对照组(3号)。1号、3号采用一抗和二抗(大鼠抗人HLA-DR)，2号一抗为采用兔抗人HLA-DR。2.操作步骤取空白组小鼠1号，根据小鼠真表皮分离的方法进行操作，将真皮和表皮分离。2 号和3号小鼠分别注射0. 2ml纳可佳溶液和0. 2ml右旋糖酐40溶液，于第二天进行剪耳分离，并进行免疫组化染色，镜检。小鼠真表皮分离①乙醚麻醉小鼠，剪下耳朵的一部分。②用刀片刮除表面的皮脂和皮屑，PBS反复冲洗3-5次。③用镊子分开鼠耳的皮肤。刀片刮除软骨，并切成0. 5cmX0. 5cm小块。④加入EDTA分离液(PH7. 2)中37°C水浴，SOmin后取出皮片将真表皮分开，留表皮备用。3.抗体标记①丙酮室温固定表皮4°C，20min, PBS冲洗5min，2次；②表皮放入含1 100大鼠抗人HLA-DR(2号为兔抗人HLA-DR)抗体的微量离心管内摇动，4°C过夜；③取出表皮，PBS冲洗5min，2次，放入含1 50的生物化的兔抗大鼠IgGQ号为山羊抗兔IgG)抗体的微量离心管内，孵育1. 5h后，PBS冲洗5min，2次；④表皮放入加辣根酶标记链酶卵白素微量离心管内，孵育60min，PBS冲洗5min，2 次4.免疫组化染色(按照AEC试剂盒使用)染色前，分别将123号试剂各50 μ 1加入到已盛有Iml蒸馏水的微量离心管，避光保存，30min内有效。①室温下，小心在载玻片加上100μ 1的染色工作液，放入表皮(真皮面向上)，使其浸入工作液中。②室温下孵育10至20min，或直至样本出现红色。③移去表皮上的染色工作液。④室温下，将玻片置入50ml自备的PBS缓冲溶液中浸泡⑤移去表皮上的PBS缓冲溶液
⑥风干后甘油明胶封片。。⑦即刻在光学显微镜下观察阳性呈现红色。实施例2试验步骤1.分组取8只小鼠随机分为二组并编号，S卩40 μ g纳可佳组(1-6号)及右旋糖酐赋形剂对照组(1-2号。)2.操作步骤纳可佳组注射0. 2ml40 μ g/ml的纳可佳溶液，右旋糖酐对照组注射0. ^113%的右旋糖酐40溶液，具体给药和取耳染色时间见下表
权利要求
1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备用于调节哺乳动物树突状细胞功能的免疫制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的调节包括红色诺卡氏菌细胞壁骨架激活、 调动和增强哺乳动物机体树突状细胞的功能。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的树突状细胞包括朗格汉斯细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于所述的免疫制剂的剂量为 5ug-1200ug。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其特征在于所述的免疫制剂通过体内、皮下或者接触途径给药。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其特征在于所述的免疫制剂包含药学上可接受的载体或赋形剂。
7.根据权利要求6的用途，其特征在于所述的赋形剂包括冻干剂型、乳膏剂型或者擦剂。
8.调节哺乳动物树突状细胞功能的方法，包括向哺乳动物直接使用有效剂量的红色诺卡氏菌细胞壁骨架。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的调节包括红色诺卡氏菌细胞壁骨架激活、 调动和增强哺乳动物机体树突状细胞的功能。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述的树突状细胞包括朗格汉斯细胞。
全文摘要
本发明涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架增强树突状细胞功能的方法。发明人发现红色诺卡氏菌细胞壁骨架可以有效调动和活化树突状细胞，通过树突状细胞抗原提呈功能的强化，进而利于树突状细胞识别致病抗原并传递抗原信息，有利于活化T细胞，促使人体的特异性免疫被有效激活。因此，红色诺卡氏菌细胞壁骨架可用于制备治疗机体树突状细胞功能低下病症的免疫制剂。本发明通过红色诺卡氏菌细胞壁骨架活化树突状细胞，为治疗树突状细胞功能低下病症提供了安全有效的免疫调节剂。
文档编号A61K35/74GK102526119SQ20101060869
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者张策, 张紫真, 张红阳, 张轶, 洪晓明 申请人:辽宁纳可佳生物制药有限公司