用于治疗肌肉损伤的方法

专利名称：用于治疗肌肉损伤的方法
用于治疗肌肉损伤的方法本申请是申请号为“01819946. 1”，发明名称为“用于治疗肌肉损伤的方法”的发明 专利申请的分案申请。
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本发明涉及用于治疗肌肉损伤的方法。本发明特别涉及通过给受损的肌肉施用神 经毒素而对该受损的肌肉进行治疗的方法。肌肉损伤包括骨骼肌的急性损伤如挫伤(撞伤)、裂伤、局部缺血、扭伤、以及完 全破裂。这些损伤可造成巨痛并且可以使患者丧失能力，使之不能工作或甚至使之不能进 行正常的日常活动。在骨骼肌的急性损伤中，最常见的是扭伤(也被称为拉伸而产生的损 伤)。例如，在由职业或运动医学专职人员所治疗的所有损伤中，扭伤占到高至30%的水 平。Garrett 等人，Am J Sports Med, 24 (6) :S2-S8,19960肌肉扭伤性损伤的特征为肌-腱单元的破坏。该肌-腱单元的破坏可以发生在肌 肉的任何部分。这种类型的损伤最常见地发生在环绕着两个关节运转的浅层肌肉的肌腱接 点(MTJ)附近，如大腿直肌、半腱肌和腓肠肌。离奇的运动、或肌肉的异常应用都可以导致肌肉扭伤。例如，离心收缩使用较少的 活性运动单元来产生较高的力量。在该类情况中，在拉伸期间，过度延伸的肌肉单元经受了 过度的拉力。该过度的拉力可以造成该肌肉收缩部件微观上的损害，集中表现为Z-线的随 机破坏。当肌肉受到损害时，患者可能会经受一种延迟发作的肌肉痛苦，其特征为疼痛、无 力以及活动范围受到限制。该疼痛在肌肉损伤后约1至2天最为强烈，而活动范围受到限 制的情况可持续一周或更长的时间。如果对骨骼肌的轻微扭伤进行了不恰当的处理，则可 能会发生更为严重的损伤。以损伤的严重程度和血肿的性质为基础，有三种类别的肌肉扭伤(1)轻度(一 度)扭伤；少数肌肉纤维撕裂；不丧失力量或最低程度的丧失力量和限制活动的轻微肿胀 和不适；( 中度(二度)扭伤；力量明显丧失的肌肉纤维的更大损害，和C3)严重(三度) 扭伤；横跨整个肌腹的撕裂，使得肌肉功能全部丧失。在肌肉扭伤期间肌内血管的撕裂常常可以导致大量的血肿。在受损肌肉中存在两 种不同类型的血肿肌内的和肌间的血肿。第一种类型，肌内的血肿，在规模上被限制于完 整的肌肉筋膜内。其中血液的外渗增加了肌内的压力，压缩并限制了该血肿的大小。该类血 肿产生疼痛并使肌肉丧失功能。第二种类型，肌间的血肿，当肌肉筋膜破裂时形成，并且外 渗的血液散布到肌间的空间中而不会显著增加肌肉内的压力。如果肌肉内的压力不增加， 则这种类型的血肿不会造成明显的疼痛。对于扭伤性损伤的治疗而言，关键在于将受损的肌肉进行固定，尤其是在损伤后 的前两至三天内要对受损的肌肉进行固定，这是因为在损伤后受损肌肉的立即活动常常会 造成最初损伤部位的再破裂。再破裂可以导致更严重的损伤、延迟愈合并使组织形成瘢痕。 Jarvinen 等人，Curr Opin Rheumatol，第 12 卷155-161 Q000)。通过对受损肌肉进行固定可以避免被损害部位的再破裂，优选在损伤后立即进行 固定。固定可以使得新形成的肉芽组织获得足够的拉力以抵制由可收缩的肌肉所产生的力fio用于固定受损/扭伤肌肉的一种公知的方法需要使用物理学上的约束物或管状 物。例如，可以使用一种颈圈来固定受损颈部的屈肌或伸肌。但是，约束物的应用常常很麻 烦并且不舒服。此外，对于某些肌肉群的损伤而言，使用物理学上的约束物是不实际或不可 能的。例如，很难用一种约束物来固定扭伤的上斜方肌或最大的臀肌。肉毒杆菌毒素厌氧的、革兰氏阳性菌肉毒梭菌可产生一种有效的多肽神经毒素一肉毒杆菌毒 素，其在人和动物中可造成一种被称为肉毒中毒的神经性麻痹疾病。在土壤中发现了肉毒 梭菌的芽孢并且其可以在灭菌和密封不当的家用罐头食品容器中进行生长，其为很多肉毒 中毒事件的原因。肉毒中毒的结果一般在食用了被肉毒梭菌培养物或芽孢所感染的食品后 18至36小时显现出来。该肉毒杆菌毒素显然可不被减弱的通过肠的内层并攻击外周的运 动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的症状可以从行走、吞咽、以及说话困难发展为呼吸肌麻痹和 死亡。对于人而言，A型肉毒杆菌毒素(“BoNT/A”)是已知的最致命的天然生物学神经 毒素。肉毒杆菌毒素(精制的神经毒素复合体)血清型A在小鼠中的LD5tl约为50皮克。肉 毒杆菌毒素的一个单位(U)被定义为在给体重分别为18-20克的雌性Swiss Webster小鼠 进行腹腔内注射后的LD5tlt5已经对七种免疫学上不同的肉毒神经毒素的特性进行了描述， 这些毒素分别为肉毒神经毒素血清型A、B、Ci、D、E、F和G，其通过与血清型特异性抗体中和 而被区别开。肉毒杆菌毒素的不同血清型随着它们所影响的动物种属以及它们所诱发的麻 痹的严重程度和持续时间而变化。例如，当对大鼠中所产生的麻痹速度进行测定时，已经测 得BoNt/A比肉毒杆菌毒素血清型B (BoNT/B)的效力强500倍。此外，已经测得BoNt/B在 480U/kg的剂量下对灵长类动物无毒，该剂量12倍于BoNt/A对灵长类动物的LD5tl值。以 高亲和力与胆碱能运动神经元显著结合的肉毒杆菌毒素被转运到该神经元中并阻断乙酰 胆碱的释放。肉毒杆菌毒素在临床中已经被用于以骨骼肌活动过度为特征的神经肌肉病症的 治疗。BoNt/A已经被美国食品和药品管理局批准用于治疗睑痉挛、斜视和一侧面痉挛。很 显然，与BoNt/A相比，非-血清型A的肉毒杆菌毒素血清型的效力更低和/或活性持续时 间更短。在几个小时之内可注意到肉毒杆菌毒素如BoNt/A的肌内的临床作用。因此，正如 所测定的那样，在肌内注射时，注意到大多数(如果不是所有的)肉毒杆菌毒素都能在注射 后的一天之内产生显著的肌肉麻痹作用是十分重要的(通过小鼠趾外展评分(DAQ进行测
定)。Aoki K. R.，Preclinical Update on BOTOX (Α型肉毒杆菌毒素)-相对于其它的
肉毒杆菌毒素制剂的精制神经毒素复合物，Eur J.Neur 1999，6(suppl 4) :S3_S10。BoNt/ A进行单次肌内注射而获得症状缓解的持续时间一般平均约为3个月。在同样待审的序列 号为09/620840的美国专利申请中陈述了具有缩短的体内生物活性周期的包括A型肉毒杆 菌毒素在内的肉毒杆菌毒素，该申请在这里被全文引入作为参考。虽然所有的肉毒杆菌毒素血清型都显著地抑制在神经肌肉结合处的神经递质乙 酰胆碱的释放，但是它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点对这些蛋白 进行裂解而发挥作用的。例如，肉毒杆菌血清型A和E都裂解25千道尔顿(kD)的突触小 体相关蛋白(SNAP-25)，但是它们靶向于这种蛋白内的不同氨基酸序列。BoNT/B、D、F和G作用于小泡相关蛋白(VAMP，也被称为小突触泡蛋白)，其中各血清型在不同的位点对蛋 白进行裂解。最后，已经表明肉毒杆菌毒素血清Sc1 (Bomyc1)能够裂解突触融合蛋白和 SNAP-25。这些作用机理上的差异可以影响各种肉毒杆菌毒素血清型作用的相对强度和/ 或持续时间。无论是何种血清型，毒素中毒的分子机理看起来是相似的并且包括至少三个步骤 或阶段。在该过程的第一步中，毒素以高亲和力与靶神经元的突触前膜通过H链和细胞表 面受体之间特定的相互作用结合；认为该受体对于肉毒杆菌毒素的各血清型和破伤风毒素 而言是不同的。H链的羧基末端片段——Hc看起来对该毒素对细胞表面的靶向是十分重要 的。在第二步中，该毒素通过被毒害细胞的浆膜。该毒素首先通过受体介导的内吞作 用被细胞吞没，并形成包含该毒素的核内体。然后，该毒素从该核内体中脱逸进入到该细胞 的细胞浆中。认为最后一步是被该H链的氨基末端片段——Hn所介导的，在接触约5. 5或 更低的PH值时，其可以触发该毒素形态上的改变。已知核内体具有一种可降低核内体内pH 值的质子泵。该形态上的变化暴露出毒素中的疏水残基，这使得该毒素自身包埋到该核内 体的膜中。然后，该毒素通过该核内体的膜被转运到细胞质中。该肉毒杆菌毒素活性机理中的最后一步似乎包括通过L链所进行的关键的细胞 内胞吐蛋白的裂解。肉毒杆菌和破伤风毒素的全部毒性活性都包含于全毒素的L链中；该 L链是一种锌(Zn++)肽链内切酶，其可选择性地裂解识别所必须的蛋白并能使包含神经递 质的小泡与浆膜的胞浆表面进行对接，并且该小泡与该浆膜进行融合。破伤风神经毒素、肉 毒杆菌毒素/B、/D、/F、和/G可造成小突触泡蛋白(也被称为小泡相关膜蛋白(VAMP))—— 一种突触小体膜蛋白的降解。作为这些裂解结果中的任何一种结果存在于该突触小泡的细 胞质表面上的大多数VAMP都可以被除去。各毒素可以特异性地裂解不同的键。对于所有七种已知的肉毒杆菌毒素血清型而言，该肉毒杆菌毒素蛋白分子的分子 量约为150kD。有趣的是，该肉毒杆菌毒素由梭状芽孢杆菌释放，其是包含150kD肉毒杆菌 毒素蛋白分子以及与其相结合的非毒素蛋白的复合体形式。因此，该BoNt/A复合体可以由 梭状芽孢杆菌产生，如900kD、500kD和300kD的形式。BoNT/B和C1似乎仅仅可以以500kD 复合体的形式被产生。BoNT/D可以以300kD和500kD复合体的形式被产生。最后，BoNT/E 和F仅仅可以以约300kD复合体的形式被产生。最后，BoNT/E和F仅仅可以以约300kD复 合体的形式被产生。认为该复合体(即分子量高于约150kD)包含一种非毒素的血细胞凝 集素蛋白和一种非毒素以及一种非毒素的非血细胞凝集素蛋白。这两种非毒素蛋白(其与 该肉毒杆菌毒素分子一起构成相关的神经毒素复合体)可以提供稳定性以对抗肉毒杆菌 毒素分子的变性作用并且当毒素被摄取时可以使其免受消化道酸的影响。此外，有可能较 大的(分子量高于约150kD)肉毒杆菌毒素复合体可以使得该肉毒杆菌毒素以较慢的扩散 速率离开肉毒杆菌毒素复合体的肌内注射部位。在体外研究中已经证实了肉毒杆菌毒素能抑制钾阳离子所诱导的乙酰胆碱和去 甲肾上腺素从脑干组织主要细胞培养物中的释放。此外，已经有报道称肉毒杆菌毒素能抑 制在脊髓神经元的主要培养物中所诱发的甘氨酸和谷氨酸盐的释放，并且还已经有关于在 脑突触体制品内肉毒杆菌毒素可抑制各种神经递质——乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、 CGRP和谷氨酸盐释放的报道。
BoNt/A是通过在发酵器内植入肉毒梭菌并使其培养物进行生长，然后对其进行捕 获并用已知的方法对该发酵了的混合物进行纯化而获得的。所有的肉毒杆菌毒素血清型在 开始时都作为无活性的单链蛋白而被合成，其必须被蛋白酶裂解或切断从而变为具有神经 活性的物质。能生成肉毒杆菌毒素血清型A和G的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此可以 从细菌培养物中以具有显著活性的形式回收血清型A和G。相反，肉毒杆菌毒素血清型Cp D和E是通过用无蛋白水解作用的菌株来合成的，因此当从培养物中被回收时其一般没有 活性。血清型B和F是用具有蛋白水解性和无蛋白水解性的菌株一起来进行合成的，因此 其可以以活性形式被回收或者可以以无活性的形式被回收。但是，即使能产生例如BoNt/B 血清型的蛋白水解性的菌株，也仅仅能裂解所产生毒素的一部分。切断与未切断分子的确 切比例取决于培养的时间以及培养的温度。因此，一定百分比的任何一种制剂，例如BoNt/ B毒素可能是没有活性的，这可能是已知的BoNt/B的功效远远低于BoNt/A的原因。在临床 制剂中存在的没有活性的肉毒杆菌毒素分子对该制剂的总蛋白负荷有贡献，其与抗原性的 增加有关，但对于其临床功效没有帮助。此外，已知在肌内注射时，BoNt/B具有较短的活性 作用持续时间并且在相同剂量水平下其效力也比BoNt/A低。已经有报道称BoNt/A已经被用于临床中，其应用如下(1)每次肌注(多种肌肉)约75-125个单位的BOTOX 1，用于治疗颈肌张力障 碍；(1 由 Allergan，Inc.，of Irvine, California 得到，注册商标BOTOX )(2)每次肌注5-10个单位的BOTOX ，用于治疗眉间线(眉沟)(向降眉间肌内 肌注5个单位，向各皱眉肌眉肌内肌注10个单位)；(3)通过向耻骨直肠肌肌内注射约30-80个单位的BOTOX 治疗便秘；(4)通过向上眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌和下眼睑的外侧睑板前眼轮匝肌每次肌 内注射约1-5个单位的BOTOX 治疗睑痉挛。(5)为了治疗斜视，用约1-5个单位的BOTOX 对眼外的肌肉进行肌注，注射量可 以随着所注射肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹程度(即所需屈光度校正数的量)而进行变 化。(6)为了治疗中风后的上肢痉挛，可以向五种如下的不同上肢屈肌中肌注
BOTOX :(a)指深屈肌(flexor digitorum profundus) :7. 5U 至 30U(b)指浅屈肌(flexor digitorum sublimus) :7. 5U 至 30U(c)腕尺骨屈肌(flexor carpi ulnaris) :10U 至 40U(d)腕桡骨屈肌(flexor carpi radialis) :15U 至 60U(e)肱二头肌50U至200U。所列出的五种肌肉中的每一种都在相同的治疗期间进 行注射，以便于该患者在每次治疗期间通过肌注，上肢屈肌可接受90U至360U的BOTOX 。BoNt/A对各种临床疾病的成功治疗已经导致了对其它的肉毒杆菌毒素血清型的 兴趣。已经对两种商业上可获得的BoNT/A制剂(BOTOX 和Dysport )以及BoNt/B和 F制剂(都得自Wako Chemicals,日本)进行了研究，以便于测定其临床前的局部肌无力功 效、安全性和潜在的抗原性。将肉毒杆菌毒素制剂注射到右侧腓肠肌的顶部(0.5至200.0 个单位/kg)，并用小鼠趾外展记分试验(DAQ来对肌无力进行评估。由剂量响应曲线来计 算ED5tl值。另外再用一些小鼠通过肌注来测定LD5tl剂量。通过LD5tZED5tl来计算出治疗指数。各组小鼠可以在后肢上注射BOTOX (5. 0至10. 0个单位/kg)或BoNt/B (50. 0至400. 0个 单位/kg)，然后对肌无力和增加的水消耗量进行试验，后者是一种公认的用于干燥口腔的 模型。通过用兔子进行的每月肌注一次的试验来对潜在的抗原性进行评估O. 0或8. 7个单 位/kg的BoNt/B或3. 0个单位/kg的BOTOX )。最大的肌无力程度和持续时间与所有的 血清型剂量相关。DAS ED50 值(单位/kg)如下B0T0X :6. 7，Dysport :24. 7，BoNt/ B :11. 8至244. 0，BoNT/F :4. 3。BOTOX 的作用持续时间比BoNt/B或BoNt/F长。治疗指 数值如下:B0T0X :10. 5，DySport : 6. 3，BoNt/B :4. 8。虽然 BoNt/B 在使肌无力时作 用较弱，但是用BoNt/B进行注射的小鼠的水消耗量高于用BOTOX 进行注射的小鼠。在注 射四个月后，四只兔子中的两只(用1.5ng/kg进行处理的情况)和四只兔子中的四只(用 6. 5ng/kg进行处理的情况)对BoNt/B产生了抗体。在一种独立的研究中，9只用BOTOX 进行了处理的兔子没有一只对BoNt/A产生抗体。DAS结果表明BoNt/A的相对峰强度等于 BoNt/F，而BoNt/F比BoNt/B强。至于作用的持续时间而言，BoNt/A比BoNt/B的持续时间 长，而BoNt/B的作用持续时间比BoNt/F长。正如由治疗指数值所表明的那样，BoNt/A的 两种商品化制剂(BOTOX 和Dysport )是不同的。在后肢注射BoNt/B后所观察到的 水消耗行为增加表明在临床上，相当数量的这种血清型进入了鼠科动物的体循环。该结果 还表明为了获得与BoNt/A相当的功效，必须增加所检验的其它血清型的剂量。增加剂量可 能会涉及安全性问题。此外，在兔子中，血清型B比BOTOX 具有更强的抗原性，这可能是 因为为达到BoNt/B的有效剂量注射了较高的蛋白负荷。破伤风神经毒素主要在中枢神经系统中起作用，而肉毒杆菌神经毒素在神经肌肉 结合处起作用；二者都可以通过抑制乙酰胆碱从受影响的神经元的轴突中释放到突触中， 导致麻痹而起作用。受影响的神经元的中毒作用是长期的并且到目前为止，认为其是不可 逆的。已知破伤风神经毒素是以一种免疫学上独特的血清型存在的。乙酰胆碱一般仅仅是在哺乳动物神经系统内由各种类型的神经元释放一种单一类型的小 分子神经递质。该神经递质乙酰胆碱是由脑的许多区域内的神经元所分泌的，但是具体 地是由运动原皮层的大锥体细胞、基底神经节内的数种不同的神经元、支配骨骼肌的运动 神经元、自主神经系统(交感神经和副交感神经)的节前神经元、副交感神经系统的节 后神经元、以及交感神经系统的一些节后神经元所分泌的。从本质上来讲，仅汗腺、立毛 (pri loerector)肌肉以及一些血管的节后交感神经纤维是胆碱能的，而交感神经系统的大 多数节后神经元都释放神经递质——去甲肾上腺素。在大多数情况中，乙酰胆碱具有兴奋 作用。但是，已知乙酰胆碱在某些外周副交感神经末梢具有抑制作用，如通过迷走神经而抑 制心脏。自主神经系统的输出信号是通过交感神经系统或副交感神经系统而被传送到机 体中的。交感神经系统的节前神经元从位于脊髓中侧角中的节前交感神经神经元细胞体 中延伸出去。该从细胞体延伸出来的节前交感神经纤维、具有节后神经元的突触位于椎旁 (paravertebral)的交感神经节中或椎骨(prevertebral)前的神经节中。因为交感神经和 副交感神经系统的节前神经元都是胆碱能的，所以对该神经节使用乙酰胆碱会同时兴奋交 感神经和副交感神经的节后神经元。乙酰胆碱可激活两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。在由副交感神经系统的节后神经元所刺激的所有效应器细胞中以及由交感神经系统的节后胆碱能神经元所刺激的 这些效应器细胞中都发现了毒蕈碱受体。在交感神经和副交感神经的节前和节后神经元间 的突触中都发现了烟碱受体。该烟碱受体还存在于神经肌肉结合处的骨骼肌纤维的许多膜 上。当小的、澄明的细胞内小泡与突触前的神经元细胞膜融合时，从胆碱能神经元中 释放出乙酰胆碱。许多非神经元的分泌细胞，如肾上腺髓质(以及PC12细胞系)和胰岛细 胞可分别从大量的密核小泡中释放儿茶酚胺和胰岛素。PC12细胞系是一种被广泛用作交感 肾上腺的研发所需的组织培养模型中的大鼠嗜铬细胞瘤细胞的纯系细胞。在体外，通过渗 透作用(如通过电穿孔)或通过向去神经细胞中直接注射肉毒杆菌毒素，该毒素抑制两类 化合物从两种类型的细胞中的释放。还已知肉毒杆菌毒素可以阻断神经递质——谷氨酸从 皮层突触体细胞培养物中的释放。神经肌肉结合处是在骨骼肌中通过轴突与肌细胞的接近而形成的。通过神经系统 传递的信号在该末端轴突产生动作电位，激活离子通道并导致了神经递质——乙酰胆碱从 神经内突触小泡中释放，例如在神经肌肉结合处的运动终板处。该乙酰胆碱通过细胞外间 隙与肌肉终板的表面上的乙酰胆碱受体蛋白进行结合。一旦进行了足够的结合，则该肌细 胞的动作电位可引起特定的膜离子通道改变，产生肌细胞收缩。然后，乙酰胆碱从该肌细胞 中释放出来并被细胞外间隙中的胆碱酯酶所代谢。该代谢产物重新循环回到末端轴突中被 再加工成另外的乙酰胆碱。正如上面所讨论的那样，目前治疗受损肌肉的方法仍然很不够。需要一种改良的 治疗受损肌肉的方法。发明_既述根据本发明，一种用于治疗受损肌肉的有效方法包括在体内局部地将治疗有效量 的神经毒素给药到该受损肌肉中或周围的步骤。该神经毒素能为受损的肌肉提供一种暂时 的化学去神经作用并能减少该肌肉的收缩。本发明的目的是要促进受损肌肉的愈合并迅速 恢复其功能。受损肌肉可以是例如扭伤的肌肉。在一个实施方案中，该神经毒素是通过肌 内或皮下的方式来进行给药的。在另一个实施方案中，神经毒素的给药步骤是在物理治疗 和/或手术之前和/或之后进行的。还是根据本发明，神经毒素的给药步骤是在肌肉被损伤后立即进行的，或是在其 后切实可行时立即进行的。在一个实施方案中，至少在该受损的肌肉修复过程的第1阶段 和/或第2阶段期间该神经毒素可以有效的固定或基本固定该受损的肌肉。根据本发明，该神经毒素可以包含靶向组分、治疗组分和转运组分。该靶向组分可 以与一种突触前的运动神经元相结合。在一个实施方案中，该靶向组分可以包含丁酸杆菌 (butyricum)毒素、破伤风毒素、或A、B、C1, D、E、F、G型肉毒杆菌毒素或其变异体的重链的 羧基末端片段。治疗组分可以干扰或调节神经递质从神经元中的释放或其加工。在一个实 施方案中，该治疗组分包含丁酸杆菌毒素、破伤风毒素、或A、B、C1, D、E、F、G型肉毒杆菌毒 素或其变异体的轻链。转运组分可促进该神经毒素的至少一部分，例如治疗组分，转运到靶 细胞的细胞浆内。在一个实施方案中，该转运组分可包含丁酸杆菌毒素、破伤风毒素、或A、 B、C” D、Ε、F、G型肉毒杆菌毒素或其变异体的重链的氨基末端片段。还是根据本发明，该神经毒素是一种Α、B、E和/或F型的肉毒杆菌毒素。在优选的实施方案中，治疗受损的肌肉所用的神经毒素是A型肉毒杆菌毒素。实际上，优选使用A 型肉毒杆菌毒素是因为其在商业上可以获得、其已知的临床应用、以及正如这里所公开的， 根据本发明，可成功的用其进行肌肉损伤的治疗。使用约0. lU/kg至约30U/kg的A型肉毒 杆菌毒素和约lU/kg至约150U/kg的B型肉毒杆菌毒素属于本发明所公开的实际方法的范 畴。关于其它的肉毒杆菌毒素血清型(包括E型和F型毒素)，正如这里所叙述的那样，所 用的U/kg剂量范围为约0. lU/kg至约150U/kg。还是根据本发明，该神经毒素可以重组进行生产。本发明的详细实施方案是一种通过给受损肌肉经体内、局部给予治疗有效量的肉 毒杆菌毒素而对受损的肌肉进行治疗的方法(如促进痊愈)，从而对受损的肌肉进行治疗。 该肉毒杆菌毒素可以是A型肉毒杆菌毒素。值得注意的是，本发明还包含了一种治疗与受 损肌肉有关的疼痛的方法，该方法是通过给受损肌肉经体内、局部的施用治疗有效量的肉 毒杆菌毒素，从而减轻与受损肌肉有关的疼痛。这里所描述的各种和每一种特征、以及该类特征中两个或更多特征的各种和每一 种组合都属于本发明的范畴，前提条件是在该类组合中所包含的这些特征不会互相矛盾。提供如下的定义并在这里对其进行应用。“约”指的是大约或接近，并且本文涉及所述的数值或范围时指的是所叙述或所要 求的数值或范围的士 10%。“重链”指的是梭状芽孢杆菌神经毒素的重链。其优选具有约IOOkDa的分子量并 且在这里被称为H链或H。“H/’指的是得自梭状芽孢杆菌神经毒素的H链的大约相当于该H链的氨基末端片 段的片段(优选具有约50kDa的分子量)，或对应于完整H链中的该片段的部分。认为其包 含在穿越细胞内核内体膜的L链的转运作用中所涉及的天然或野生型梭状芽孢杆菌神经 毒素的部分。“He”指的是得自梭状芽孢杆菌神经毒素的H链的大约相当于该H链的羧基末端片 段的片段(约50kDa)，或对应于完整H链中的该片段的部分。认为其是致免疫性的并且包 含以高亲和力与运动神经元进行突触前结合时所涉及的天然或野生型梭状芽孢杆菌神经 毒素的部分。“受损肌肉”包括扭伤、撕裂或撕开的肌肉，以及带有挫伤(撞伤)、裂伤、局部缺血 或破裂的肌肉。“轻链”指的是梭状芽孢杆菌神经毒素的轻链。其优选具有约50kDa的分子量，并 且被称为L链、L或梭状芽孢杆菌神经毒素的蛋白水解区域(氨基酸序列)。认为当被释放 到靶细胞的细胞浆中时，该轻链是一种有效的神经递质释放的抑制剂。“局部给药”指的是将药物直接给药于动物体表或体内的需要药物在该部位上发 挥某种生物作用的部位上或该部位附近。局部给药排除系统途径的给药，如静脉内给药或 口服给药。“神经毒素”指的是能干扰或调节神经元的至少一种功能的化学实体。“神经毒素” 可以是天然存在的或可以是人造的。此外，该“神经毒素”可以是一种小分子、大分子、多肽、 共轭的多肽或它们的混合物。
“变异体”指的是与母体化学实体有略微的差别但是仍然具有生物学作用的化学 实体。变异体的生物学作用可以与母体的生物学作用基本相同或优于母体的作用。例如， 至少有一个氨基酸被置换、修饰、缺失或增加的肉毒杆菌毒素的变异轻链可具有相同的或 更强的阻止神经递质小泡释放的能力。此外，变异体的生物学作用也可降低。例如，除去了 亮氨酸基元的A型肉毒杆菌毒素的变异轻链可比母体的(或天然的)A型肉毒杆菌毒素轻 链具有更短的生物学持续性。发明描述在主要实施方案中，本发明治疗受损的肌肉的一种有效方法可包括将治疗有效量 的神经毒素局部给药于受损的肌肉的步骤。优选地，该受损的肌肉是被扭伤的肌肉。骨骼肌的扭伤性损害可被划分为剪切性损伤。在剪切性损伤中，不仅肌纤维被撕 裂，而且mysial鞘也被撕裂。在肌肉损伤后几乎马上就开始了肌肉的修复过程。剪切性损 伤的修复过程可以被分为三个阶段。第1阶段是破坏阶段，其特征为形成血肿、肌纤维坏死、以及炎性细胞反应。在扭 伤后，在靠近于其末梢肌腱结合处(MTJ)的部位常常会出现其它健康肌肉的破裂部位。破 裂的肌纤维收缩并在残余部分之间形成一个缺口。因为骨骼肌的血管丰富，所以从被撕裂 的血管中出血是不可避免的，所以该缺口被血肿所填充，随后被瘢痕组织所取代。在剪切性 损伤中，机械力撕裂了整个肌纤维，损害了肌纤维的浆膜并且在残余部分的末端留下了肌 浆开口。因为肌纤维是很长的、串状细胞，该坏死从这种部位开始延伸到该破裂的肌纤维的 整个长度上。在剪切性损伤中血管也被撕裂；因此，血液所运载的炎性细胞立即进入到该损 伤部位并诱导炎症。在损伤后，第1个阶段会持续约2至3天。第2个阶段是修复阶段，其由坏死组织的吞噬细胞溶解、肌纤维的再生、结缔组织 瘢痕的产生、以及毛细管的内向成长所组成。在受损肌肉组织再生中的关键步骤是受损伤 区域的血管形成。血管补充的修复对于受损肌肉的再生而言是必须的。新的毛细管从存活 的大血管上伸出，向着损伤区域的中心生长。这些新的毛细血管帮助向再生区域提供足够 的氧供应。第3个阶段是改型阶段，其由再生肌纤维的成熟、瘢痕组织的收缩和整理、以及被 修复肌肉的功能恢复所组成。在第1个阶段后，第2个阶段(修复)和第3个阶段(改型) 常常同时发生，并且持续约2天至约6个星期。在本发明的一个实施方案中，该神经毒素被局部给药以固定受损肌肉而促进愈 合，优选地通过肌内给药。本发明所公开的神经毒素的局部给药还能减少由于肌肉损伤而 产生的疼痛。优选地，在损伤时或损伤后立即进行该神经毒素的给药。在一个优选的实施 方案中，在破坏阶段(第1阶段)中，该神经毒素能有效的固定受损的肌肉以防止该肌肉的 再次破裂。不希望用任何特定作用机理的理论对本发明进行限制，认为在修复和/或改型阶 段期间的固定是有益的，这是因为这种固定可以使得受损伤区域中毛细管更快更强的向内 生长，并且可以使得肌肉纤维更好的再生和定向。因此，在一个实施方案中，在修复阶段 (第2阶段)和/或改型阶段(第3阶段)中不具有神经毒素的固定作用。在更优选的实 施方案中，在第1阶段期间施用神经毒素，其能有效的固定受损的肌肉，但是在该修复过程 的第2和3个阶段中不施用神经毒素。例如，如果在损伤后立即注射该神经毒素，优选肌内注射，优选地在给药后约3天的时间内该神经毒素固定该受损的肌肉。或者该神经毒素仅 仅在这种程度下具有固定作用，在这种程度中，在对受损的肌肉进行应用后，病人在基础活 动中只经受很小的痛苦或不会经受痛苦。当达到这种临界点时，应当鼓励病人开始积极的 渐进的进行活动。在本发明的另外一个实施方案中，在第1-3个阶段的所有阶段以及在其随后的肌 肉损伤恢复期中，该神经毒素都可有效的固定受损肌肉。神经毒素，如某些肉毒杆菌毒素，其需要少于约一天至约七天的时间来表现出显 著的临床肌肉麻痹作用和/或其中的肌肉麻痹作用在注射后可持续几个月的时间，这样的 神经毒素在本发明的范围之内，这样的神经毒素可被用于治疗相对严重或持续时间较长的 肌肉损伤或为了治愈的目的而需要进行长期的肌肉固定的情况。在主要实施方案中，该神经毒素是一种神经肌肉阻滞剂。表1非限制性地列出了 一些神经肌肉阻滞剂以及其可能的作用部位。在一个实施方案中，将具有能将肌肉，优选受 损的肌肉固定至少约5天，优选至少约3天的能力的神经肌肉阻滞剂进行给药来对受损肌 肉进行治疗。在本发明的一个优选实施方案中，该神经毒素是一种肉毒杆菌毒素，这是因为 肉毒杆菌毒素的已知应用和临床安全性所导致的，如E型肉毒杆菌毒素可用于治疗肌肉疾 病如肌肉痉挛。在本发明特别优选的一个实施方案中，特别是对于严重的，或三度肌肉损伤 而言，局部给药的肉毒杆菌毒素是一种E型肉毒杆菌毒素。在这些实施方案中也可以使用 A型肉毒杆菌毒素。表 权利要求
1.神经毒素在制备用于治疗损伤肌肉的局部给药的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所说的局部给药是肌内注射。
3.如权利要求1所述的用途，其中该神经毒素基本固定受损的肌肉。
4.如权利要求1所述的用途，其中所说的神经毒素在受损肌肉的修复过程的第1和第 2个阶段可以有效的固定该受损的肌肉。
5.如权利要求1所述的用途，其中所说的神经毒素在受损肌肉的修复过程的第1个阶 段中可以有效的固定该受损的肌肉。
6.如权利要求1所述的用途，其中所说的神经毒素是A、B、C”D、E、F、或G型肉毒杆菌
7.如权利要求1所述的用途，其中所说的神经毒素是通过重组制备的神经毒素。
8.肉毒杆菌毒素在制备用于治疗损伤肌肉的局部给药的药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其中所说的肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
10.A型肉毒杆菌毒素在制备用于促进损伤肌肉愈合的局部给药的药物中的用途。
11.肉毒杆菌毒素在制备用于治疗损伤肌肉有关的疼痛的局部给药的药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所说的肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
全文摘要
一种用于治疗受损肌肉的方法，通过神经毒素的局部给药来促进受损肌肉的愈合和/或减少与受损的肌肉有关的疼痛，其中所说的神经毒素如肉毒杆菌毒素。
文档编号A61P21/02GK102078597SQ201010621020
公开日2011年6月1日 申请日期2001年8月31日 优先权日2000年10月4日
发明者G·F·布罗克斯, K·R·奥基 申请人:阿勒根公司