专利名称：稳定的生长激素化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及耐受蛋白水解性降解的稳定的生长激素(GH)化合物。
背景技术：
生长激素(GH)是由哺乳动物的垂体前叶分泌的多肽激素。依赖于物种，GH是由大约190个氨基酸残基组成的蛋白，相应的分子量是大约22 kDa。GH结合细胞表面受体(GH 受体(GHIO)并通过该受体发信号。GH在促进生长、维持正常身体组成、合成代谢和脂类代谢中起关键作用。它也对中间代谢(诸如减少的葡萄糖摄取、增加的脂解作用、增加的氨基酸摄取和蛋白合成)具有直接的作用。该激素也对其它组织发挥作用，所述组织包括脂肪组织、肝、肠、肾、骨骼、结缔组织和肌肉。已经生产并可商业得到重组hGH，例如作为健高灵 (Pharmacia Upjohn)、Nutropin 禾口 Protropin (Genentech)、Humatrope (Eli Lilly)> Serostim (Serono)、诺地托品(Novo Nordisk)、Omnitrope (Sandoz)、Nutropin Depot (Genentech和Alkermes)。另外，在N-末端具有一个额外的甲硫氨酸残基的类似物也面市， 例如作为Somatonorm (Pharmacia Upjohn/Pfizer)。GH与GH-家族的蛋白的其它成员催乳素(PRL)和胎盘催乳素(PL)具有共同的拓扑学。GH被归类成四螺旋束蛋白(图1)，其表现出具有2个保守二硫键的“上-上-下-下” 拓扑学。具体地，野生型人GH (hGH)由191个氨基酸残基组成，且具有4个在位置53、165、 182和189处的半胱氨酸残基，其通过形成2个分子内二硫键(分别连接C53和C165以及 C182和C189)，稳定化蛋白的三维结构(图1)。通过X-射线结晶学，已经实验地确定了游离形式(Chantalet L.藥Λ (1995) Protein and Peptide Letters 3, 333-340)和与它的结合蛋白(人 GHR (hGHR)的胞外域)复合(Devos，Α. Μ.藥Λ (1992) Science 255. 306-312)的hGH的结构。这些结构已经储存在蛋白数据库(PDB)中，且可公开得到(PDB 登录码分别是IHGU和1HWG)。因而，从公开的hGH结构，可以鉴别出对于hGH与hGHR的结合而言重要的残基。此外，已经通过核磁共振(NMR)波谱学研究了 hGH的动力学性质 (Kasimova M. R.藥Λ J. Mol. Biol. (2002) M旦，679-695)。X-射线和 NMR 数据组合起来可以将确定地结构化和确定地定义的hGH区域与更少结构化和动力学的区域区分开。预期hGH的更少结构化和动力学的区域对蛋白酶剪切特别易感，且这样的区域的正确稳定化可以提高蛋白水解稳定性。已经对hGH进行了广泛的诱变，以尝试生成具有希望的化学或生物学性质的hGH 类似物。具体地，已经描述了用于几种目的的半胱氨酸突变体。US 2003/0162949公开了 GH超基因家族的成员的半胱氨酸变体。提供了产生这些蛋白的位点特异性的生物活性缀合物的一般方法。所述方法包括，将半胱氨酸残基添加到蛋白的非必需区域，或使用位点定向诱变，用半胱氨酸残基置换蛋白中的非必需氨基酸，然后通过添加的半胱氨酸残基，将半胱氨酸-反应性的聚合物或其它类型的半胱氨酸-反应性的部分共价地偶联到蛋白上。WO 02/055532描述了具有至少一个共价地附着的非多肽部分的基团工程改造的hGH突变体，尤其是其中使用导入的半胱氨酸残基用于进行加入聚乙二醇的hGH突变体。US 5，951，972描述了生理活性的、衍生化的天然的和重组的哺乳动物和人蛋白和多肽，其中用各种取代基衍生化蛋白中的至少一个天然存在的或掺入的半胱氨酸残基。已经详细研究了 hGH的蛋白酶剪切。由残基1 至巧4组成的长环具有几种蛋白酶(诸如凝血酶、纤溶酶、胶原酶、枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶)的推定剪切位点。因此，已经表明，该hGH部分对蛋白酶剪切特别易感(Lewis，U.J. Ann. Rev. Physiol. (1984.) 46，33-42)。据报道降解hGH的酶包括凝血酶、纤溶酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶和激肽释放酶。已经研究了大鼠组织中的 hGH 的降解(Garcia-BarrosJ. Endocrinol. Invest. (2000) 23，748 - 754)。在大鼠甲状腺胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶中，最初发现在大体积(bulky)和亲脂的氨基酸残基处的有利切割切开Y143和S144之间的肽键，从而导致产生双链分子，随后在 Y42和S43之间切割，从而释放出N-末端肽F1-Y42。通过胰凝乳蛋白酶-样蛋白酶在F146 和D147之间的切割，并进一步通过羧肽酶的作用，进一步加工双链分子中的裂开的环。已经报道了几种生产针对蛋白水解性降解稳定化的hGH类似物的方法。Alam等人(J. Biotech. 65, 183 - 190 (1998))通过特异性的点突变，设计了耐受凝血酶和纤溶酶的hGH突变体。凝血酶特异性地在R134和T135之间切割hGH，且双突变体R134D、T135P产生耐受凝血酶切割的hGH变体，且三突变体R134D、T135P、K140A导致产生对纤溶酶的耐受性。此外，后一种hGH突变体在7天时间段内耐受人血浆的蛋白酶解。EP534568描述了通过将R134突变成丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或组氨酸，针对蛋白水解性降解稳定化的hGH突变体。W02004022593/Nautilus描述了一般的高通量定向进化方法，以生产具有增加的蛋白水解稳定性的修饰的细胞因子，包括GH变体。W02006048777/Nautilus具体地描述了具有提高的蛋白水解稳定性的修饰的hGH 类似物。所述类似物含有 1-5 个在位置 1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、 102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185 和 187-191 处的突变。半胱氨酸残基的导入，可以潜在地导致不希望的二硫键连接的二聚体的形成，且在W02006048777 中，特别地从该范围中排除了半胱氨酸对氨基酸残基的置换；在W02006048777 (第65页) 中叙称“明确地避免半胱氨酸残基对氨基酸的置换，这是因为该变化可能导致分子间二硫键的形成”。明显需要开发可耐受蛋白水解性降解的hGH化合物。这样的稳定化的化合物应当表现出增加的对蛋白酶剪切的稳定性，同时保留hGH的希望的生物学性质。这样的GH分子会具有增加的稳定性、更慢的清除率和/或延长的体内半衰期。此外，蛋白治疗剂通常需要静脉内地或皮下地施用，这是因为它们通常不是充分地可口服的。蛋白的低口服生物利用率部分地归因于在胃肠道中的蛋白水解性降解。因此， 也需要开发可口服施用来治疗hGH相关障碍的hGH化合物。
发明内容
本发明涉及包含额外二硫键的hGH化合物。在本发明的hGH化合物中，已经通过将野生型hGH序列中的至少一个氨基酸突变成半胱氨酸，导入了至少一个额外的半胱氨酸残基。在本发明的hGH化合物中，以下述方式选择突变位点(1)将导入的一个或多个半胱氨酸残基适当地放入折叠的蛋白的三维结构中，以允许形成在野生型蛋白中不存在的额外二硫键，O)不破坏hGH的天然结构，(3)与野生型hGH相比，所述hGH化合物表现出增加的对蛋白酶剪切的稳定性或其它增强的功能性，和所述hGH化合物保留与野生型hGH 有关的希望的生物活性。这样的可耐受在胃肠道中的蛋白水解性降解的hGH化合物的二硫化物变体，可以被开发成口服施用的用于治疗hGH相关障碍的药物。
图1结合到hGH结合蛋白的2个拷贝上的hGH的结构(PDB 1HWG)。hGH中的4个主要螺旋显示为深灰色，并标记为历-份。用箭标指示方向(N —C末端)。分别用N和C 标记hGH的N-和C-末端。用黑色棍和球分别表示连接C53和C165以及C182和C189的 2个二硫键。还标记了 LU8和D154，它们分别表示连接H3和H4的长柔性环中的第一个和
最后一个残基。图2 hGH的野生型氨基酸序列，其中突出显示和标记了 4个主螺旋(H1-H4)。还标记了 3个连接主螺旋的环(L1-L3)。螺旋定义表示与它的结合蛋白复合的hGH (PDB 1HWG)。
图3野生型hGH和具有额外二硫键的hGH化合物的蛋白水解性消化的时程。使用的蛋白酶是胰凝乳蛋白酶(图A)和弹性蛋白酶(图B)。如实施例5所述进行测定。相对于温育时间绘制完整蛋白的量(按照相对于t=0时的％)。在表中列出了通过将数据拟合至一次指数所衍生出的T1A (小时)。
具体实施例方式本发明涉及具有额外二硫键的稳定的hGH化合物。所述二硫键是在半胱氨酸对之间形成，所述半胱氨酸中的一个或两个通过点突变导入到野生型hGH序列中。选择突变位点，从而使得导入的半胱氨酸残基适当地放入折叠的蛋白的三维结构中，以允许形成二硫键。如果仅导入一个半胱氨酸，它在形成二硫键时的配偶体将包括在野生型hGH 中存在的4个半胱氨酸残基之一。可以如下得到具有额外二硫键的折叠的蛋白通过由合适的宿主生物体表达可溶形式的hGH的适当半胱氨酸突变体，或使用本领域技术人员众所周知的生长激素化合物的标准重折叠条件，从内含体回收(Cabrita和Bottomley， Biotechnology Annual Review 10, 31-50 Q004))。通过计算方法可以辅助鉴别导入额外二硫键的候选位置，例如使用实验地确定的与它的结合蛋白的2个拷贝复合的hGH的三维结构(PDB登录码1HWG)。导入二硫键的适当位置的选择，可以基于在Dombkowski Α., A., Bioinformatics 19, 1852-1853 (2003)和 Petersen 等人，Protein Eng. 12, 535-548 (1999)中所述的二硫键的距离和几何学标准。选择半胱氨酸突变体，从而使得导入的二硫键不破坏蛋白的天然结构，且对希望的与hGH有关的生物活性具有最小的负面影响。因而，构建化合物，从而使得导入的二硫键不损害与hGHR的相互作用。已经从IHWG中鉴别出对于受体相互作用而言重要的hGH区域。 因而，通过分析IHWG结构，可以引导用于导入二硫键的适当位置(它们就生物活性而言是中性的)的选择。
可以选择半胱氨酸突变体，从而使得导入的二硫键提供增加的对蛋白酶剪切的稳定性。所述蛋白的一级氨基酸序列，部分地确定了蛋白对蛋白酶切割的易感性。蛋白酶可以是相对非特异性的，或可以以可变程度的选择性，识别一级氨基酸序列中的特定基序。但是，起底物作用的蛋白分子的三维结构和动力学强烈地影响蛋白水解稳定性。高度柔性的和动态的环结构对蛋白酶催化的切割特别脆弱，而确定地结构化的区域通常具有更低的脆弱度。因而，通过导入二硫键稳定化蛋白的动态区域，可以保护免于蛋白酶剪切。本发明的一个方面涉及在SEQ ID No. 1中包含额外二硫键的生长激素化合物。如下文所述，根据本发明的生长激素化合物多肽优选地与SEQ ID No. 1表示的人生长激素具有高水平的同一性，因此与在SEQ ID No. 1中定义的人生长激素相比，生长激素化合物包含一个或多个额外的二硫键。因此，本发明的一个实施方案提供了根据SEQ ID No. 1的稳定的GH化合物，其通过引入额外二硫键而耐受蛋白水解性降解。在根据本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含在与SEQ ID No. 1中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、 F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、 I58C/S144C、P59C/Q137C, P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、 R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、/S85C/ Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、 L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C相对应的位置处的至少一个氨基酸对之间的额外二硫键。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含在与SEQ ID No. 1中的R16C/ L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/ Q141C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/ F139C、R77C/1138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/ F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和 /或V185C/S188C相对应但不限于此的位置处的至少一个氨基酸对之间的额外二硫键。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含在与SEQ ID No. 1中的A17C/ E174C、H21C/M170C、S71C/S132C、Q84C/Y143C 和 R94C/D107C 相对应但不限于此的位置处的至少一个氨基酸对之间的额外二硫键。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含在与SEQ ID No. 1中的Q84C/ Y143C相对应的位置处的氨基酸对之间的额外二硫键。在根据本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着 SEQ ID No. 1 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、 N47C/T50C、Q49C/G161C, F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、 I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、 L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/1138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、 Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、 V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着、但不限于 SEQ ID No. 1 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、N47C/T50C、Q49C/ G161C、F54C/S144C、F54C/F146C、I58C/Q141C,I58C/S144C、P59C/Q137C,P61C/E66C、P61C/ T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/ Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、 V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应着、但不限于 SEQ ID No. 1 中的 A17C/E174C、H21C/M170C、S71C/S132C、Q84C/Y143C 和 R94C/D107C。在本发明的一个实施方案中，本发明的生长激素化合物包含一对突变，所述突变对应着SEQ ID No. 1中的位置Q84C/Y143C。在本发明的一个实施方案中，通过在环区段和螺旋结构之间导入二硫键，实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性。在本发明的一个实施方案中，通过在一个环区段内导入二硫键，实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性。在本发明的一个实施方案中，通过在多个环区段内导入二硫键，实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性。在本发明的一个实施方案中，通过在螺旋之间导入二硫键，实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性。在本发明的一个实施方案中，至少一个导入的二硫键连接生长激素化合物的2个半胱氨酸残基，其中至少一个所述半胱氨酸残基在野生型hGH中不存在。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的导入的二硫键位于使用在 Dombkowski A.，A.，Bioinformatics 19, 1852—1853 (2003)禾Π Petersen 等人， Protein Eng. 12(7)，535-548 (1999)中所述的距离和几何学标准选择的半胱氨酸残基之间。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的导入的一个或多个二硫键稳定化连接H3和H4的环(L3，残基128-154)，即导入的二硫键中的至少一个半胱氨酸位于包含残基128-154的区段中(图1和2)。表 权利要求
1.在SEQID No. 1中包含额外二硫键的生长激素化合物。
2.根据权利要求1所述的生长激素化合物，其中所述多肽序列与由SEQID No. 1定义的hGH具有至少80%、诸如90%、诸如95%、诸如96%、诸如97%、诸如98%或诸如99%同一性。
3.根据前述权利要求中任一项所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含在一个环区段和一个螺旋区段之间、或在一个环区段内、或在多个环区段之间、或在多个螺旋区段之间的额外二硫键。
4.根据前述权利要求中任一项所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着 SEQ ID No. 1 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/ V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C, F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/ Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/ T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/ Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/ T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。
5.根据权利要求4所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着 SEQ ID No. 1 中的 A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C, D26/Y103C, F54C/ Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C,I58C/Y143C、I58C/ S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/ T148C 和 / 或 R94C/D107C。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个额外二硫键，其中至少一个半胱氨酸存在于与SEQ ID No. 1中的氨基酸128-1M相对应的环3 (L3)中。
7.根据权利要求6所述的生长激素，其中所述生长激素化合物包含一个额外二硫键， 其中至少一个半胱氨酸存在于与SEQ ID No. 1中的氨基酸135-148相对应的区域中。
8.根据权利要求6所述的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应着 SEQ ID No. 1 中的 ra4C/Y143C、ra4C/S144C、ra4C/F146C、S55C/Y143C、S57C/ Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/ F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/ Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C 和 / 或 F92C/T148C。
9.根据权利要求6所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个连接L3 和螺旋2 (H2)或环1 (Li)的额外二硫键。
10.根据前述权利要求中任一项所述的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物针对一种或多种蛋白酶的降解被稳定化，所述蛋白酶例如消化蛋白酶，诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶，或诸如胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶。
11.根据权利要求10所述的生长激素化合物，其中所述多肽包含至少一对突变，所述突变对应着SEQ ID No. 1 中的H21/M170、拟6/V102C、D26/Y103C、ra4C/Y143C、ra4C/S144C、 S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、 L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和 / 或 R94C/D107C。
12.根据前述权利要求中任一项所述的生长激素化合物，其与在SEQID No. 1中定义的人生长激素相比精确地包含2个额外的半胱氨酸。
13.一种用于制备具有增加的对蛋白水解性降解的稳定性的生长激素化合物的方法， 所述方法包括下述步骤a. 在如SEQ ID No. 1所定义的hGH中导入额外的二硫键。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的生长激素化合物和药学上可接受的载体。
15.一种治疗疾病的方法，其中生长激素活性可以用于治疗患者将从循环生长激素化合物量的增加获益的疾病或状态，所述方法包括，给患者施用有效量的根据权利要求1-12 中任一项所述的生长激素化合物或根据权利要求14的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及稳定的生长激素(GH)化合物，其通过导入半胱氨酸残基而具有二硫键，这使得该化合物耐受蛋白水解性降解。
文档编号A61K38/27GK102292349SQ201080005067
公开日2011年12月21日 申请日期2010年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者B. 席奥特 C., 德姆思 H., 布雷因霍尔特 J., 诺斯科夫-劳里特森 L., H. 奥尔森 O., 泰格森 P. 申请人:诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司