分泌的aP2及其抑制方法

专利名称：分泌的aP2及其抑制方法
分泌的aP2及其抑制方法政府权益声明本发明是在政府的支持下完成的，国立卫生研究院授权号为DK064360何DK071507。政府具有本发明的某些权利。
背景技术：
代谢综合症或者代谢疾病是一种术语，它定义为新陈代谢的危险因素的集合，这些危险因素集中到单一个体中并且诱致糖尿病和心血管疾病。代谢综合症的主要特征包括胰岛素抗性，高血压(高血压症)，胆固醇异常，和增加的结块风险。胰岛素抑制性指的是细胞对胰岛素促进葡萄糖从血运输进肌肉及其他组织中的作用的响应能力的减少。带有这种危险因素簇的患者几乎经常是超重的或者肥胖的。发明概述本发明基于一种发现，即血清aP2调节全身性胰岛素敏感性和葡萄糖代谢。因此，一种减少代谢疾病症状的方法是通过给予患者一种组合物，这种组合物结合循环中的aP2并阻遏循环中的aP2 (例如，血或血清aP2)，所述方法通过给予一种结合到并减少循环中aP2蛋白质的量的组合物，或通过给予一种由细胞分泌的aP2的抑制剂来进行。例如，葡萄糖不耐性要减少这种抑制剂接下来的给药。典型的组合物包括抗体或它们的特定的抗原片段，结合到aP2的那些小分子，以及那些通过一种脂肪细胞或巨噬细胞抑制aP2的分泌的组合物。阻止或减少代谢疾病的严重程度的一种方法涉及给予患者一种减少血清aP2浓度的组合物。在某些实施方案中，本方法包含鉴别与正常的、健康的、相应的年龄、相应的性别对照的患者(或患者库)相比较患者有血清aP2水平升高的特征的患者。例如，一种对照患者是瘦的并且特征为血清aP2水平20 u g/L，一种需要介入治疗的患者的特点在于aP2的水平是升高的。待治疗的患者是超重的，肥胖的，和/或包含血清aP2水平大于20 y g/L (例如，血清中25，28，30，32，35，40或更多y g/L aP2)。患者是随意地确定具有正常重量(BMI18. 5-24. 9)，超重的(BMI25-29. 9)，或肥胖的(BMI30 或更大)。在此描述的每一个治疗的方法中，与治疗前血清aP2浓度相比血清aP2浓度减少了至少10 %，25 %，50 %，75 %，2倍，5倍，10倍或更多。在一个实例中，减少血清aP2浓度的组合物是一种aP2特异性抗体。该抗体是一种纯化了的单克隆的或多克隆的抗体。例如，结合到抗体可达到的aP2的抗原表位的那些抗体，例如，图3.中那些加亮部分。这种抗体结合到如结晶的模型(图3)所示的溶液(例如，血和血清中)中蛋白质的三维结构露出的表面上的aP2的抗原表位。一种不连续的抗原表位，它的氨基酸处于大约接近蛋白质的三维结构(折叠的)，但是当展开时距离远的位置。优选地，本抗体是一种单克隆抗体，它的结合专一丨I"生包含一种结构的抗原表位，这种抗原表位当存在于一种身体的流质例如血，血清，或血浆中的aP2分子上表面容易接近。例如，该抗原表位包含至少一种人类aP2蛋白质的下列部分的一种=SEQID NO 4的残基1-5，残基22，残基36-37，残基46-47，残基57，残基59-60，残基78，残基80，残基89，残基97-101，残基110-112，残基122。当它们暴露于溶液中的aP2蛋白质表面上时该抗体随意地结合两个或更多抗原表位(残基或残基串)。在某些例子中，该抗体没有结合到变性的aP2或没有结合到aP2的线型的抗原表位。本发明不但包含一种完整的单克隆抗体和它们的用法，而且包含一种有效的免疫抗体片段，例如，Fab或(Fab)2片段；一种设计的单链Fv分子；或者一种嵌合的分子，例如，ー种抗体，它包含一种抗体的结合专一性例如，鼠的起端，和另ー个抗体残存的部分，例如，人类起端的。同样包括在本发明中的是ー种鉴别aP2分泌的抑制剂的方法。为了鉴别这种化合物ー种分泌的aP2细胞例如脂肪细胞或巨噬细胞与待选择的化合物接触并且检测细胞外的aP2水平。与该化合物不存在时相比在该化合物存在下细胞外aP2的减少表明该化合物抑制aP2的分泌。例如，细胞外的aP2的水平减少至少10%，25%，50%，75%，2倍，5倍，10
倍或更多。aP2分泌的抑制剂的筛选在不同的脂肪细胞中进行，它在体外和体内大量地表达aP2以及在它们响应激素及其他生物刺激中大约接近脂肪组织。例如，两个步骤用于进行高通量筛选。首先，使用腺病毒调节基因传递在脂肪细胞中表达ー种GFP标记的aP2。抑制剂用于在96孔板中细胞的种子并且通过測量状况良好的培养基的荧光强度来測定aP2的分泌。第二，带有标记的aP2的互补DNA和HA双重的标记在脂肪细胞中表达。抑制剂治疗后aP2的分泌是通过使用一种酶联免疫吸附系统来检测的。标记用来俘获板上的aP2并且共轭HRP的HA抗体将用于检测aP2。本方法和组合物能够有效的治疗或者減少那些以不正常升高的分泌的aP2水平为特征的临床疾病的严重程度，所述不正常升高的分泌的aP2水平例如，血或者血清中升高的aP2水平。这种情形包括代谢综合症，葡萄糖不耐性，肥胖，糖尿病，脂肪肝疾病，动脉粥样硬化，和哮喘(aP2在该病状的发生中起到直接作用的情况)。増加的血清aP2也与慢性的血液透析作用(圆二色性)，引起阻塞的睡眠呼吸暂停(一种与肥胖有关系的病症)，感染艾滋病病毒的病人中脂肪代谢障碍，和脂肪分解有关，使用在此描述的方法和组合物治疗或者减少这些情形。本方法也对治疗或者减少病理状态例如高血压，中风，和神经变性的疾病有用处，在这些疾病中aP2是间接地涉及。抑制剂用来治疗人类及其他动物，例如，猫、狗的糖尿病。例如，给予那些已经诊断有或者发展为II型糖尿病风险的患者本抑制剂。这里引用的所有出版物、美国专利和申请、基因库(Genbank)/NCBI序列号以及其他所有的參考文献通过引证在此全部并入本文。图表的简要说明图Ia是ー种电泳的凝胶图片，它显示了脂肪细胞中aP2的分泌。使用抗aP2，mall，caveolin或者AKT抗体吸掉来自不同的WT或者FABP缺乏的(DK)脂肪细胞的全部细胞裂解物(WCL)和条件培养基(CM)。图Ib 是柱状图表，它显示了 WT，aP2+(aP2K0)，mall+(mallK0)和aP2-mal(DKO)老鼠的血清aP2浓度。用如实验过程描述的aP2酶联免疫吸附方法测定aP2水平。 图Ic是ー种柱状图表，它显示了老鼠(ob)中瘦的(WT正常的食谱，RD)，饮食多脂(WT高脂肪食谱)或者致轻素缺乏的的遗传的肥胖中血清aP2浓度。
图Id是一种柱状图表，它显示了那些进行骨髓移植的老鼠中血清aP2浓度。骨髓移植在WT和FABP缺乏的(DKO)老鼠之间进行并且使用aP2酶联免疫吸附测定血清aP2。来自带有对照或者aP2质粒转染的巨噬细胞的条件培养基的插入物，aP2吸取。图2a是一种电泳的凝胶图片，它显示了使用一种aP2特异性抗体的蛋白质印迹的结果。使用对照兔免疫免疫球蛋白G，预免疫血清或者ap2抗体吸取从WT或者FABP缺乏的脂肪细胞一种细胞裂解物。
图2b是一种柱状图表，它显示了 aP2抗体给药前后老鼠中血清aP2浓度。那些维持高脂肪食谱并且用对照和aP2抗体注射两个星期的老鼠中血清aP2用酶联免疫吸附aP2的方法分析。图2c是一种柱状图表，它显示了减少的血清aP2的老鼠中葡萄糖水平。给维持高脂肪食谱的WT老鼠注射对照免疫免疫球蛋白G或者aP2抗体两个星期并且测定注射前后的身体重量。图2d是一种线形图，它显示了给葡糖耐量试验的老鼠注射对照或者aP2抗体两个星期的结果。图2e是一种线形图，它显示了给胰岛素耐量试验注射对照或者重组aP2两个星期的结果。图2f是一种柱状图表，它显示了在高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究过程中注射了对照或者aP2抗体的老鼠中基本的钳夹肝葡萄糖生产率(cHGP)。图2g是一种柱状图表，它显示了在高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究过程中注射了对照或者aP2抗体的老鼠中基本的基本的肝葡萄糖生产率(bHGP)。图2h是一种线形图，它显示了在高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究过程中那些灌输了对照蛋白质或者重组aP2的FABP缺乏的老鼠中基本的肝的葡萄糖生产率(bHGP)。图3是使用软件工具DiscoTope基于aP2晶体结构的不连续的抗原表位的简图。目标抗原表位在结构上加亮，并且那些组成这些抗原表位的残基通过如下表显示的氨基酸序列中的方框残基标明并且在SEQ ID N0:4(表3，如下)中强调。图4a是一种电泳的凝胶图片，它显示了脂联素抗体细胞中的aP2分泌。使用抗aP2，caveolin, AKT或者脂联素抗体吸掉来自不同的WT或者aP2_mall-/-(DKO)脂肪细胞的全部细胞裂解物(WCL)和条件培养基(CM)。图4b是一种电泳的凝胶图片，它显示了人胚肾293细胞中aP2的分泌。使用抗性标记的抗体吸取来自带有AKT标记,GFP-aP2标记或者GFP标记的质粒转染的人胚肾293细胞的全部细胞裂解物(WCL)或者免疫析出的条件培养基(CM)。图4c是一种电泳的凝胶图片，它显示了因为培养基变化在标明的时间点从WT或者aP2-/_脂肪细胞中收集条件培养基。该培养基用带有SDS-PAGE分辨并且用考马斯亮蓝染色检查所有的存在于本培养基中的大量的蛋白质。图4d是一种柱状图表，它显示了用酶联免疫吸附aP2方法检测的aP2水平。图4e是一种柱状图表，它显示了瘦(WT正常的食谱，RD)，饮食多脂(WT高脂肪饮食，HFD)或者致轻素缺乏的遗传的多脂(ob/ob)的老鼠中血清aP2。p < 0. 05。图4f是一种柱状图表，它显示了那些进行骨髓移植的老鼠中血清aP2。骨髓移植在WT和aP2_malI-A(DKO)老鼠之间进行并且使用aP2酶联免疫吸附测定血清aP2。
图5a是一种柱状图表，它显示了无限制的喂养(0)，昼夜的禁食(24)或者昼夜的禁食后四小时重复喂养(28)。*，p < 0. 05。图5b是一种电泳的凝胶图片，它显示了用MBX/dbcAMP(I/C)和胰岛素(Ins)处理的脂肪细胞的条件培养基(CM)或者全部细胞裂解物(WCL)中的aP2。图5c是一种电泳的凝胶图片，它显示了用佛司可林(FSK)或者IBMX处理的脂肪外植体的条件培养基(CM)或者全部细胞裂解物(WCL)中的aP2。图5d是一种柱状图表，它显示了同它们的最初的aP2水平相比用盐水(对照)或者异丙基肾上腺素注射来诱导脂肪分解的老鼠的血清aP2水平。图5e是一种电泳的凝胶图片，它显示了用棕榈酸(C 16)或者硬脂酸盐(C 18)处理的脂肪外植体的条件培养基(CM)或者全部细胞裂解物(WCL)中的aP2。图5f —种显微照片，它显示了前成脂肪细胞表达的GFP_aP2在正常的培养基(对照)或者包含0. 5mM棕榈酸的培养基中培养整夜。图5g—种电泳的凝胶图片，它显示了用IBMX/dbcAMP(I/C)或者DEUP处理的脂肪外植体的条件培养基(CM)或者全部细胞裂解物(WCL)中的aP2。图5h是一种柱状图表，它显示了灌输盐水(对照)或者内脂/肝素(脂质)五小时的老鼠中血清aP2。这些图表证实aP2分泌是通过脂肪分解释放的脂肪酸来活化的。图6a是一种柱状图表，它显示了注射aP2抗体前后老鼠中中血清aP2。顶部面板，那些维持高脂肪食谱并且被注射预免疫的(对照)或者aP2抗体两个星期的老鼠中血清aP2。血清aP2水平用酶联免疫吸附aP2方法测定。*，p<0.05。底部面板，使用抗aP2抗体免疫印迹从那些维持高脂肪食谱并且被注射预免疫的(对照)或者aP2抗体两个星期的老鼠的脂肪组织中萃取的总蛋白。图6b是一种柱状图表，它显示了带有减少的血清aP2的肥胖的老鼠中葡萄糖水平。维持高脂肪食谱的WT老鼠被注射预免疫的(对照)或者aP2抗体两个星期然后食物戒除6小时后测定葡萄糖水平。*，p < 0. 05。图6c是一种线形图，它显示了那些注射了预免疫的(对照)或者aP2抗体两个星期的维持高脂肪食谱的老鼠的葡糖耐量试验。*, p < 0. 05。图6d是一种线形图，它显示了那些注射了预免疫的(对照)或者aP2抗体三个星期的维持高脂肪食谱的老鼠的胰岛素耐量试验。*，p < 0. 05。图6e是一种柱状图表，它显示了在高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究过程中注射了预免疫的(对照)或者aP2抗体的维持高脂肪食谱的老鼠中基本的肝葡萄糖生产率(bHGP)。木，P < 0. 05。图6f是一种柱状图表，它显示了在高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究过程中注射了预免疫的(对照)或者aP2抗体的维持高脂肪食谱的老鼠中基本的钳夹肝葡萄糖生产率(cHGP)。p < 0. 05。图6g是一种柱状图表，它显示了在高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究过程中注射了预免疫的(对照)或者aP2抗体的维持高脂肪食谱的老鼠中葡萄糖液输注速率(GIR)。*，p< 0. 05。图6h是一种柱状图表，它显示了在高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究过程中注射了预免疫的(对照)或者aP2抗体的维持高脂肪食谱的老鼠中全身葡萄糖代谢(RD)。、
图6i是一种线形图，它显示了正常的食谱基础上注射对照Gus蛋白质或者重组aP2两个星期的老鼠的葡糖耐量试验。*，p < 0. 05。图6 j是一种柱状图表，它显示了在高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究过程中那些灌输了对照Gus蛋白质或者重组aP2的aPZ-mall+老鼠的基本的肝的葡萄糖生产率(bHGP)。木，P < 0. 05。图6k是一种柱状图表，它显示了灌输了对照蛋白质或者重组aP2 (顶部面板)WT老鼠或者注射了对照或者aP2抗体(底部面板)的HFD上老鼠的肝中基因表达。肝组织中PEPCK和葡糖-6-磷酸用定量的实时PCR测定。*，p<0. 05。这些图标证实了通过血清aP2全身性葡萄糖体内平衡的调节。图7a是一种电泳凝胶的图片，它显示了 aP2非经典的分泌。使用抗aP2或者脂联素抗体印迹来自用对照，布雷菲德菌素A(BrefA)或者莫能菌素(Mon)处理的脂肪细胞的条件培养基。使用抗aP2抗体也印迹全部细胞裂解物(WCL)。图7b是一种电泳凝胶的图片，它显示了 aP2至外来体的定位。使用抗aP2或者MFG-E8抗体印迹来自不同的脂肪细胞的全部细胞裂解物(WCL)，条件培养基(CM)和外来体部份(；Exo)。图7c是一系列简图，它显示了 WT和突变的aP2的结构和表面电荷。顶部面板WT和两个aP2突变株的三维结构，底部面板WT和两个aP2突变株的静电位。这些透视图是用PyMol制作的(http://pymol. sourceforge. net/)并且WT aP2基于过去描述的三维结构(PDB ID 1LIE)。图7d是一种电泳凝胶的图片，它显示了使用抗性标记抗体印迹WT或者变异的aP2转染的来自人胚肾293细胞的全部细胞裂解物(WCL)，外来体部份和免疫沉淀的条件培养基。图7e是一种使用抗aP2或者MFG-E8抗体印迹蛋白质印迹外来体的图片，这些外来体从来自对照脂肪细胞或者佛司可林，IBMX，或者棕榈酸盐处理的脂肪细胞中分离得到。图7f是一种使用抗aP2或者MFG-E8抗体印迹蛋白质印迹外来体的图片，这些外来体从来自aP2+的WT老鼠或者维持高脂肪食谱的WT老鼠的血中分离得到。图7g是一种简图，它显示了 aP2分泌的机制。通过禁食或者P _肾上腺素功能药物刺激的脂解作用的活化，aP2改变位置到脂滴的表面，在那它可以结合到脂解作用释放的脂肪酸。脂肪酸结合触发信号，该信号把aP2靶向到外来体，在外来体上它释放进细胞间隙和血流中。然后aP2传播到肝脏然后调节葡糖异生作用。这些图表证实了依赖外来体的aP2的分泌。图8.是一种免疫印迹，它显示了来自WT和ob/ob老鼠的脂肪外植体的aP2分泌。瘦和肥胖的老鼠的脂肪外植体中aP2分泌。从维持正常的食谱的WT老鼠或者ob/ob老鼠收集脂肪外植体然后彻底地洗涤。加入新鲜的培养基然后培养过夜，然后收集用于使用抗aP2或者脂联素抗体的免疫印迹分析。图9是一系列免疫印迹，它显示了 aP2抗体的专一性。用SDS-PAGE分辨来自WT或者aP2+脂肪细胞的细胞裂解物然后使用纯化的预免疫的免疫免疫球蛋白G或者抗aP2免疫免疫球蛋白G免疫印迹。图IOa和b是柱状图表，它显示了 aP2抗体处理的老鼠的体重和血清游离脂肪酸。在抗体给药的O和14天记录用预免疫的(对照)或者aP2抗体处理的老鼠的体重。血清游离脂肪酸使用一种商品化的试剂盒(Wako化学试剂，美国，有限公司)来检测。

图11是一种柱状图表，它显示了注射重组aP2后WT老鼠中血清aP2。在注射aP2后指明的时点收集老鼠的血清样品然后用aP2酶联免疫吸附测定aP2水平。图12a_b是柱状图表，它显示了注射重组aP2的老鼠的体重和血清游离脂肪酸。用对照或者重组aP2蛋白质注射的老鼠的体重在蛋白质给药的0和14天记录。a收集注射了对照或者重组aP2蛋白质的老鼠的血清，蛋白质给药的0和14天记录。使用一种商品化的试剂盒(Wako化学试剂，美国，有限公司)测定血清游离脂肪酸。图13是一种线形图，它显示了在aP2输注过程中FABP缺乏的(DKO)老鼠中血清aP2。在指明的时间点输注aP2的过程中从FABP缺乏的老鼠收集血清样品。用aP2酶联免疫吸附方法测定aP2水平。
具体实施例方式aP2作为脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(AFABP)，脂肪酸结合蛋白_4(FABP_4)和脂肪细胞脂质结合蛋白(ALBP)也为人所熟知。在本发明之前，aP2被认为是一种细胞溶质蛋白质。分泌的脂肪的脂质伴侣，aP2，现在发现能调节肝的葡萄糖新陈代谢。aP2被发现是一种老鼠及其他哺乳动物例如人的细胞中分泌的似脂肪的蛋白质。血清aP2调节全身性葡萄糖代谢。一种减少一种以异常升高的aP2循环为特征的临床病症的症状的方法通过给患者一种通过细胞分泌的aP2的抑制剂或者给一种aP2阻抑剂来进行。例如，按照这种抑制剂或者药剂给药葡萄糖不耐性会减少。组合物抑制通过一种脂肪细胞或者巨噬细胞分泌的aP2。做为选择，典型的组合物例如结合到循环的aP2的抗体，由此减少了血或者血清中aP2的水平或者活性。鼠和人aP2的核酸和氨基酸序列的描述见下面。表 I :鼠 aP2 互补 DNAI cctttctcac ctggaagaca gctcctcctc gaaggtttac aaaatgtgtg atgcctttgt61 gggaacctgg aagcttgtct ccagtgaaaa cttcgatgat tacatgaaag aagtgggagt121 gggctttgcc acaaggaaag tggcaggcat ggccaagccc aacatgatca tcagcgtaaa181 tggggatttg gtcaccatcc ggtcagagag tacttttaaa aacaccgaga tttccttcaa241 actgggcgtg gaattcgatg aaatcaccgc agacgacagg aaggtgaaga gcatcataac301 cctagatggc ggggccctgg tgcaggtgca gaagtgggat ggaaagtcga ccacaataaa361 gagaaaacga gatggtgaca agctggtggt ggaatgtgtt atgaaaggcg tgacttccac 421 aagagtttat gaaagggcat gagccaaagg aagaggcctg gatggaaatt tgcatcaaac481 actacaatag tcagtcggat ttattgtttt ttttaaagat atgattttcc actaataagc541 aagcaattaa ttttttctga agatgcattt tattggatat ggttatgttg attaaataaa601 acctttttag actt(SEQ ID NO 1)表 2 :人 aP2 互补 DNAI ggaattccag gagggtgcag cttccttctc accttgaaga ataatcctag aaaactcaca61 aaatgtgtga tgcttttgta ggtacctgga aacttgtctc cagtgaaaac tttgatgatt121 atatgaaaga agtaggagtg ggctttgcca ccaggaaagt ggctggcatg gccaaaccta
181 acatgatcat cagtgtgaat ggggatgtga tcaccattaa atctgaaagt acctttaaaa241 atactgagat ttccttcata ctgggccagg aatttgacga agtcactgca gatgacagga301 aagtcaagag caccataacc ttagatgggg gtgtcctggt acatgtgcag aaatgggatg361 gaaaatcaac caccataaag agaaaacgag aggatgataa actggtggtg gaatgcgtca421 tgaaaggcgt cacttccacg agagtttatg agagagcata agccaaggga cgttgacctg
481 gactgaagtt cgcattgaac tctacaacat tctgtgggat atattgttca aaaagatatt541 gttgttttcc ctgatttagc aagcaagtaa ttttctccca agctgatttt attcaatatg601 gttacgttgg ttaaataact ttttttagat ttag(SEQ ID NO :2)表3 :人aP2的氨基酸序列MCDAFVGTWKLVSSENFDDYMKEVGVGFATRKVAGMAKPNMIISVNGDVITIKSESTFKNTEISFILGQEFDEVTADDRKVKSTITLDGGVLVHVQKffDGKSTTIKRKREDDKLVVECVMKGVTSTRVYERA(SEQ ID NO :4)表4 :鼠aP2的氨基酸序列MCDAFVGTWKLVSSENFDDYMKEVGVGFATRKVAGMAKPNMIISVNGDLVTIRSESTFKNTEISFKLGVEFDEITADDRKVKSIITLDGGALVQVQKWDGKSTTIKRKRD⑶KLWECVMKGVTSTRVYERA(SEQ ID NO 5)aP2分泌的调节为了证实aP2被释放进入细胞表面，由于存在的aP2在蛋白质印迹中分析来自WT或者FABP缺乏的脂肪细胞的条件培养基和细胞裂解物(图la)。发现aP2大量地存在于条件培养基中同时两个脂肪细胞，caveolin和AKT中细胞溶液蛋白质在相同情况下是不可检测的的(图Ia)。Mali，脂肪细胞中FABP的一种次要的同工型，它们与aP2有高度的同源性，也被释放进入条件培养基(图Ia)。总起来说，两个脂肪的FABP是从不同的脂肪细胞分泌的。为了探查老鼠中血清aP2然后用aP2酶联免疫吸附系统进行研究。ap2以可观的数量(200至300ng/ml)存在于WT和mall+老鼠中，但是从aP2〃-或者aPZ-mairA老鼠的血清中是不可检测的得的(图Ib)。血清aP2的量比肥胖因子，瘦素(10ng/ml)多20倍并且比肥胖因子，脂联素(2-5mg/ml)稍低。为了探究有关代谢疾病背景中长期的血清aP2调节，将那些通过高脂肪食谱喂养或者瘦素缺乏来诱导的瘦的和肥胖的老鼠的血清作比较(图Ic)。两个肥胖模型(图Ic)血清aP2都深深地增加，表明那些分泌的aP2可能是功能性的和在病理学的条件下改变代谢调节有关系的。在两个脂肪细胞和巨噬细胞中都表达aP2并且从发展的代谢疾病的任何一个位点保护的老鼠中aP2的功能突变损失(Furuhashi等，2008，J Clin Invest. 118 :2640-50 ；Maeda et al. ,2005, Cell Metab 1，107-119.)也发现aP2通过巨噬细胞分泌(图Id插入物)。肥胖的老鼠在脂肪组织中积聚巨噬细胞，它捐献了胰岛素抗性。所以，增加的血清aP2是从任何一个细胞表型解除增加的aP2的结果。为了测定哪个位点弓I起肥胖的血清aP2增加，将骨髓移植到WT和FABP缺乏的老鼠之间。这些老鼠中血清aP2被检验。在FABP缺乏的的老鼠中从WT老鼠中衍生的骨髓细胞不能持续有可检测的血清aP2水平(图Id)，表明代替造血细胞的那些脂肪细胞，是老鼠中血清aP2的主要贡献者。血清aP2调节全身件的葡萄糖代谢脂肪细胞分泌的激素(也就是，肥胖因子)在葡萄糖和脂类代谢中起作用(Rosenet al. ,2006, Nature 444:847-853)。因为在肥胖和糖尿病情况下aP2是增加的，如果增加的aP2在如肥胖中所示的改变葡萄糖代谢中起作用，进行实验来测定肥胖中血清aP2是否减少将改善甘油对照。为了有效地耗尽血清aP2，开发了一种特定的识别aP2的抗体。使用该抗体的研究证实它以非常高的灵敏性精确地检测aP2(图2a)。将这些抗体注入到肥胖的老鼠中。通过高脂肪喂养16星期促使这些老鼠肥胖。aP2抗体有效地的给药并且迅速地压制血清aP2浓度(图2B)。该aP2抗体治疗没有改变这些老鼠的体重但是在给药两周后引起了一种显著减少的血糖水平(图2c)。用aP2抗体注射的老鼠也有显著地改善的葡萄糖消除速率和改善的胰岛素应答，葡萄糖消除速率和胰岛素应答通过葡萄糖和胰岛素耐量试验(图2d和2e)测定。事实上，aP2抗体治疗实质上消除了与这些老鼠中肥胖的饮食有关的葡萄糖不耐性，表明减少的血清aP2给予了一种对于那些遭受II型糖尿病的临床的益处。为了测定aP2体内作用的位点，进行了高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究。发现接受aP2抗体注射的老鼠有减少的肝的葡萄糖生产率(图2g)，表明肝是aP2抗体的葡萄糖下降效果的一个主要的目标。测定增加的血清aP2的代谢输出的相应的实验中，纯化的重组aP2被生产出来并注射到有意识的FABP缺乏的老鼠中。然后进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究来监测这些老鼠全身的葡萄糖代谢。输入aP2的FABP+老鼠有显著地增加的基本的肝葡萄糖生产速率(bHGP)(图2g)。考虑这些老鼠已经在bHGP检测到后灌输aP2仅仅4小时这是一个深刻的效果。为了进一步地研究增加的血清aP2的效果，腹膜注射重组aP2到WT老鼠维持正常的食物食谱。aP2给药没有改变该老鼠的体重但另外的瘦的和健康的老鼠，如接受aP2注射两个星期后通过葡糖耐量试验测定所示，发展成葡萄糖不耐性(图2h)。这些观测表明血清aP2调节全身性葡萄糖代谢并且在一个短周期中单独增加的血清aP2可以引起不依赖体重变化和饮食的影响的削弱的葡萄糖消除。脂肪组织和代谢紊乱最近15年积累的证据已经建立脂肪组织作为担负代谢调节的最大的内分泌器官的一种。脂肪组织在全身性能量体内平衡的效果通过各种各样的激素来调节。肥胖的患者中脂肪组织也有表现为生产一个生长的炎性细胞因子表，并且慢性的脂肪发炎作为一种与肥胖连接的和有关的代谢紊乱的重要的特征。因此，在生理学的和病理的环境中，脂肪组织代表了一个关键位点，在该位点营养的和内生的信号分子相互作用和结合，最终产生能量体内平衡的全身性调节。作为身体的主要的脂质存储位置，在禁食期间脂肪组织也是关键的能源供应者。脂肪的脂解作用贡献了大部分对于血清的脂肪酸，它在肌肉中被认购并氧化以及在肝中激活葡萄糖生产。升高的肝葡萄糖生产率相关的脂解作用是为大家所熟知的肥胖中失调的一个关键的自我平衡的现象。在本发明之前，该机制没有完全弄明白，通过这个机制这个过程在脂肪组织和肝之间发出信号。较早的研究表明脂肪组织脂质侣伴蛋白，和特别地aP2中，是带有代谢和发炎的应答的脂质信号的重要的结合体。这些侣伴蛋白中老鼠缺乏的，通常所说的脂肪酸结合蛋白(FABP)，显示出与肥胖有关许多的代谢异常的标记保护措施，这些代谢异常包括胰岛素抗性，2型糖尿病，肝细胞脂肪变，和动脉粥样硬化。脂肪组织中FABP缺乏的效果是全身性，如通过代谢途径中全局变换和肝，肌肉及其他组织的应答作为证据。、
可以调节FABP缺乏的脂肪组织的有益的效果的分泌脂肪分子研究中，一个脂肪酸，C16:ln7-棕榈酸被发现。这个脂肪酸有力地增加了肌肉胰岛素作用，同时压制肝的脂肪浸润。另一方面，FABP缺乏中肽类激素的角色是较少清楚的。无效的FABP老鼠有改变的瘦素和脂联素的水平，但是详细研究证实两者都不引起FABP缺乏的老鼠改善的葡萄糖和脂类代谢。aP2本身已经在人类血清中鉴别，这提高了血清aP2可能涉及肥胖中代谢调节的可能性。如果这个分子以一种调节的方式从脂肪细胞中分泌，FABP缺乏的老鼠中改善的葡萄糖代谢作为血清aP2损失的结果可以至少部分地存在。下列材料和方法用于产生在此描述的数据。动物aP2和mall中带有同型接合的无效的突变的老鼠逆代杂交超过12世代到C57BL/6J遗传背景。老鼠在四周龄维持正常的食物食谱(RD)或者置于高脂肪食谱(研究食谱，有限公司)20星期以诱导饮食的肥胖。从杰克逊实验室购买瘦素缺乏的(ob/ob)老鼠。所有的老鼠维持12小时光照和黑夜的循环。使用标准方法进行葡萄糖和胰岛素耐量试验。血清aP2的定暈戒除食物6小时后通过尾部放血从老鼠收集血然后在离心分离机中13000rpm离心30分钟。血清aP2用ELISA系统(Biovendor公司)检测。为了监测血清aP2营养的调节，在老鼠没有食物置于笼中后黑暗循环开始之前立即从老鼠中收集血样。昼夜的禁食后，收集第二套血样然后提供食物。最后的采血在恢复喂养后4小时进行。在脂解作用的期间测定aP2水平在基本的水平下从12只老鼠收集血。此后给6只老鼠注射异丙基肾上腺素(10mg/kg体重)然后另外6只接受输入对照。注射后15分钟收集血样用于aP2测定。骨髓移棺用为了最小化辐射毒性通过四小时间隔分开铯辐射源的两个5Gy剂量(总的IOGy)照射六周龄接受的老鼠。通过用Gibco RPMI 1640培养基(Invitrogen，卡尔斯巴德，加拿大)冲洗股骨和胫骨从六个相应的供体老鼠￠-8周龄)收集骨髓。第二次照射后的四小时，0. 2毫升培养基中5xl06骨髓细胞注射到眼眶后的静脉丛中。一星期之前开始然后骨髓移植后四星期，加入IOOmg/1新霉素和10mg/l硫酸多粘菌素B到酸化的水中。牛产，纯化以及重组aP2和aP2抗体的给药重组aP2或带有6X His标签的对照的Gus蛋白在E. coli中生产并用B-PER 6x旋转纯化试剂盒(Pierce技术有限公司)纯化。通过使用商业系统(Lonza有限公司)除去内毒素进一步纯化蛋白。将IOOii g的对照或者aP2蛋白注射到WT鼠中，这些老鼠在两星期中维持每天两次喂食。使用重组的全长的aP2蛋白生产抗鼠aP2的兔多克隆抗体并使用NAb 旋转系统(Pierce技术有限公司)从最后的血的血清中纯化得到抗体。采用同样的方法纯化预免疫的血清并用作对照。纯化后的抗体在盐水中稀释到I U g/ul并注射到鼠中，这些老鼠维持剂量在50mg/kg的高脂肪食物(研究食物有限公司)载体构津和转染标签标记的GFP (质粒编号10825)和AKT (质粒编号9021)从Addgene获得。标签标记全长和较少部分的aP2从pEGFP-Cl中克隆得到。aP2K22，59I变株用快速诱变系统(Stratagene)制得。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)用需要的载体转染HEK293 细胞。细胞培养人胚肾293细胞在带有10%胎牛血清的DMEM中培养。FABP缺乏的细胞系按照过去描述的方法建立° Cao, H. et al. Identification of a lipokine, a lipidhormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell 134,933-944(2008).Makowski, L et al. Lack of macrophage fatty-acid-binding protein aP2 protectsmice deficient in apolipoprotein E against atherosclerosis. Nat Med 7,699-705 (2001).。预脂肪细胞在带有10%牛的小牛血清中培养然后使用标准分化方案在带有10%加强型胎牛血清的DMEM中分化成脂肪细胞。为了诱导脂解作用，不同的脂肪细胞用20nM佛司可林，或者ImM IBMX/lmM双丁酰cAMP处理I个小时。对于脂质治疗，0. 25mM棕榈酸盐或者硬脂酸盐溶于带有10% CCS的DMEM中然后加入到12孔板的脂肪细胞中培养。在一个小时结束时，该培养基被替换为相同包含脂质的培养基，然后再一个小时以后收集条件培养基。为了收集脂肪外植体，从老鼠解剖到附睾的脂肪组织贮藏库然后在PBS中漂洗两次。然后将脂肪组织样品转移到带有10% CCS的DMEM中并粉碎到平均直径I到2毫米大小。用DMEM广泛地洗涤组织外植体然后在包含10% CCS的DMEM中培养。如脂肪细胞相同的方式诱导脂解作用。费光显微镜方法细胞在盖片的6孔板中培养并在4%多聚甲醛中固定。细胞核用DAPI染色，用盖玻片盖上带有延长黄金抗突光淬灭封片试剂的载玻片(invitrogen公司)。在蔡司观测器Zl荧光显微镜进行拍照。外来体的分离为了从脂肪细胞分离外来体，收集条件培养基然后在l，200g离心10分钟。然后用0. 45 iim过滤器过滤培养基，在20%蔗糖梯度负载上10，OOOg离心30分钟两次。通过在100，OOOg下150分钟离心作用将外来体部份压成丸。为了从血清分离外来体，收集老鼠的血然后在微型离心机中以最高速度离心30分钟来收集血浆。以等体积的PBS稀释血浆然后负载20%蔗糖梯度并且通过200，OOOg下90分钟的离心作用将外来体压成丸。RNA提取和实时定量PCR分析使用Trizol试剂(Invitrogen)从肝组织分离总的RNA。用带有一个上标的前导串互补DNA合成系统(应用生物系统公司)进行反转录。在一个PCR热循环控制装置(应用生物系统公司)上使用I U g的RNA.进行定量的，实时RT-PCR。该PCR程序是95°C酶活化2分30秒，95°C 15秒，58°C 30秒，和72 °C I分这样的40次循环用于扩增。进行解链曲线分析来证实实时PCR产物。所有的定量归一化到18SrRNA。使用的引物序列如下PEPCK,前端CTGCATAACGGTCTGGACTTC(SEQ ID NO :6)，反向CAGCAACTGCCCGTACTCC (SEQID NO 7)；葡糖-6-磷酸，前端CGACTCGCTATCTCCAAGTGA(SEQ ID NO :8)，反向GTTGAACCAGTCTCCGACCA(SEQ ID NO :9)。
卡马斯亮蓝染色，免疫沉淀和免疫印迹来自脂肪细胞的组织蛋白裂解物和条件培养基在SDS-PAGE上分离然后用考马斯亮蓝染色(Biorad实验室)，或者使用以下抗体免疫印迹来检测，这些抗体包括来自SantaCruz生物技术的脂联素,来自Calbiochem的MFG-E8,来自BD生物科学的caveolin-1,来自细胞信号技术的AKT。用30微升标记琼脂糖珠(Sigma)4°C过夜培养后使用从转染的人胚肾293细胞的4毫升条件培养基免疫沉淀标记标记的aP2。结合到琼脂糖珠的蛋白质用带有SDS上样缓冲液洗脱然后用SDS-PAGE分辨开。脂肪乳剂和aP2输注 实验前四天，向腹膜内注射开他敏(90毫克/公斤体重)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤体重)使老鼠麻醉。用PE-10聚乙烯管(内外直径分别为，0. 28毫米和0.61毫米；BeCtonDickinson，富兰克林湖，NJ)在他们的右侧颈静脉插入导管，管中充满肝素溶液(100USP U/ml)。导管的顶端深入皮下，具体的在肩胛间的区域，然后打结对于固定。在实验之前整夜紧缚该老鼠然后按3ml/kg/h (Abbott)输注脂肪乳剂和肝素(6U/h)五小时。以8 y g/kg/min的速度输注重组aP2五小时。高胰岛素-IH葡萄糖钳夹研究如上所述给老鼠插上导管。通过步骤15报告的一个改良法进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹。在一整夜的紧缚后，在2小时基本的时期内注入高效液体色谱纯化[3- ]-葡萄糖(0. 05 V- Ci/min ；PerkinElmer生命和分析科学波士顿，MA),然后在最后收集血样来评价基本的肝葡萄糖生产速率。在该基本的时期之后，按12. 5mU/kg/min的速度连续灌注人类胰岛素(律草素R ；Eli Lilly,印第安纳波利斯，印度)来实施一个120分钟的高胰岛素-正葡萄糖钳夹。每隔20分钟收集血样用于快速检测血浆葡萄糖浓度，然后以变化的速率注入25%葡萄糖来保持血浆葡萄糖在一个基本的浓度。通过钳夹连续的输注[3- ]葡萄糖(0. I u Ci/min)来评价胰岛素刺激的全身的葡萄糖翻转。所有的输注使用流动对照的微量渗析泵进行(CMA/微量渗析，北切姆斯福德，MA)。在钳夹开始后80，85，90，100，110，和120分钟取血样用于检测血浆[3- ]-葡萄糖，和3H20浓度。在钳夹末端，动物是牺牲的。5分钟内，收获肝组织然后储存在_80°C用于进一步地分析。从体外脂肪细胞分泌aP2因为它的初始识别，aP2已经被认为是细胞质基质蛋白但是最近在不同的3T3-L1脂肪细胞的表面的和随后人类血清中通过蛋白质组学筛选鉴别出来。进行研究来测定aP2是否通过脂肪细胞特别地分泌或者在细胞翻转期间释放。从野生型(WT)或者FABP缺乏的脂肪细胞收集的条件培养基和细胞裂解物aP2水平的检测显示WT细胞的条件培养基中大量的存在这种蛋白质(图4a)。相比之下，脂肪细胞中两种大量的细胞质基质蛋白质，caveolin和Akt，在相同的条件下是不可检测的，显示了主动分泌可能性(图4a)。然而，作为一种脂肪细胞中最大量的细胞质基质蛋白质，条件培养基中aP2的存在仍然可以归因于由细胞死亡和/或溶菌作用引起的非特异性释放。为了定性aP2从细胞中出来，将标记标记的aP2转染进入人胚肾293细胞以及同样地标记GFP和Akt作为对照然后小心地滴定每个质粒的数值以保证所有的蛋白质在细胞内部以相似的水平表达(图4b)。这些数据表明aP2是积极地分泌的并且它存在与条件培养基中并不是因为非特异性细胞裂解或死亡。为了研究所有的脂肪细胞分泌的蛋白质间的aP2的相对丰度，通过一维电泳分解从脂肪细胞的条件培养基。这些数据显示aP2是来自脂肪细胞的大量分泌的蛋白质的一种(图4c)，它有与脂联素比得上的水平，并且表明aP2在细胞外有重要的生物机能。体内aP2分泌的调节
为了检验aP2分泌的调节，通过应用酶联免疫吸附系统检验老鼠中aP2的血清水平在WT和mall+老鼠，血清中aP2存在一个相当可观的水平(100到300ng/ml)，但是在aP2-/-m aPZ-mall+对照中是探测不到的(图4d)。血清aP2比瘦素(大约12. 5ng/ml)多10到30倍，但是仍然显著的低于脂联素的水平(5-lOyg/ml)。为了探究代谢疾病环境中血清aP2的调节，比较了瘦的老鼠血清分布以及遗传的和食谱诱导的肥胖的老鼠模型。在两个肥胖模型中血清aP2显著地增加( 四倍)(图4e)，表明在病理学的条件下aP2可能与改变代谢调节有关系。一致地，增加的循环aP2水平已报道与人类的肥胖有关。在肥胖的过程中增加的aP2水平可能是由于升高的aP2表达，扩展的脂肪质量或者增加的aP2分泌。虽然大家都知道肥胖对总的aP2表达没有巨大的影响，进行研究来区别增加的大量脂肪质量或者一种分泌失调是否引起肥胖的老鼠中观察到的血清aP2水平升高。从瘦的和肥胖的老鼠(ob/ob)收集脂肪外植体并且外植体培养中自体内释放aP2被检测到。来自肥胖的老鼠的脂肪外植体的平均的质量的aP2的分泌显著地高于那些来自瘦的对照，表明那些肥胖的老鼠aP2分泌失调(图8)。在肥胖的外植体中脂联素分泌显著地减少，证实脂肪组织的分泌腺轮廓中这些系统的保真度(图8)。在脂肪细胞和巨噬细胞两者中表达aP2并且在任何一个细胞表型中aP2的功能突变的损失可以有助于改善老鼠中的代谢应答。因为肥胖的老鼠在脂肪组织中积累巨噬细胞，一种作用是有助于胰岛素抗性，血清中和脂肪外植体中增加的aP2可能是由于从脂肪组织巨噬细胞增加的aP2释放。为了检验细胞表型引起的肥胖的环境中增加的血清aP2，在WT和FABP缺乏的老鼠之间进行骨髓移植。血清的检验显示来自WT老鼠的骨髓衍生的细胞在FABP缺乏的老鼠中不能持续有可检测出的的血清aP2水平。(图4f)。这个发现支持脂肪细胞而不是造血细胞，是老鼠中血清aP2的主要的贡献者，和aP2是一种新的肥胖因子用来肥胖中改变血清分布。通过脂解作用释放脂肪酸调节aP2的分泌进行研究评价从脂肪细胞分泌的代谢有活性的蛋白质是否将通过代谢状态和营养的波动来调节。这种调节可以在病理学的条件下失调的机制上阐明。因此，进行实验来测定血清aP2水平在响应禁食和恢复喂养中的变化。禁食24小时的老鼠中循环aP2水平与无限制喂养期间相比显著地增加，但是在4小时的恢复喂养后很快地被压制(图5a)。所以，养分和可以调节血清aP2水平，反过来它表明aP2可能是调节能量体内平衡的全身性程序中的一部分。能量体内平衡中脂肪组织的主要功能是在禁食期间对于其他的组织经由脂解作用提供脂肪酸。为了研究aP2分泌是否与脂解作用相联系，预脂肪细胞被分化并且刺激细胞中脂解作用。异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和dbcAMP治疗在一个小时内从脂肪细胞的aP2分泌稳固的增加(图5b)。当用胰岛素辅助处理细胞来压制脂解作用，aP2分泌被压制(图5b)。为了进一步地研究组织环境中来自脂肪细胞的aP2分泌，收获脂肪外植体然后自体内培养。在基本的条件下或者当脂解作用.的刺激时检验aP2分泌。IBMX或者佛司可林治疗引起aP2分泌大幅度增加(图5c)证实这个过程与脂解作用紧密的联系到一起。为了探究体内aP2分泌上的脂解作用的影响，给老鼠注射异丙基肾上腺素，一个-肾上腺素能受体促效药，它强烈地激活脂解作用。接受异丙基肾上腺素的老鼠显示与用载体处理的对照动物相比血清aP2水平急速地增长(图5d)，这表明通过体内脂解作用调节aP2分泌而且在禁食、期间老鼠中血清aP2升高是由脂肪组织中增加的分解脂肪的能力所引起的。为了进一步地研究是否通过释放的脂肪酸调节aP2分泌，用棕榈酸盐和硬脂酸盐处理脂肪细胞。两种脂质显著地增加aP2分泌(图5e)。脂肪酸治疗也引起对于脂类小滴的GFP标记的aP2的易位(图5f)，这表明脂质也调节aP2的细胞定位并且将其靶向到分泌的途径。脂解作用是一个涉及多重信号途径的复杂的过程，许多这些多重信号途径可能地调节aP2分泌。为了测定脂解作用诱导的aP2分泌中脂肪酸的有效性，用二乙基伞形酮酰磷酸盐(DEUP)，一个甘油三酸酯水解酶抑制剂，按照脂解作用的诱导来阻止脂肪酸从甘油三酸酯(TG)储备重释放，来处理脂肪细胞。DEUP治疗完全阻断脂解作用诱导的aP2分泌，表明脂肪酸释放是需要aP2分泌的(图5g)。为了测试体内aP2分泌上脂肪酸的效果，向生存有意识的老鼠输注一种脂肪乳剂/肝素。通过脂肪乳剂输注增加的血清脂肪酸也诱导aP2分泌(图5h)，这表明脂肪酸刺激体内aP2分泌。血清aP2精密的调节老鼠中肝的葡萄糖代谢缺乏FABP的老鼠被代谢综合症，特别地2型糖尿病重复的元件保护。人类升高的血清aP2也报导与糖尿病，心血管疾病及其他代谢病症相联系。然而在本发明之前，循环aP2和脂质和/或碳水化合物代谢之间的因果关系还没有建立。aP2分泌紧密结合到脂解作用表明血清aP2可能在脂肪酸中的波动引起的代谢调节上有协同效应。在肥胖期间脂解作用升高的水平释放过量的脂肪酸到血清中。这些脂肪酸引起胰岛素抗性并且通过激活糖原异生程序增加肝葡萄糖生产率。所以，循环aP2代表调节这种效果的目标。代谢调节的FABP缺乏的有益的效果可以通过血清中aP2的功能的损失被调节，至少部分地调节，它的水平在肥胖中显著地升高。为了研究这种假设，开发了一种中和抗体来减少血清aP2。本抗体带有很高的灵敏性特别地检测aP2(图9)。把这种抗体注入到肥胖的老鼠中喂以高脂肪食谱，结果证实aP2抗体有效地并迅速地耗尽血清aP2到脂肪组织中没有改变的aP2水平的瘦的对照中可见的水平(图6a)。抗体给药没有改变身体重量或者这种老鼠的血清游离脂肪酸水平(图10)，但是引起两周治疗内血糖水平显著的减少(图6b)。在一个葡糖耐量试验中，老鼠接受aP2抗体与对照动物相比显示出显著地改善的葡萄糖消除曲线(图6c)。带有减少的血清aP2的肥胖的老鼠当通过胰岛素耐量试验测定时也显示出增强的全身性胰岛素应答(图6d)。这些结果表明升高的血清aP2代表对于肥胖诱导的胰岛素抗性和葡萄糖不耐性的一个要求的元件，而且压制的循环的aP2作为阻碍与肥胖有关的代谢衰退的方法是有用的。总体葡萄糖通量和抗体调节aP2减少的组织特异的效果通过在用aP2抗体或者载体治疗的老鼠中使用高胰岛素正葡萄糖钳夹研究来检测。肥胖的老鼠中血清aP2的减少导致显著地减少的基本的和夹紧的肝的葡萄糖生产率(图6e，f)，这表明肝是调节葡萄糖代 谢中循环aP2的主要目标。在钳夹的研究期间，给肥胖的老鼠注射要求一种显著地增加的葡萄糖液输注速率以保持血糖正常，但是与对照相比葡萄糖代谢的它们的速率中显示无变化(图6g，h)。这些结果表明这些动物中升高的葡萄糖液输注速率主要通过减少的肝的葡萄糖生产率驱动。这些数据和全身FABP敲除保持一致，它也以在遗传的和饮食的肥胖中显著地减少的肝的葡萄糖生产率为特征。所以，肝的葡萄糖代谢上的aP2的效果主要地通过这些蛋白质的分泌形式来调节循环aP2调节肝葡萄糖生产为了直接确立升高的血清aP2是否有一种阴性的葡萄糖代谢影响，创造了在另外的代谢正常的老鼠中升高的血清aP2的条件。把重组aP2注入到老鼠喂以一种正常的食物食谱。重组aP2的单一剂量给药到老鼠中导致血清aP2的水平增加，这要持续好几个小时(图11)。每天注射两次重组aP2以保证老鼠每个24小时时间周期的大部分期间在流通中维持升高的aP2。在这个周期内重组aP2给药没有改变身体重量或者老鼠的血清游离脂肪酸水平(图12)。瘦的健康的动物，然而，在接受重组aP2两周显示了轻度的葡萄糖不耐性，其检测采用一种葡糖耐量试验(图6i)。即使没有任何饮食的影响和身体重量的变化，这个观测表明血清aP2调节葡萄糖代谢和单独增加的血清aP2可以引起葡萄糖代谢削弱。将重组aP2注入到有意识的FABP缺乏的老鼠并检验带有高胰岛素-正葡萄糖钳夹的葡萄糖代谢上的aP2的急性效应。在这个背景中，aP2输注引起老鼠中血清aP2水平快速增加并且在持续到实验结束的一小时后建立高稳态的血清水平(图13)。在钳夹研究期间，老鼠接受aP2显示显著地增加的基本的肝葡萄糖生产速率(bHGP)(图6j)。考虑到这些老鼠仅仅接受一种ap2这是一个深刻的效果，当检验肝的葡萄糖生产率时输注aP2四小时。这些发现和葡萄糖代谢速率中不存在变化进一步地支持肝是血清aP2的主要目标的假设。aP2输注和减少实验中检查调节肝的葡萄糖生产率的基因的表达。葡糖异生作用途径中两个主要基因，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酯酶(G6P)，与那些输注aP2作为比较的对照在老鼠中都显著地高调(图6k顶部面板)。这些数据表明血清aP2调节肝中的葡糖异生作用和肥胖中血清aP2的升高的水平有助于增加的肝的葡萄糖生产率经常在低于糖尿病患者条件下观测到。外来体有关的体外和体内的aP2分泌为了更透彻地了解aP2分泌如何联系到并且通过脂解作用调节，试验了 aP2的分子机制。首先，用经典的分泌的途径的抑制剂处理不同的脂肪细胞并且在条件培养基中检验分泌的蛋白质。同时布雷菲德菌素A和莫能菌素治疗有效地阻断脂联素分泌，两者在aP2释放上都没有抑制效果(图7a)，表明aP2是经由一种非经典的途径分泌的。这个发现与aP2缺乏信号肽序列的事实一致。过去描述非经典的分泌的各种各样的机制的一种是外来体依赖的途径。为了测定aP2分泌是否利用这个途径，从脂肪细胞条件培养基中分离外来体；在这些片段中检测aP2的存在。富集aP2并且以类似于乳脂小球-EGF因子8 (MFG-E8)的方式然后胞外体部份容易检测，表明aP2实际上经由脂肪细胞中外来体分泌，MFG-E8是一种确定的外来体标记(图7b)。调节脂肪组织脂质侣伴蛋白连接脂解作用到肝的葡萄糖生产的胞外体分泌膜靶向是调节外来体分泌的主要步骤。当aP2大部分定位在胞液中，已经发现aP2短暂地影响磷脂膜。aP2的三维结构由一个10串带有两个顶部的a螺旋充当脂肪酸入口25的入口的￠-桶组成(图7c，左侧的面板)。aP2蛋白质的两个成分已经建议有助于它的薄膜关联(1)稳固的阳性表面电位的脊，通过赖氨酸残基贡献，它调节带负电的磷脂的静电相互作用并且(2)，直接对薄膜有影响的入口区域。为了探究可能从下面支撑aP2移位进入外来体的机制，创造了 aP2突变型，它带有两个临界表面残基，赖氨酸22和59，转变为异亮氨酸，(图7c，中间的面板)或者带有入口区域完全的删除部分(图7c，右侧的面板)。这些的突变没有改变aP2的总的倍数但是都阻断了 aP2从细胞中分泌(图7d)，表明与磷脂薄膜关联的aP2对于它的分泌是绝对需要的。上面描述的损失了分泌的容量的aP2突变型，也有显著地减少的外来体的定位(图7d)，表明对于aP2分泌外来体靶向是一个主要的步骤。通过脂解作用观测到aP2分泌的诱导，在脂解作用或者暴露于脂肪酸期间检验aP2移位进入外来体。在两个条件下，一个外来体中aP2纯的富集(图7e)是可见到的，表明在脂解作用的期间增加的aP2靶向到外来体导致它的分泌升高。在血中已鉴别像外来体的微泡，但是造血细胞通常被认为是这些载体的来源。为了研究aP2关联的外来体是否也存在于环流中，分离来自老鼠的血浆的外来体部份并且对aP2印迹。aP2关联的外来体存在于WT而不是aP2敲除的老鼠的环流中(图7f)，表明脂肪细胞可能分泌外来体到与其他的器官联系。结果显示肥胖的老鼠的循环的外来体中显著地增加的aP2水平，表明aP2关联的外来体可能和肥胖的代谢失调有牵连(图7f)。这些数据提供了证据，aP2是一种通过营养状况和肥胖调节新的肥胖因子。脂肪细胞中，通过脂质和脂解作用激活以及通过外来体关联的分泌的途径调节aP2分泌(图7g)。老鼠中，血清aP2全部来源于带有一个饮食的或者遗传的肥胖模型以及体内脂解作用中标记的增加的脂肪细胞。肥胖的老鼠中血清aP2的减少压制肝的葡萄糖生产率的升高，当瘦的老鼠中aP2相反的增加导致增强肝的葡萄糖生产率。这些结果表明分泌的aP2是脂肪肝的通信系统连接脂解作用到肝葡萄糖生产的关键部分(图7g)。游离脂肪酸表示在禁食期间关键的能源，但是它也认为升高的脂解作用和血清脂肪酸与全身性葡萄糖体内平衡的失调有关系和并且表示肥胖诱导的代谢疾病的关键性的支撑原因。过量脂肪酸分别引起肌肉中胰岛素抗性和肝葡萄糖利用减少和稀释的胰岛素调节抑制葡萄糖生产率。利用胰腺钳夹的对照孔的激素的条件，同时也显示脂肪酸不依赖胰岛素或者胰高血糖素作用直接增加肝葡萄糖生产率。这些效果归因于通过脂肪酸的葡糖异生作用途径的活化。一些老鼠模型和条件，已经显示肝葡萄糖生产与增加的血清脂肪酸分开，这表明其他的因子在连接脂解作用和脂肪酸到肝的葡糖异生作用时需要的。在此提供的发现确定aP2作为一种分泌的脂肪细胞蛋白质和这些因子的一种。作为一种肥胖因子的aP2的识别提供对脂肪组织的内分泌功能的几个了解视角。这个蛋白质是独特的，在于它直接结合到脂质并在脂解作用的响应中分泌的能力。因此它充当脂肪组织的脂质状态的传感器或者作为其他的代谢器官响应代谢调节或者饮食的变化的信号。另外，脂解作用刺激的，外来体关联的aP2分泌可能帮助解释脂肪细胞如何持续一个惊人的分泌的容量，尽管大量的脂类小滴和内质网上利用的限制。aP2，当通过脂肪酸激活时，移位到脂类小滴或者脂质体。脂质体作为一个交通的膜细胞器起作用，并且某些脂质体固有的蛋白质，例如perilipin A,鉴别它经由外来体分泌。然后有可能，aP2分泌的那些机制传递脂质和细胞外的蛋白质让脂肪细胞有效的满足需要(图7g)。对于脂肪的脂解作用aP2分泌和血清水平紧密结合表明aP2代表分解脂肪的应答的生理学的和/或病理生理的结果的一种新的部分。为了完全地激活肝葡糖异生作用对于 脂肪酸作为血清成分的aP2的表观的需要说明肥胖诱导的高hyper-aP2-酶倍增免疫测定可能从下面支撑升高的肝的葡萄糖生产率，也就是说带有二型糖尿病的患者中高血糖的标
O
证据指向不但在实验的模型中而且人类中代谢疾病的aP2的中心角色。当aP2抑制的治疗的值是一个临床的目标，在组织中瞄准的它的化学试剂已经被激发。在此描述的数据表明当与肥胖有关的血清aP2水平增加时使用一种中和抗体归一化，伴随脂肪组织aP2水平中没有任何变化葡萄糖代谢是非常强的。血清aP2水平与人类和禁食中与代谢疾病风险相关联，与增加的禁食的游离脂肪酸相比流通的aP2更强烈地与代谢风险有关系。为了中和血清aP2组合物的给药是一种治疗代谢失调有效的途径，尤其是二型糖尿病。其他的实施方式在下列权利要求中。
权利要求
1.一种治疗或者减少aP2调节的疾病严重程度的方法，包含给予患者一种分泌的aP2抑制剂或者一种aP2分泌的抑制剂。
2.根据根据权利要求I所述的方法，在这里所说的患者确定为是包含循环的aP2水平升高。
3.根据权利要求I所述的方法，在这里所说的疾病选自由代谢综合症，肥胖，糖尿病，脂肪肝疾病，葡萄糖不耐性，动脉粥样硬化，哮喘，高血压，中风，神经变性的疾病，慢性的血液透析作用(CD)，引起阻塞的睡眠呼吸暂停，感染艾滋病病毒病人中脂肪代谢障碍，和脂解组成的组中。
4.根据权利要求I所述的方法，其中，分泌的aP2抑制剂包含一种可溶解的aP2封堵剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，封堵剂是一种aP2特异性抗体或者它们的aP2结合片段。
6.一种预防或者减少代谢疾病的严重程度的方法，包含给予患者一种减少血清aP2浓度的组合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述血清aP2浓度减少了至少10%。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述组合物是一种aP2特异性抗体。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述的组合物是一种结合到aP2的不连续的抗原表位的抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述的抗原表位是溶液中aP2的三维的结构上露出来的表面。
11.根据权利要求9所述的方法，包含至少一种以下序列SEQIDNO 4的残基1_5，残基22，残基36-37，残基46-47，残基57，残基59-60，残基78，残基80，残基89，残基97-101，残基110-112，残基122。
12.—种减少代谢疾病症状的方法，包含给予患者一种细胞分泌的aP2的抑制剂。
13.根据权利要求12所述的方法，在这里所说的症状是葡萄糖不耐性。
14.根据权利要求12所述的方法，在这里所说的细胞是一种脂肪细胞。
15.一种治疗糖尿病的方法，包含给予诊断为有或者扩大的II型糖尿病风险的患者一种aP2分泌的抑制剂。
16.一种鉴别aP2分泌的抑制剂的方法，包含分泌的aP2细胞与待选择的化合物接触并且检测细胞外的aP2水平，其中，存在所述化合物时的细胞外的aP2与不存在所述化合物时相比减少表明所述的化合物抑制aP2分泌。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所说的细胞是一种脂肪细胞或者一种巨噬细胞。
全文摘要
一种减少以异常升高的循环中aP2为表征的临床病症的症状方法，该方法通过给予患者一种分泌的aP2的抑制剂，aP2的分泌抑制剂，或者一种血清aP2封堵剂来进行。例如，随着这种抑制剂或者药剂的给药减少葡萄糖不耐性。典型的组合物抑制aP2的抑制细胞的分泌或者结合到流通的aP2，从而减少血中或者血清中aP2的水平或者活性。
文档编号A61P3/08GK102639149SQ201080019800
公开日2012年8月15日 申请日期2010年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者G·S·霍塔梅斯利吉尔, 曹海明 申请人:哈佛学院董事会