专利名称：多价佐剂展示的制作方法
多价佐剂展示本发明涉及使用佐剂刺激免疫系统的改进的技术。本发明特别涉及新的含有佐剂的制品，其以多展示形式(multiple display format)呈递佐剂；包含这些制品的组合物以及这些制品在免疫中的用途。
背景技术：
佐剂通常是常见的病原体、例如病毒、细菌或真菌的成分(或类似物)。它们通常被模式受体、清道夫受体和toll样受体(TLR)识别。多数成功的佐剂以低亲和性 (affinity)但是以高亲和力(avidity)与这些受体结合，这是由于多次重复呈递。最佳的佐剂倾向于是完整(或部分裂解的)细菌或双链病毒DNA。然而，目前本领域中趋向于具有单一可鉴定的、优选完全合成的成分的更加确定的制剂。不幸的是，干净的、离散的和单分散的佐剂不能刺激先天免疫系统达到如同最初的“脏”制剂那样的刺激程度。目前的合成佐剂，例如咪喹莫特(imiquimod)和Pam2Cys是难以配制和递送的溶解性差的低分子量试剂。本领域中描述的佐剂的具体实例包括合成的佐剂，例如描述于US 6，149，222中的那些。这些佐剂是由聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物构成的泊洛沙姆(poloxamer)，它们通过未充分确定的非离子型相互作用刺激多种细胞表面受体。US 6，610，310描述了由合成糖或其它聚合物上的多个负电荷构成的聚阴离子型合成聚合物。然而，此类合成佐剂一般具有差的亲和力和不足的佐剂活性。已经进行了将合成佐剂掺入制剂的努力，其旨在改善递送。例如，US 2005/0233105描述了含有低分子量合成佐剂的制剂。但是，这些制剂是佐剂与病毒疫苗的简单混合物，它们不提供改善合成佐剂的内在活性的方法。类似地，WO 2007/078879描述了含有自组装脂质体、聚合物复合物和乳化液体的组合物。这些组合物意在以更天然的形式呈递佐剂，但是它们难以被配制并且多数佐剂材料是不可达的，因为其被裹在疏水性核心内。这些制剂在一定条件下冻结，并且由于它们的不稳定性，它们通常需要在施用前即时配制。因此，需要一种新的方法来设计提供免疫系统的改进的刺激的合成佐剂。
发明内容
因此，本发明提供了佐剂-聚合物构建体(在本文中也称作聚合物-佐剂构建体)，其包含与3个或更多个佐剂共价连接的聚合物骨架，其中所述3个或更多个佐剂各自存在于悬垂的侧链中，佐剂直接或通过间隔基团连接至聚合物骨架。本发明人发现相对于单独使用合成佐剂，将数个小的合成佐剂连接至聚合物、从而使佐剂以多价显示形式呈递，能够增强免疫刺激。通过以这种方式呈递多个佐剂，其暗示了病原体相关的分子模式(PAMP)，被认为改善受体亲和力并提供向toll-样受体和模式识别受体的更天然的呈递。此外，佐剂的多价显示促进受体交联和信号传导。这些因素都引起增强的免疫刺激，并因此能够降低所用的佐剂的剂量并减少副作用。按照这种方式将佐剂连接至聚合物链还增加佐剂成分的分子大小，这会辅助防止浙滤进入血流中，从而减少
脱靶毒性。在本发明的优选实施方式中，聚合物骨架本身是亲水性的，其辅助溶解通常为亲脂性的佐剂。这促进了佐剂的递送并使所用的制剂更加简单。另一个优点是增加了可与受体相互作用的分子数目，也能够降低所用的剂量。本发明的佐剂-聚合物构建体通常与疫苗联合施用。因此，本发明还提供了包含与疫苗结合的本发明的佐剂-聚合物构建体的疫苗缀合物。还提供了组合物，其包含本发明的佐剂-聚合物构建体或疫苗缀合物和药学上可接收的载体或稀释剂。本发明还提供了用于刺激或增强有此需要的受试者中的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用有效、非毒性量的本发明的佐剂-聚合物构建体、疫苗缀合物或组合物。当佐剂-聚合物构建体或组合物不包含疫苗时，该方法还包括同时或分别施用疫苗的步骤。 还提供了本发明的佐剂-聚合物构建体、疫苗缀合物或组合物，其用于刺激或增强免疫应答的方法。
图1提供了神经酰胺类似物的合成示意图。图2显示了根据本发明的聚合物-佐剂构建体的结构。图3a显示了用于制备聚合物-佐剂构建体的反应性聚合物的结构。图北显示了结合于神经酰胺佐剂和肽抗原的同一聚合物。图4显示在同一聚合物上多重呈递TLR2拮抗剂Pam3Cys引起细胞的更高的刺激。U937是淋巴瘤细胞系，其具有单核细胞样表型，表达一众TLR受体，包括TLR2。刺激 TLR2导致NfkB的激活，并且这些细胞已经经过处于NfkB启动子控制下的报告质粒(萤光素酶)转染。在暴露于测试物质8小时之后，裂解细胞并就萤光素酶的表达进行分析。所有的测试物质均以100ng/ml加入(注意Pam3Cys缀合物构建体中仅有5. 22ng是Pam3Cys)。 数据显示与聚合物结合的Pam3Cys显示出比单独的Pam3Cys显著更高、与阳性对照LPS相当的刺激水平。图5显示在同一聚合物上多重呈递TLR2拮抗剂Pam2Cys引起细胞的更高的刺激。将骨髓衍生的DC暴露于连接于HPMA的50ng/ml Pam2Cys (P2C)或P2C，持续M小时。 然后通过ELISA就IL-8测评细胞上清液。注意仅5wt% (2. 5ng)的Pam2Cys存在于50ng/ ml的P2C-pHPMA样品中。
具体实施例方式如本文使用的“佐剂”是可以刺激免疫系统并增强对疫苗的应答而本身无任何特异性抗原效应的试剂。本发明的构建体含有至少3个佐剂，它们可以是相同或不同的。在一个优选的实施方式中，3个或更多个佐剂是相同的。每个佐剂在悬垂侧链中结合于聚合物骨架。因此，佐剂不是聚合物骨架本身的一部分。这提供了佐剂的更好的呈递以被细胞受体识别，因为佐剂的空间-结合的排列更像完整细菌或病毒或其成分例如双链病毒RNA表面上的'PAMP' 表位，并且引起针对细胞受体的更好的结合亲和力。
至少3个佐剂、优选至少5个、更优选至少10个佐剂，共价连接于每个聚合物，每个佐剂通常存在于单独的悬垂侧链中。通常最多50个佐剂存在于一个聚合物骨架上。在一个实施方式中，至少20个佐剂存在于聚合物骨架中。佐剂可以包含多种结构，它们的特征在于促进针对疫苗的改善的免疫应答的能力。佐剂所结合的一类受体是Toll样受体(TLR ；也称作“模式受体”，因为它们具有识别病原体表面上的重复的PAMP序列的能力)。TLR识别衍生自多种类别的病原体、包括革兰氏阳性和阴性细菌、DNA和RNA病毒、真菌和原生动物的保守的分子产物。已经在多种脊椎动物基因组中认识到了 TLR基因，很多部分和全长序列是可获得的。已经鉴定了人类中的11 种TLR，在搜索小鼠基因组时发现了 13种。已经表明人和小鼠TLR家族成员具有不同的配体特异性，识别不同的分子结构。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6全部定位于识别细胞壁成分的胞质膜，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9优先表达于细胞内区室，例如内体，并识别核酸结构。已经部分地鉴定了不同TLR的配体要求TLR2异二聚体(主要是与TLRl或TLR6)——脂蛋白、肽聚糖、脂聚糖、脂胞壁酸、 脂多糖、肽聚糖、酵母聚糖TLR5——细菌鞭毛蛋白TLR7——咪唑并喹啉(咪喹莫特、GArdiquimod)、CI^64、洛索立宾TLR8-单链RNA、大肠杆菌RNATLR7/TLR8 异二聚体-CL075, CL097, Poly (dT)，R848TLR9——DNA中的非甲基化CpG岛，包括含有CpG的寡核苷酸TLR4——脂多糖、单磷酰脂ATLR3-双链 RNATLR配体的实例包括-咪喹莫特——TLR7的配体 -MALP-2 [分离自发酵支原体(Mycoplasma Fermentans)的二酰基脂肽]—— TLR6/TLR2的配体-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)脂多糖，脂胞壁酸——TLR2的配体-Pam3CSK4-TLR2 与 TLRl 的异二聚体的配体-Pam2Cys——TLR2与TLR6的异二聚体的配体-Poly(I). Poly(C)-TLR3 的配体TLR存在于先天免疫细胞(DC、巨噬细胞、自然杀伤细胞)，获得性免疫力的细胞(T 和B淋巴细胞)中，也存在于非免疫细胞(上皮和内皮细胞，成纤维细胞)中。用于本发明的优选佐剂是脂聚糖、脂多糖、脂阿拉伯甘露聚糖、脂胞壁酸、肽聚糖、 天然和合成脂蛋白和脂肽、酵母多糖、糖脂、聚肌苷-聚胞苷酸、单磷酰脂A、TNF α、TNF肽、 CD40 配体、0X40、IL-4、IL-6、IL-8、IL-2、IL-12、甘露糖、GM-CSF、IFN- y、IFN- α、鞭毛蛋白、咪唑并喹啉化合物、鸟苷、双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)和细菌DNA或合成的寡核苷酸中的含有非甲基化CpG的序列。本发明的聚合物骨架可以是合成的或天然存在的聚合物。如本文使用的“聚合物” 包括生物聚合物，例如核酸、蛋白和淀粉，以及合成的聚合物。在一个实施方式中，聚合物不是核酸。在另一个实施方式中，聚合物是合成的聚合物。在一个实施方式中，聚合物是亲水性聚合物，其将赋予佐剂-聚合物构建体水溶性。例如，佐剂-聚合物构建体可以具有至少100μ g/mL，例如至少150μ g/mL或至少 200 μ g/mL的水溶性。聚合物本身可以是生物活性的，例如聚合物本身可以具有佐剂性质。在一个实施方式中，聚合物本身实质上不具有佐剂活性(即，单独的聚合物将不会增强免疫刺激)。可以通过例如使用胭淋巴结(PLN)测定法进行聚合物的佐剂活性的测定，其中聚合物与抗原一起被注射进入小鼠的后足垫。佐剂活性测定为相对于给予所述抗原而不给予待测物质的动物、以及仅给予推定佐剂的动物中的PLN重量和细胞数目，接受抗原和待研究物质的动物中的PLN重量和细胞数目的增加。在另一个实施方式中，聚合物是无生物学活性的。适宜的合成聚合物包括基于具有乙烯部分的单体的那些，例如甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、乙烯、乙烯醚、乙烯酯以及苯乙烯部分。该类别下的单体的具体实例有甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酰胺，特别是N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)和羟乙基甲基丙烯酸酯 (HEMA)和乙烯吡咯烷酮(PVP)。也可以使用适合于开环聚合和开环复分解的环式单体，例如环式酰胺，环式酯，环式氨基甲酸酯、环醚、环酐、环式硫化物、环胺以及单环和多环烯烃。备选的聚合物骨架包括核酸(例如，polyI:polyC、p0lyA:p0lyU、单链DNA、双链 DNA)、聚乙二醇、聚(乙二醇-寡肽)、聚(氨基酸)(例如，聚[N-(2-羟乙基)-L-谷氨酰胺)和多糖，例如糖原、纤维素、葡聚糖、环糊精、藻酸盐、透明质酸、聚唾液酸、聚甘露聚糖和其它的基于葡萄糖或半乳糖的聚合物。可以用作聚合物骨架的另外的天然产品包括肝素、葡聚糖和淀粉。当骨架基于乙二醇-寡肽时，寡肽基团优选包含1-4个氨基酸，并且悬垂侧链通常由聚合物骨架的寡肽部分支持。通常而言，聚合物骨架是基于选自甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、苯乙烯单体、乙烯单体、乙烯醚单体、乙烯酯单体、唾液酸单体、甘露糖单体、N- (2-羟乙基)-L-谷氨酰胺 (HEG)单体和乙二醇-寡肽单体的单体单元。优选地，聚合物骨架是基于选自N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、N-(2-羟乙基)-L-谷氨酰胺(HEG)和乙二醇-寡肽的单体单元或者是聚唾液酸或聚甘露聚糖聚合物。基于HPMA的聚合物骨架是更优选的。聚合物的重均分子量通常是IkDa至IOOkDa,例如至少2kDa，更优选至少5kDa、最多80kDa，更优选最多40kDa。优选的聚合物具有5kDa至40kDa的重均分子量。聚合物骨架可以是具有3个或更多个包含佐剂的悬垂侧链的线性聚合物。备选地，聚合物骨架本身可以是分支的结构。例如，考虑到树状和梳状聚合物。在一些实施方式中，聚合物骨架可以与另外的聚合物交联，从而形成水凝胶。水凝胶优选是水解上不稳定的，或者是可被酶降解的，例如，基质金属蛋白酶2或9。这是为了使佐剂固定于水凝胶内，从而佐剂的释放可以被调控。因此，根据本发明的一个优选特征，在可能促进交联和形成水凝胶的条件下(例如高浓度的反应剂，无任何过量)或在存在可能促进交联的试剂例如二胺的情况下进行本发明的方法。一般使用描述于Subr，V.， Duncan，R. and Kopeck，J. (1990)“ Release of macromolecules and daunomycin from hydrophilic gels containing enzymatically degradable bonds“，J. Biomater. Sci. Polymer Edn.，1 (4)61-278中的化学方法进行含有经修饰的佐剂的水凝胶的形成。
当聚合物骨架包含核酸时，可以将聚合物连接于另外的核酸以形成双链螺旋结构。佐剂可以直接或通过间隔基团连接至聚合物骨架。在优选的实施方式中，存在间隔基团，从而佐剂-聚合物构建体具有下列结构P-[S-A]n其中P是聚合物骨架，S是间隔基团，A是佐剂，η等于或大于3。间隔基团可以是相同或不同的，通常选自寡(烷氧基化合物)(例如PEG链，其长度为2-200个碳原子)；寡肽，其具有例如最多约20个氨基酸；C1-C12烷基部分(例如， C1-C6烷基部分，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基)；C6-C10芳基部分(例如，苯基)； 此类烷基和芳基部分的组合；聚酯和聚碳酸酯。适宜的聚酯和聚碳酸酯是例如具有10-30 个碳原子的链的那些。间隔基团通常是亲水性的，并且可以掺入可降解的键，例如可还原的二硫键，易于发生酸催化水解的键，或可以通过酶促降解被切割的键。优选的间隔基团是寡(烷氧基化合物)和寡肽，特别是寡肽。在本发明的一个实施方式中，间隔基团是寡肽。优选地，寡肽含有最多10个， 例如最多5个氨基酸。更优选地，寡肽含有1-4个，例如2或4个氨基酸。适宜的寡肽是-Gly-Phe-Leu-Gly-，-Gly-Gly-和 Glu-Lys-Glu-。在另一个实施方式中，间隔基团中掺入可降解的键。例如，间隔基团可以通过还原而被切割，例如-NH-(CH2)2NHCO-(CH2)2-SS-(CH2)2-CO-O备选地，间隔基团可以通过酸催化的水解而被切割，例如
权利要求
1.佐剂-聚合物构建体，其包含与3个或更多个佐剂共价连接的聚合物骨架，其中所述 3个或更多个佐剂是相同或不同的，并且各自存在于悬垂的侧链中，所述佐剂直接或通过间隔基团连接至聚合物骨架。
2.权利要求1的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架实质上无佐剂活性。
3.权利要求1或权利要求2的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架至少部分是水溶性的。
4.前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架是基于选自甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、苯乙烯单体、乙烯单体、乙烯醚单体、乙烯酯单体、唾液酸单体、甘露糖单体、N-(2-羟乙基)-1-谷氨酰胺(HEG)单体和乙二醇-寡肽单体的单体单元。
5.权利要求4的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架是基于选自N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、N-(2-羟乙基)-1-谷氨酰胺(HEG)和乙二醇的单体单元或者是聚唾液酸或聚甘露聚糖聚合物。
6.前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体，其中佐剂是相同或不同的，并且选自脂聚糖、脂多糖、脂胞壁酸、肽聚糖、合成脂蛋白、酵母多糖、糖脂、聚肌苷-聚胞苷酸、单磷酰脂A、鞭毛蛋白、咪唑并喹啉化合物、鸟苷、TNF-α (或其肽)、IL-2、IL_4、IL-8、⑶40、 0X40、GM-CSF和细菌DNA或合成寡核苷酸中的含有CpG的序列。
7.前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架和/或间隔基团含有可降解的键。
8.前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物的重均分子量是5kDa至 40kDao
9.前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物骨架直接或通过间隔基团共价连接于10至50个佐剂。
10.前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物是分支的聚合物，例如， 树状或梳状聚合物。
11.前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体，其中聚合物是交联的，从而其形成水凝胶。
12.前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体，其中该构建体结合于疫苗以提供疫苗缀合物。
13.包含前述权利要求任一项的佐剂-聚合物构建体和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
14.权利要求13的组合物，其包含权利要求1至11任一项的佐剂-聚合物构建体，药学上可接受的载体或稀释剂，其还包含疫苗。
15.用于刺激或增强有此需要的受试者中的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用有效、非毒性量的权利要求1至12任一项中定义的佐剂-聚合物构建体，或权利要求13或 14中定义的组合物，其中，当佐剂-聚合物构建体或组合物不包含疫苗时，该方法还包括向所述患者施用有效且非毒性量的疫苗的步骤。
16.权利要求1至12任一项的佐剂-聚合物构建体或权利要求13或14的组合物，其用于刺激或增强免疫应答的方法。
17.权利要求16的佐剂-聚合物构建体或组合物，其中佐剂-聚合物构建体或组合物不包含疫苗，并且刺激或增强免疫应答的方法另外包括施用疫苗。
全文摘要
本发明提供了佐剂-聚合物构建体，其包含与3个或更多个佐剂共价连接的聚合物骨架，其中所述3个或更多个佐剂各自存在于悬垂的侧链中，所述佐剂直接或通过间隔基团连接至聚合物骨架。
文档编号A61K47/48GK102421452SQ201080020390
公开日2012年4月18日 申请日期2010年5月7日 优先权日2009年5月8日
发明者K·费希尔, L·C·W·西摩 申请人:普西奥库斯治疗有限公司