专利名称：用peg标记干扰素的方法
技术领域：
本申请涉及肽、蛋白等的位点特异性修饰方法。特别地，它涉及用PEG标记诸如干扰素的蛋白的方法。
背景技术：
重组蛋白治疗剂已作为用于从癌症到代谢病症和自身免疫疾病范围的多种状况的有效治疗而出现，但它们通常受其药代动力学和免疫原性限制。因此，已开发大量策略来克服这些，所述策略包括糖基化、白蛋白附着、环化和PEG化。蛋白糖基化是一个或多个糖的连接，这可有助于蛋白稳定性和带来对蛋白水解和免疫识别的某种保护(Doores等人， 2006)。人白蛋白是循环中最为普遍的血清蛋白且具有异乎寻常长的约19天半衰期。因此， 将白蛋白基因融合(genetic fusion)至蛋白N末端或C末端被良好耐受，并且所得融合蛋白具有显著提高的半衰期(Subramanian等人，2007)。PEG化即聚乙二醇的共价连接(Veronese和Mero，2008)大概是用于改良蛋白药代动力学的得到最广泛使用和认可的方法。PEG是基于重复单元(-C2H3-O-)n的可有具有低多分散性的广范围分子量的聚合物，并且PEG可以是直链和支链两者。其高柔性和水合作用表明，它具有大的水力半径并显著提高与之连接的蛋白的大小，转而显著降低其肾清除。 此外，潜在免疫原性表位和蛋白酶切割位点被掩蔽，从而分别降低免疫原性和蛋白水解。另外，PEG化可以实质上提高蛋白溶解性和稳定性。然而，用于PEG化的已知方法一般是非位点选择性的，其使用与蛋白亲核物质、例如赖氨酸侧链上的氨基基团经历酰化或烷化的亲电PEG衍生物(Roberts等人，2002)。这通常生成异质的蛋白制备物，其中将1个PEG分子在大量不同位点连接至蛋白，以生成不同的位置异构体。在蛋白内的一些位置，PEG连接阻止或损害受体结合。此外，还可以存在多 PEG化物质，借此大量PEG分子在不同位点连接至相同蛋白。因此，PEG化蛋白制备物的总活性相比未修饰蛋白被降低。因此，存在对用于位点特异性蛋白PEG化方法的需要；通过在蛋白序列内的所定义位置并入单个PEG部分，可以克服与非选择性PEG化(即含有多PEG 位置异构体的制备物)相关的有害作用。用于以位点特异性方式将标记引入蛋白的最常见方法是在修饰位置将独特的游离半胱氨酸工程化进一级序列。随后使该游离半胱氨酸的巯基侧链与该标记的马来酰亚胺衍生物反应，以提供位点特异性修饰。然而，这需要在一级序列内的所有其它天然存在的游离半胱氨酸通过氨基酸诱变被移除。此外，如果该蛋白天然含有二硫键，那么在该分子内添加额外的半胱氨酸可能干扰蛋白的正确折叠。因此，已研究用于蛋白位点特异性PEG化的其它途径。Marsac等人，2006描述了借助PEG-硫酯与靶蛋白上的N末端半胱氨酸之间的天然化学连接而将PEG连接至蛋白N 末端。如果N末端半胱氨酸尚未存在的话，这需要将N末端半胱氨酸加在蛋白序列上，这可能干扰含半胱氨酸蛋白的蛋白折叠。Kinstler等人，2002描述了 PEG对N末端的连接，所述连接借助酸性条件下蛋白与PEG醛的还原性烷化，在酸性条件下，只有α -氨基N末端胺是反应性的，比较，Pka比赖氨酸残基的ε -氨基低(Kinstler等人，200 。然而，仍然可能用该方法获得一些ε -氨基PEG化。Brocchini等人，2008建议将PEG并入二硫桥。这涉及二硫化物的起始还原，以释放2个半胱氨酸硫醇，随后是双烷化，以产生与PEG共价连接的3碳桥。然而，该途径限于含溶剂暴露的二硫键的蛋白。另一方法是天然糖基化位点的 PEG化，其中在大肠杆菌(E. coli)中表达的重组蛋白被酶糖基化，并且PEG在天然糖基化位点经聚糖连接(DeFrees等人，2006)。该途径限于天然糖基化的蛋白。^iang等人，2009描述了经硫代酸/叠氮化物酰胺化的蛋白C末端PEG化；在此该蛋白作为VMA内含肽CBD融合蛋白表达并由Na2S氢硫解(hydrothiolitically)切割以产生硫代酸，所述蛋白随后可与PEG-磺叠氮化物(PEG-sulfonazide)反应。然而，该硫代酸蛋白在标记反应期间倾向水解，从而产生作为副产物的该蛋白的未标记C末端羧酸衍生物。Xie和khultz，2006描述了大肠杆菌蛋白表达期间并入具有反应性化学基团的非天然氨基酸，所述氨基酸能允许PEG官能团的随后连接。这使用工程化进大肠杆菌的独特密码子(例如琥珀无义密码子UAG)和相应的转移RNA 氨基酰-tRNA-合成酶对来实现。WO 2005/110455和W02004/076474描述了 PEG化干扰素在治疗病毒感染中的用途。同样地，US2005/059U9描述了 PEG化干扰素。然而，这些文件描述的用于干扰素PEG 化的方法不是位点特异性的。当前存在9种批准用于治疗性用途的PEG化蛋白治疗剂(Veronese &Mero 2008 Biodrugs 22(5)p315)，包括腺苷脱氨酶、G-CSF、红细胞生成素、IFNα i和IFNa 2b的PEG 化形式。存在2种批准的用于治疗丙型肝炎病毒并处于用于某些癌症的临床评估下的PEG 化形式的 IFN a 2 (Ferrantini 等人，2007)。Pegasys (Hoffmann La Roche)是连接至支链 40kDa PEG-NHS的重组IFN α 2a。它包括9个位置PEG异构体。然而，在体外测定法中，它保留未PEG化 IFNa 加的仅 7% 的活性(Dhalluin 等人，2005 ；Foser 等人，2003)。Peglntron (Schering Plough)是连接至单链12kDa琥珀酰亚胺碳酸酯PEG的重组IFNa 2b，产生95% 的包括14个位置异构体的单PEG化蛋白，在所述位置异构体中，组氨酸34占47.8%。在体外测定法中，与未PEG化IFNa 2b相比，Peglntron 保留的抗病毒活性(Wang等人， 2002)。Betaseron (EU 的 Betaferon) (Bayer Shering Pharma)禾口最近的 Extavia(Novartis)是用于治疗多发性硬化的重组IFN^ Ib蛋白，并处于用于治疗包括肝炎和某些癌症在内的其它疾病的临床评估下(Fine等人，1997 ；Fukutomi等人，2001)。然而，IFNi3 Ib的特定问题是它从血液中快速清除，从而必需可导致注射部位坏死和降低的患者依从的频繁施用方案。中和抗体也是问题，在一个2年研究中，45%的患者出现这些。当前没有已批准的PEG化IFNi3 Ib形式。然而，至今在本领域的工作包括，产生具有未修饰 IFN^ Ib 24-31%活性的5种位置异构体的混合物的伯胺的随机PEG化，并包括(主要是) N末端胺的PEG化(35%活性)。利用在位置79 (天然糖基化位点)或者N末端或C末端的工程化游离Cys残基的位点特异性PEG化尝试是不成功的，这归因于不足的位点特异性连接(Basu等人，2006)。另一策略使用bicin (双-N-2-羟乙基甘氨酰胺)接头，以随机连接 2-3个PEG分子。在生理条件下，bicin的快速水解释放PEG，以离开活性IFNi3 lb。然而， 这些可释放PEG化形式的活性仅为未修饰IFNi3 Ib活性的7% -27% (Zhao等人，2006)。为了改善蛋白治疗剂的效力和稳定性，明显需要延长干扰素治疗剂有效性的方式，例如通过延迟肾清除、降低免疫原性和/或减少蛋白水解。然而，尽管存在大量的本领域已知方法，每一种方法在例如需要引入另外的化学部分、修饰位点的模仿、对蛋白折叠的影响和对活性的影响方面仍存在其缺点。发明概述本发明人已研究稳定治疗用干扰素的可选择方法。他们已开发PEG化干扰素的新方法，所述新方法是位点特异性的并且对于被测试干扰素，如实施例中所述，产生具有比用常规技术PEG化的相应的干扰素大很多且事实上接近非PEG化干扰素的抗病毒活性的PEG 化干扰素。这通过生成新的PEG官能团的氧代羧酸衍生物、例如丙酮酰衍生物而促进。使C 末端酰胼重组蛋白与丙酮酰PEG反应，从而以良好产率生成位点特异性C末端PEG化蛋白， 其PEG官能团通过腙键直接连接至蛋白C末端。可以通过还原进一步稳定该腙键，所述还原例如在温和条件下利用氰基硼氢化钠进行。因此，在本发明的第一方面，提供了干扰素分子的位点特异性标记方法，其中所述方法包括以下步骤a)提供标记分子，所述标记分子包括具有醛或酮部分的PEG部分；b)提供干扰素分子，所述干扰素分子具有C末端酰胼部分；c)使所述PEG部分的醛或酮部分与所述干扰素分子的C末端酰胼反应，以形成标记的干扰素分子，所述标记的干扰素分子包括经腙键连接至干扰素分子C末端的PEG部分。在本发明一实施方式中，所述腙键具有式I
权利要求
1.一种干扰素分子的位点特异性标记方法，其中所述方法包括以下步骤a)提供标记分子，所述标记分子包含具有醛或酮部分的PEG部分；b)提供干扰素分子，所述干扰素分子具有C末端酰胼部分；c)使所述PEG部分的醛或酮部分与所述干扰素分子的C末端酰胼反应，以形成标记的干扰素分子，所述标记的干扰素分子包含经腙键连接至所述干扰素分子的C末端的PEG部分。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述具有醛或酮部分的PEG部分是具有α-二酮或 α-酮-醛基团的PEG部分。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述具有醛或酮部分的PEG部分是具有氧代羧酸酯残基的PEG部分。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述醛或酮部分是芳香酮或芳香醛部分。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述氧代羧酸酯残基是丙酮酰基团。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)的具有C末端酰胼部分的干扰素分子通过胼与前体分子的反应而产生，所述前体分子包括经硫酯部分而N末端融合至内含肽结构域的前体干扰素分子。
7.如权利要求6所述的方法，其中通过胼与前体分子反应而产生的步骤(b)的具有C 末端酰胼部分的干扰素分子直接作为折叠蛋白产生，而无再折叠步骤或再折叠剂。
8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述前体分子与胼在至少0.ImM螯合剂、例如EDTA存在下反应。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干扰素分子是具有如序列IDNo=I 所示氨基酸序列的IFN α 2b分子，或其片段，或其与序列ID No 1具有至少60%序列同源性的衍生物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述干扰素分子是IFNα 2b。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述干扰素分子是具有如序列IDNo 2所示氨基酸序列的IFNi3 Ib分子，或其片段，或其与序列ID No :2具有至少60%序列同源性的衍生物。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述干扰素分子是IFNi3lb。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记的干扰素分子具有大于相应的非PEG化干扰素分子抗病毒活性的40%的抗病毒活性。
14.一种C末端PEG化干扰素分子，其中所述PEG部分经腙键或还原腙键连接至所述干扰素分子的C末端。
15.如权利要求14所述的C末端PEG化干扰素分子，其中所述干扰素分子是具有如序列ID No:l所示氨基酸序列的IFNa2b分子，或其片段，或其与序列ID No:l具有至少60% 序列同源性的衍生物。
16.如权利要求15所述的C末端PEG化干扰素分子，其中所述干扰素分子是IFNα 2b。
17.如权利要求14所述的C末端PEG化干扰素分子，其中所述干扰素分子是具有如序列ID No :2所示氨基酸序列的IFNi3 Ib分子，或其片段，或其与序列ID No :2具有至少60% 序列同源性的衍生物。
18.如权利要求17所述的C末端PEG化干扰素分子，其中所述干扰素分子是IFNβ lb。
19.如权利要求14-18中任一项所述的C末端PEG化干扰素分子，其中所述PEG分子是质量在9kDa至12kDa范围、诸如约IOkDa质量的直链PEG分子。
20.一种治疗有相应需要的患者中的干扰素治疗可以是有用的医学病症的方法，所述方法包括施用根据权利要求14-19中任一项的PEG化干扰素或根据权利要求1-13中任一项所述的方法产生的PEG化干扰素。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述医学病症选自由癌症、IDDM、丙型肝炎、多发性硬化、自身免疫病症和病毒性病症组成的组。
22.用于医药的根据权利要求14-19中任一项的PEG化干扰素或根据权利要求1_13中任一项所述的方法产生的PEG化干扰素。
23.用于治疗癌症、IDDM、丙型肝炎、多发性硬化、自身免疫病症或病毒性病症的根据权利要求14-19中任一项的PEG化干扰素或根据权利要求1-13中任一项所述的方法产生的 PEG化干扰素。
24.根据权利要求14-19中任一项的PEG化干扰素或根据权利要求1_13中任一项所述的方法产生的PEG化干扰素在制备用于治疗癌症、IDDM、丙型肝炎、多发性硬化、自身免疫病症或病毒性病症的药物中的用途。
25.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求14-19中任一项的PEG化干扰素或根据权利要求1-13中任一项所述的方法产生的PEG化干扰素。
26.—种基本上如本文参照
图1至图11中的一个或多个描述的产生标记的干扰素分子的方法。
27.—种基本上如本文参照图1至图11中的一个或多个描述的C末端PEG化干扰素分子。
全文摘要
提供了干扰素分子的位点特异性标记的方法。所述方法包括以下步骤a)提供标记分子，所述标记分子包含具有醛或酮部分的PEG部分；b)提供干扰素分子，所述干扰素分子具有C末端酰肼部分；和c)使所述PEG部分的醛或酮部分与所述干扰素分子的C末端酰肼反应，以形成标记的干扰素分子，所述标记的干扰素分子包含经腙键连接至所述干扰素分子C末端的PEG部分。还描述了使用此种方法标记的干扰素分子。
文档编号A61K38/21GK102421447SQ201080020756
公开日2012年4月18日 申请日期2010年5月17日 优先权日2009年5月15日
发明者格雷厄姆·科顿, 詹妮弗·罗伯茨 申请人:阿尔麦克科学(苏格兰)有限公司