脑组织损伤之细胞治疗的制作方法

专利名称：脑组织损伤之细胞治疗的制作方法
脑组织损伤之细胞治疗相关申请案本申请案主张美国临时申请案第61/180，243号(申请于2009年5月21日)之优先权，其内容在此处全部并入作为参考文献
背景技术：
脑组织损伤，其因创伤或病症(如，神经退化及脑血管疾病)而产生，是长期瘫痪之主要原因。由于胚胎干(embryonic stem, ES)细胞的多能性，其对于治疗脑损伤有着极大的希望。然而，伦理和供给上的考量局限了它们的使用。曾有人提出使用非-ES多能性细胞。然而，此等细胞的神经重塑能力有限。因此，有需要一种增进其神经重塑能力之方法。

发明内容
本发明至少一部份基于非可预期的发现，即低氧的前置处理(hypoxia preconditioning,HP)能用于增进非-ES多能性细胞的神经重塑与分化能力。因此而增进的细胞能用来治疗脑组织损伤。因此，本发明一方面的特征是一种用于增进具脑组织损伤之患者之神经病学的行为功能之方法。该方法包括鉴定出患有脑部组织损伤的患者，以及将包含有效量之多能性细胞之组合物投予该患者。该多能性细胞可以是任何合适的干细胞，例如，ES细胞、造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、或骨髓干细胞。在一具体实施例中，该多能性细胞是⑶34+细胞，如，从脐带血获得之⑶34+细胞。其流程可进一步包括在低氧条件下培养该细胞后，评估该细胞中的Epacl浓度。该组合物可从脑内投予。在一具体实施例中，该方法进一步包括非侵入性技术来评估该患者的治疗效果之步骤。多能性细胞通过一种包括在低氧条件下培养该细胞之流程而制备。低氧条件 (Hypoxia condition, HP)是指一种条件，其包括细胞中的非致命性紧迫、活化多种内生营养讯号及引发对抗后续细胞致死性伤害之强力的保护作用。例如，在低氧条件下培养该细胞可通过将细胞置放于包含60至600mM去铁胺(Desferrioxamine，DFX)之培养液中达12至48小时而达成。在另一实例中，在低氧条件下培养该细胞可通过将细胞置放于包含100至450mM去铁胺(Desferrioxamine，DFX)之培养液中达16至36小时而达成。在又一实例中，在低氧条件下培养该细胞可通过将细胞置放于包含200至350去铁胺 (Desferrioxamine, DFX)之培养液中达20至24小时而达成。另外，可将细胞培养于包含 10至500 μ M COCl2之培养液中达12至48小时。COCl2之浓度范围可从10至500 μ Μ。在一较佳具体实施例中，COCl2之浓度约为100 μ Μ。在低氧条件下培养该细胞亦可在氧气浓度低于正常细胞培养条件之氧气浓度的条件下而进行。例如，在低氧条件下培养该细胞可通过将细胞置放于包含0. 5至3% O2之环境(如培养箱)中达6至48小时、0. 8至1. 5% O2达12至36小时、或0. 9至1. 1 % O2达 23至25小时而进行。另一方面，本发明之特征用于增加患者之组织的血管新生之方法。该方法包括将包含有效量之多能性细胞之组合物投予有需要的患者之组织。该多能性细胞以上述相同方式制备。在一实例中，此方法可用于增加具有脑组织损伤之患者之脑部的血管新生。



图IA-I与1A-2为显示西方墨点之结果之照片与图表；图2A至2G2为显示治疗与神经病学的行为测量方法之说明(2A)，以及显示治疗结果之图表和照片(2B至2G)；图3A-1至3G-2为显示脑中经由干细胞植入所造成的血管新生之照片与图表；图4A-1至4F为显示于脑部植入干细胞所造成的Epacl或MMP2表现之照片与图表；图5A-1至5C-2为显示于脑部植入干细胞所造成的神经新生。
具体实施例方式ES细胞曾被指出可用于使脑中神经元或神经胶细胞再生，从而可治疗脑组织损伤。然而，伦理与供给上的考量局限了 ES细胞的使用。非ES多能性细胞，如骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)与人类赃带血(human umbilical cord blood,hUCB), 展现出替代的希望。然而，这些替代的选择并非都能被接受，其由于细胞数量与增生/分化的能力会随着年龄明显降低所致。人类脐带血，由于其原始特性与取得容易，显现出能作为多效性干细胞收集之有希望的候选者，并且能提供应用于脑再生之细胞疗法的令人感兴趣的替代候选者。特别是， 经由CD34筛选的族群，其为一种表现在来自造血、内皮与神经谱系的前驱细胞上的表面分子，是富含于hUCB且含有高量的早期前驱细胞。然而，很少人研究调控内生性神经干细胞 (neural stem cells,NSCs) Hg的iti！〒(hematopoietic stem cells，HSCs)。 夕卜，因为宿主脑部之微环境对移植的干细胞来说是有毒的，因此许多细胞在移植后马上死亡(Wei et al.，2005，Neurobiol Dis 19 :183_193)。尽管已研究数种策略以增强移植细胞之植入及增加移植疗法之治疗潜力(Wei et al. ,2005, Neurobiol Dis 19 183-193 ；Chen et al. ,2002, J Neurol Sci 199 17-24 ；and Park et al. ,2003, Neurosci Lett 353 91-94)，但仍有许多与各自方式有关的限制，其几乎使得它们在目前无法在临床上实施。如本文所述，非预期性的是低氧的前置处理(Hypoxic preconditioning, HP)可用于增进非-ES多能性细胞的神经重塑与分化能力。低氧的前置处理(HP)是一种经由短期低氧所诱发的非致死紧迫，其活化多种内生营养讯号及引发对抗后续细胞致死性伤害之强力的保护作用(Kirino et al. ,2002, J Cereb Blood Flow Metab 22:1283-1296 and Gidday，2006，Nat Rev Neurosci 7:437-448)。如本文所述，其代表一种用以鉴定对抗缺血损伤的新治疗标的之工具。某些人已研究使用HP-MSCs之治疗能力，但均未成功(Danet et al. ,2003, J Clin Invest 112:126—135)。如本文所述，发现HP能经由HIF-I α的活化来向上提升cAMP活化的交换蛋 S -1 (Exchange protein activated by cAMP-1, Epacl)的表现，并接着增力口 Rapl—GTP 活性。也发现HP-hUCB衍生的HSCs之脑内移植在脑部缺血模型中通过活化Epacl-Rapl讯息传递之分子机制而增强神经轴向外生长及MMP分泌，以增强神经重塑性。
Epacl是一种小GTP酶Rapl与Rap2之鸟粪嘌呤核苷酸交换因子(Bos，2006， Trends Biochem Sci 31:680-686)。Epacl的活化能增强Rapl活性，以促进β 1_黏合素调节的附着并且增加基质金属蛋白酶(matrix metalIoprotease，MMP) (MMP2/9)分泌。近来，Epacl讯息传递被发现与轴突的再生有关。Epacl活化促进神经轴向外生长，其与提升 cAMP以增强脊髓组织上的神经轴突再生之效果相同。其亦显示活化的Epacl与神经生长因子(nerve growth factor,NGF)以协同方式增强PC-12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞之神经轴延伸。再者，内皮前驱细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的Epacl活化在后肢缺血模型中能增加EPCs复位至缺血的肌肉及造成血管新生。 组织低氧对于刺激Epacl的诱发之贡献仍是未知。由于低氧期间之代谢调控，组织间的腺嘌呤核苷浓度上升至活化内皮腺嘌呤核苷受体(adenosine receptors,ARs)并增进内皮细胞之增生与移动的浓度。本发明关于在HP条件下调适干细胞，如脐带血干细胞(hUCB)。受此调适之干细胞可用于治疗脑组织损伤。各种干细胞可用于本发明中。干细胞之实例包括脐带血干细胞、 造血干细胞、胚胎干细胞以及其它可分化成功能性的神经元或神经胶细胞之干细胞。所称“干细胞”指能分化成许多最终、经分化的细胞类型之细胞。干细胞可为全能性或多能性。全能性干细胞典型地具有发育成任何细胞类型之能力。全能性干细胞在来源上可为胚胎及非胚胎二者。多能性细胞典型地能分化成数种不同的最终分化的细胞类型之细胞。单能干细胞只能产生一种细胞类型，但具有自我更新之特性而使其能与非干细胞区分。这些干细胞可源自于各种组织或器官系统，其包括但不限于，血液、神经、肌肉、皮肤、肠道、骨骼、肾脏、肝脏、胰脏、胸腺及其类似者。根据本发明，干细胞可衍生自成人或新生儿之组织或器官。本发明所描述的细胞是实质上纯的(substantially pure)。所称“实质上为纯的”，当用于描述干细胞或从其衍生而来之细胞(例如，分化的细胞)时，意指该特化的细胞是构成制剂中实质的部分或主要的细胞(例如，超过20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90%或95% )。一般而言，实质上纯化之细胞群是构成制剂中至少约70%之细胞， 通常是制剂中约80%之细胞，尤其是制剂中至少约90%之细胞(例如，95%、97%、99%或 100% )。在一较佳具体实施例中，本发明使用脐带血细胞。这些干细胞可通过该领域已知之方法予以富集且由标准技术予以测试。为了确认该等细胞之分化潜力，可通过该领域已知之方法经诱导形成，例如，各种细胞集落形成单位。经确认之细胞可进一步于非分化性之培养基增生，超过10、20、50、或100代以上之族群倍增率(population doubling)，其中无自发性分化、老化、形态改变、增加的生长速度或分化为神经元之能力的改变之迹象。该等细胞可于使用前以标准方法保存之。所称“增生”与“扩增”于此可交替地使用以描述细胞，指通过分裂使相同种类之细胞数增加。所称“分化”指细胞针对一特定功能而成为特化的细胞之发育过程，例如，细胞获得一或多种与初始细胞类型不同之形态上的特征及/或功能。所称“分化”包含谱系走向(lineage commitment)及终末分化过禾呈(terminal differentiation processes) 二者。分化是可被评估的，例如，通过使用免疫组织化学法或本领域的技术人员所知的其它流程，以监测谱系标记之存在与否。自先驱细胞衍生之后代分化细胞可能，但非必然，与该干细胞之来源组织之相同胚层或组织 有关。例如，神经先驱细胞及肌肉前驱细胞可分化为造血的细胞谱系。所称“谱系走向，，及“特化”于本文交替使用，指一干细胞发展之流程，其中该干细胞发展成定向于形成特定限制范围之细胞分化类型的前驱细胞。定向的前驱细胞通常具有自我更新或细胞分裂之能力。“终末分化” 一词指细胞进入成熟、完全分化的细胞之最终分化。例如，造血前驱细胞及肌肉前驱细胞可分化为神经或神经胶细胞谱系，其终末分化导致成熟的神经或神经胶细胞。通常，终末分化与细胞周期之中断及增生之停止有关。本文所称“前驱细胞”指定向于特定细胞谱系之细胞，且其通过一连串细胞分裂以发展成该谱系之细胞。如同ES细胞，经调适的hUCB具有分化成各种细胞的潜能，包括神经细胞或神经胶细胞。它们因此能用来再生细胞，以治疗脑组织损害。如以下实例所示，hUCB能于活体外轻易地分离、维持及扩增，并且用常规技术方法诱导分化。此外，将经调适的hUCB移植至小鼠或大鼠之后，没有显示有丝分裂的活化细胞、畸胎瘤或恶性肿瘤之证据。这些细胞能被用于移植，以治疗中风、头部创伤或神经退化，而无上述顾忌。由于这些优点，此细胞代表其它多能性细胞之替代者。经此调适之细胞可用标准方法储存或可由脑内投予有需要的患者。于本发明之范畴中，本发明是一种用于治疗患者之脑组织损伤或减轻该病症之症状之方法。此方法包括鉴定出患有或存在发展为脑部组织损伤之潜在风险的患者。此患者可为人类、或非人类之哺乳类动物，如，猫、狗、或马。脑部组织受损之实例包括由脑部缺血 (如，慢性中风)或神经退化性疾病(如，帕金森氏症、阿兹海默症、脊髓小脑症、或亨丁顿舞蹈症)所造成之损伤。欲接受治疗之患者可通过用于诊断有兴趣的病况或病症之标准技术予以鉴定。该治疗方法须将有效量之前述经HP调适之干细胞投予有需要之患者。上述细胞之治疗效果可通过标准方法评估(如以下实例说明者)。为确认增进脑血管新生之功效，吾人可通过标准脑部影像技术于治疗前后检验患者，例如，例如，电脑断层扫描(CT，computed tomography)、都卜勒超音波影像技术(DUI, Doppler ultrasound imaging)、磁振造影(MRI，magnetic resonance imaging)与氢质子磁振频谱(1H-MRS)。例如，氢质子磁振频谱(1H-MRS)代表非侵入性方法，以获取和脑部代谢活动相关之生化资讯 (Lu et al.，1997，Magn. Reson. Med. 37，18-23)。此技术可用于评估有干细胞移植或无干细胞移植之涉及脑部缺血之代谢变化。例如，其可用于研究脑内N-乙酰天门东胺酸(NAA， N-acetylasparate)之浓度，其为脑神经元完整性之指标。虽然神经碎片中NAA的重新分布和残留限制其作为一种定量之神经标记，然而，脑部缺血时之脑中NAA浓度下降仍可被视为神经元丧失或功能异常之指标(Demougeot et al.，2004，J. Neurochem. 90，776-83)。因此，通过1H-MRS测得之NAA浓度可作为有效指标，用以追踪脑部缺血后之干细胞移植之效用。也可在给药前后，从来自动物之样本(如，脑脊液)测量营养因子或细胞死亡相关蛋白质之表现量(如，Epacl或MMP2)。该表现量可通过mRNA含量或是蛋白质含量来决定。 测量组织样本或体液之mRNA含量的方法是公知技术。为测量mRNA含量，细胞可被裂解，而存在于细胞溶解物中之mRNA量，无论纯化与否，皆可通过，如杂交分析(使用可探测之标定的基因特异性DNA或RNA探针)及量化或半量化RT-PCR(使用适合的基因特异性引子对) 测量之。另外，量化或半量化之原位杂交分析可使用可探测之(如萤光或酵素)标定的DNA 或RNA探针，在组织切片或未裂解之细胞悬浮液进行其它的mRNA定量方法包含该RNA保护试验(RNA protection assay,RPA)方法，及基因表现系列分析方法(serial analysis of gene expression, SAGE)，以及以阵列为基础之技术。测量组织样本或体液中蛋白质含量的方法是公知技术。其中部分是使用抗体 (如，单株抗体或多株抗体)，其可特异性地结合至目标蛋白。于此等分析中，该抗体本 身或与其结合之第二抗体皆可接上可探测的标记。另外，该抗体可与生物素结合。其存在能通过可探测标记之卵白素(一种结合生物素的多胜肽)而予以测量。这些方法之结合(包括 “多层夹心结构”分析)可用于提升该方法之灵敏度。一些蛋白质测量分析(如，ELISA或西方墨点法)可被应用于体液或细胞溶解物，或其它者(如，免疫组织方法或萤光流式细胞仪)可应用于组织切片或未溶解之细胞悬浮液。适当的标记包括放射性核种(如，1251、1311、 35S、3H或32P)、酵素(如，硷性磷酸酶、辣根过氧化氢酶、冷光酵素、或半乳糖苷酶)、萤光 /冷光剂(如，萤光素、盐基桃红精、藻红素、GFP、BFP、以及由Quantum Dot Corporation, Palo Alto，CA所供应之Qdot 奈米粒子)。其它他可应用之方法包含定量免疫沈淀分析或补体结合试验。基于上述分析之结果，可决定适当的剂量范围和投予途径。所需剂量取决于所选择的投予途径、配方的性质、病患的疾病性质、患者的身材大小、体重、表面积、年龄和性别、 其它的投予药物以及主治医师的诊断。有鉴于不同投予途径有不同的效率，因此，剂量的变化是必须的。此变化可使用可用标准经验上常见途径来调整使之最佳化，这是本领域能够理解的。一般而言，可投予IxlO4及IxlO7 (如，IxlO5至5xl06以及更佳为5x10s至2xl05) 的细胞。可使用多重区域，其视特定损伤之位置及性质而定。下述实例说明用于在大鼠缺血模式中投予细胞之近似座标。在其它物种的其它疾病之作标可依比较解剖学来决定。异体或自体hUCB均可使用。于前者情况，应进行HLA配对，以避免或降低宿主反应。于后者情况，自体hUCB可从患者中予以富集及纯化，然后保存供后续使用。本发明的另外特征是一种治疗神经退化疾病之方法。此方法包括鉴定出患有或存在发展为脑部组织损伤之潜在风险的患者，以及将有效量之多能性动物细胞投予该患者， 其以上述方法处理。神经退化性疾病的例子包括帕金森氏症、阿兹海默症、脊髓小脑症、或亨丁顿舞蹈症。在上述所有方法中，投予(如，大脑内)至患者的细胞数为IxlO4至1x107 次，较佳为IxlO5至5xl06/次或更佳为5xl05至2xl06/次。为降低或避免宿主排斥，较佳的细胞为患者自体的细胞。“治疗”一词指将组合物(如，细胞组合物)投予至患有，其患有或存在发展为脑部组织损伤或因疾病而造成该损伤之潜在风险，目的为治愈、减轻、解除、治疗或缓解损伤/ 病症、该损伤/病症之症状、继发于该损伤/病症之疾病状态或倾向于该损伤/疾病之易感性。该治疗方法可单独进行或与其它药物或疗法并行。上述方法可进一步包括于细胞移植前、同时、或其后，以一种低度抑制免疫方案投予患者。可采用多种类型的抑制免疫方案。实例包括投予抑制免疫药物、诱发免疫耐受性的细胞群、及/或抑制免疫的辐射射线。选择及投适合的抑制免疫方案之指导原则是本领域公知技术(如，Kirkpatrick et al.，1992. JAMA. 268，2952 ；Higgins et al.，1996. Lancet 348，1208 ；Suthanthiran et al.，1996. New Engl. J. Med. 331,365 ；Midthun et al.，1997. Mayo Clin Proc. 72,175 ；Morrison et al. ,1994. Am J. Med. 97,14 ；Hanto 1995. Annu Rev Med. 46,381 ；Senderowicz et al. ,1997. Ann Intern Med. 126,882 ；Vincenti et al.,1998. New Engl. J. Med. 338,161 ；Dantal et al. 1998. Lancet 351,623)。合适的抑制免疫药物之实例包括CTLA4_Ig、抗-⑶40之抗体、抗-⑶40配位基之抗体、抗-B7之抗体、抗-⑶3之抗体(例如，抗-人类⑶3之抗体0KT3)，胺甲基叶酸(methotrexate，MTX)、培尼皮质酮、甲基培尼皮质酮、咪唑硫嘌呤、环孢子菌素 A (cyclosporin A，CsA)、他克莫司(Tacrolimu s)、环磷酸酰胺以及福达乐(f ludarabin)、山喜多(mycophenolate mofetil)、赛尼哌(一种人类化(IgGl Fe)之抗 IL_2Ra 链(CD25) 抗体)、共轭于毒素(例如，霍乱A链或绿脓杆菌毒素)之抗-T淋巴细胞抗体、以及能抑制哺乳动物雷帕霉素目标蛋白(mammalian-target-of-rapamycin，mTOR)之活性的抑制剂。本发明提供一种医药组合物，其包含前述细胞或活性试剂/化合物。在一实例中， 本发明的特征是一种组合物，其具有前述多能性细胞(如，CD34+细胞或从脐带血获得者) 与低氧试剂(如，去铁胺与CoCl2)。医药组合物之制备可通过混合治疗有效量之细胞或活性试剂/化合物(可视需要之其它活性物质)及医药上可接受的载剂而制得。上述医药组合物可通过使用已知的医药赋形剂及制备方法来制备。所有赋形剂可与溶剂、粒化剂、保湿剂及黏合剂进行混合。本文所称“有效量”或“治疗有效量”指造成特定病症之至少一种症状或参数之可测量的缓解的含量。前述细胞之治疗有效量可由此领域已知之方法决定。用以治疗一并症之有效量可通过本领域技术人员所知的经验方法而轻易地决定。用以投予病患之确切含量将依该病症之情况及严重度以及该病患之生理情况而有所不同。任何症状或参数之可测量的缓解可由本领域的技术人员而决定或由该病患向医师报告。将被理解的是，前述病症之任何症状或参数之任何临床上或统计上的显著减弱或缓解皆属于本发明之范畴内。临床上的显著减弱或缓解意指对于该病患及/或于医师而言是可察觉的。“医药上可接受的” 一词指该等组合物之分子个体及其它成分，当投予人类时，其生理上可接受的且一般不会产生不想要的反应。较佳地，所称“医药上可接受的”意指联邦或州政府之管理处所核准者、或列于美国药典、或于其它一般公认可用于哺乳动物(特别是指人类)之药典者。医药上可接受盐类、酯类、酰胺，以及前驱药，指该些盐类(如，羧酸盐、胺基酸添加盐)、酯类、酰胺，以及其前驱药，其于可靠的医疗判断范畴内适合用于与病患组织接触，而无过度毒性、刺激性、过敏反应及其类似者，其与合理的利益/风险相称，且对于所欲用途是有效的。可应用于前述医药组合物之载剂指稀释剂、赋形剂、或载体，由此化合物予以投用。该等医药载剂可为无菌的液体，例如，水及油。较佳地，水或水溶液、盐液、及液态葡萄糖及甘油溶液可作为载剂，特别是可作为注射溶液。适合的医药载剂说明于E.W.Martin所撰之"Remington' s Pharmaceutical Sciences"第 18 片反。该等前述细胞可通过灌注或注射(例如，静脉注射、脑脊髓膜内注射、肌肉注射、 腔内、气管内、腹腔或皮下)、口服、皮肤穿透、或此领域所知的其它方法而投予至个体。投予可为每两周一次、一周一次、或更频繁，但当该疾病或病症于维持期时，其投予频率则可能会减少。以下特定之实施例仅供示例说明，无论以何种方式无法限制未揭示部分。无需进一步详细阐述，相信本领域技术人员可基于本文之说明，将本发明发挥至极致。本文所有引述文献以参考方式并入本说明书中。再者，任何以下所提及之机制不会以任何方式限制本发明专利权利要求之范畴。材料与方法CD34+hUCBs (hUCB34)之纯化与筛选

如先前所述(Kekarainenet al.，2006，BMC Cell Biol 7 :30)，从新鲜或冷冻保存的人类脐带血(hUCBW) (Stemcyte，USA)制备单核球细胞(Mononuclear eel Is, MNCs)。用淋巴细胞分离(Ficoll-Histopaque，Sigma, USA)离心法(Asahara et al.，1997，Science 275 :964-967)将MNC层收集，接着以含ImM EDTA的PBS清洗两次。依制造商之说明书， 通过磁珠分离法(MACS ；Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)，从 2X IO8MNCs 中分离出 CDSA+MNCstj简言之，将MNCs悬浮于300 μ L PBS与5mM EDTA中。这些细胞以抗CD34的半抗原共轭单株抗体(Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)及结合微珠之抗-半抗原之抗体的进行标记，然后以每108细胞100 μ L磁珠之比例在4°C中共育15分钟。磁珠阳性细胞在磁场中(⑶34+MNCs)富集于正向-筛选-管柱。使用标记藻红蛋白(phycoerythrin， ΡΕ) (Becton Dickinson, USA) "CD34 # (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany) M 于MACS-收集细胞进行之FACS分析显示选出的细胞有94% 士 1.7%为⑶34阳性(数据未显示)。接着，以 1 μ g/mL 的双苯甲亚胺(bis-benzimide ；Hoechst 33342 ；Sigma, USA) 标记细胞，在37°C、5%二氧化碳/95%空气的潮湿气体与抗生素中，于培养液(StemSpanTM SFEM and Cytokine Cocktail, StemCell Technologies)培养 72 小时，并为进一步的移植而作准备。低氧预调控(HP)程序与形态分析将hUCB34 细胞(1 X 106/mL)培养在 StemSpan SFEM 培养液中，于 37 °C、5 % C02 潮湿培养箱中，条件为正常氧(20% O2)或低氧(1% O2)，如先前所述(Ivanovic et al.， 2000,Br J Haematol 108:424-429)。低氧培养是以双-气体培养箱(Jouan,Winchester, Virginia,USA)配备O2探针来调节N2浓度。以台盼蓝排除分析来评估细胞数目与存活数。 对于流式细胞仪部分，细胞与抗-人类CD34 (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)共育， 接着以FACSCalibur流式细胞仪(Becton，Dickinson and Co.)分析。为了产生化学性的低氧，细胞以含有 60 至 600mM 去铁胺(Desferrioxamine，DFX, Sigma-Aldrich, MO)之培养液处理，其通过抑制HIF-I α因泛素化所必需的脯胺酰基残基之羟化作用来模拟低氧调控 (Schioppa et al.，2003，J Exp Med 198 1391-1402)。Rapl活性分析Rapl活性分析根据制造商之说明书使用Rapl-活性分析套组(Upstate)而进行 (Goichberg et al.，2006，Blood 107:870-879)。简言之，hUCB34 是以前述之短暂低氧处理。然后，将细胞裂解于Rapl活性裂解缓冲液中。通过离心使细胞溶解物澄清化，保留一部分细胞溶解物，供分析总Rapl含量之用，另将500 μ L溶解物与预先连结至麸胱甘胺酸小珠之Ral⑶S的GST-标记RBD (Upstate)共育，以特异性地将Rapl之GTP-结合态沉淀出。 样本在4°C共育45分钟同时温和的旋转。在溶解缓冲液中清洗小珠三次。使用西方墨点法以抗Rapl抗体侦测Rapl (Upstate)。(Chromatin immunoprecipitation, ChIP) yMff为了证明HIF-I α 蛋白会结合至 Epacl 启动子上(Zanata et al.，2002，Embo J 21 :3307_3316)，以市售套组(Upstate Biotechnology)使用制造商之说明书，以些微调整进行Chip分析。hUCB34生长并培养于空气或O2中4小时，接着直接加入甲醛至培养液中，最终浓度为1%，随后依先前文献所述(Ponnusamy et al.，2008，J Biol Chem 283 27514-27524)在37°C下培养20分钟。在连结至蛋白质A琼脂珠上之鲑鱼精子DNA上分离 DNA-蛋白质复合体，并以1%505与0. IM NaHCO3冲提。通过在65°C下共育5小时进行交联 (cross-linking).用蛋白质酶K移除蛋白质，接着以酚/氯仿萃取DNA，回溶并且与Epacl 启动子引子以PCR-增幅， iEt^ii歹IJ 59-attcagcagatatagggcag-39反向序列59-acagtcagctctcattaatg-39 (反向)。(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)已有先前文献描述使用EMSA以评估HIF-I α DNA结合活性之详细方法(Yin et al.，2000，Biochem Biophys Res Commun 279:30-34)。使用市售套组制备细胞核萃取物(Pierce)。使用对应到Epacl启动子中的低氧反应元件(hypoxia-response element,HRE)之寡核苷酸探针(5，-CCTCCCGGCCACGTGGCGGCCAG-3，及 5，-GGAGGGCCGGTGCA CCGCCGGTC-3’)。依制造商之说明书，使用光移位EMSA套组(Pierce)进行寡核苷酸之非-放射线标记。简言之，结合反应于20ml之含有结合缓冲液(IOmM Tris-HCl、20mM NaCl, ImM DTTUmM EDTA、以及 5%甘油、pH 7. 6)、标记探针 0. Ing( > 10，OOOcpm)、核蛋白 30 μ g 与聚(dl-dC) 1 μ g的反应混合物中进行。于室温下共育20分钟后，该混合物在非变性6% 聚丙烯酰胺胶体上，于低离子强度条件下，以180伏特进行胶体电泳2至4小时。将该胶体予以真空干燥并进行自动放射显影照相。对于超位移分析，在加入标记探针前1小时，将 Iyg 之抗-HIF-I α 抗体(Novus Biologicals)加入样本中。实验动物的脑内hUCB34移植将实验大鼠与小鼠分成3组(图2A)经HP之hUCB34之脑内移植组(HP-hUCB34)、 无HP之hUCB34之脑内移植组(hUCB34)与空白-对照组。所有移植在第7天进行。HP-hUCB34 组在低氧条件下处理20至24小时。在各实验组的第O天诱发脑部缺血。在脑部缺血后第7天，两组脑内移植hUCB34的实验大鼠通过26-或30- 口径之Hamilton注射器以立体定位方式注射3至5 μ L PBS悬浮液到3个大脑皮质区域，硬膜下方3. O至5. Omm (小鼠为 2. O至3. Omm)，该悬浮液有约2 X 105具双苯甲亚胺标记的hUCB34。这些位置之近似座标大约是前囟门前方1.0至2. Omm(小鼠为O至1.0mm)与中轴线旁3. 5至4. Omm(小鼠为2.0 至2. 5mm)、前囟门后方0.5至1.5mm(小鼠为0至1.0mm)与中轴线旁4.0至4. 5mm(小鼠为2.0至3. 5mm)以及前囟门后方3. 0至4. 0mm(小鼠为1. 5至2. 5mm)与中轴线旁4. 5至 5. Omm(小鼠为2. 0至3. 0mm)。每次注射后针头停留在原处5分钟，然后于头骨缺损处敷上一片骨蜡防止注射液体漏出。空白-对照组大鼠在立体定位下注射盐水。各组实验大鼠每天注射环孢子菌素A (CsA，10mg/kg,皮下注射，Novartis)，分别地以等量的CsA或盐水注射到移植组和盐水对照组，如先前所述(Muller et al. ,Nature 410:50-56 and Aandahl et al. ,2002, J Immunol 169:802-808)。为了抑制移植的 HP-hUCB34 之 Epacl 之活性，细胞另再与10μ g/ml布雷菲德菌素A(brefeldin A,BFA)作用2-3小时，如先前所述(Muller et al.，Nature 410 50-56 and Aandahl et al.，2002，J Immunol 169 :802_808)。此夕卜，连续8天于腹腔注射一种广泛性、特定-种类之金属蛋白酶抑制剂(GM6001，Chemicon) IOOmg/ kg,如先前所述(Lee et al. ,2006, J Neurosci 26:3491-3495)。
神经病学的行为评分在脑部缺血3天前进行行为评估。该测试是测量(a)身体的不对称性，如先前所述，(b)运动功能，如先前所述，与(c)抓力，使用抓力测量仪(TSE-Sy stems ,Germany)进行， 如 先前文献加以修改(Shyu et al. ,2008, J Clin Invest 118:2482-2495)。[18氟]氟化-2-去氧葡萄糖正子断层造影(FDG-PET)检查为了评估脑组织代谢活性，使用[18氟]氟化-2-去氧葡萄糖([18F] fluoro-2-deoxyglucose,FDG)之microPET扫描检验实验大鼠，以测量相对代谢活性，如先前所述(Carmichael et al. ,2004, Stroke 35 :758_763)。简言之，如先前所述(Hamacher et al.，1986，J Nucl Med 27 :235_238)，以自动 18 氟-FDG 合成系统(Nihonkokan)合成 18 氟-FDG。以高解析度的小动物PET搜集数据(microPET Rodent R4, Concorde Microsystems Inc.)，该系统参数如Visnyei等人之先前文献所述(Carmichael et al. ,2004, Stroke 35: 758-763)。在各处理一周后，以水化氯醛(0. 4g/kg，皮下)麻醉动物，固定于订做的头部固定器，并于microPET扫描器下定位。然后，对动物给予溶于0. 5mL盐水的18氟_FDG(200 至250 μ Ci/大鼠)之高量静脉注射。使用3-D撷取技术，在一基础位置上，于注射同时开始撷取资料并持续60分钟。将从microPET取得的影像资料显示出来，并且通过5. 5版本 IDL (Research Systems)禾口 3· 2 版本 ASIPro (Concorde Microsystems)之软体进 亍分析。 用于纹状体和皮质测量之冠状切片代表来自前囟门0与+Imm之间的脑部区域，而视丘测量代表来自前囟门_2与_3mm之间的脑部区域，其系如非损伤侧之目视检查所测量者。在终脑皮质与皮质所关注区域中的相对代谢活性以百分比缺损表示，如先前所述加以修改 (Carmichael et al.，2004，Stroke 35 :758_763)。评估hUCB34移植所诱发之血管新生通过静脉注射投予萤光标记血浆(FITC-dextran，Sigma, USA)至大鼠并以萤光显微镜观察(Carl Zeiss, Axiovert 200M,Germany)，以分析脑的微循环，如先前所述(Morris et al.，1999，Brain Res Brain Res Protoc 4:185-191)。此外，为量化脑血管密度,实验大鼠以水化氯醛麻醉，接着以4%三聚甲醛灌流。以⑶-31(1 100, BD-Pharmingen, USA)特异性并与 Cy-3(1 500，Jackson Immunoresearch，PA，USA)共轭之抗体对组织切片(6μπι)进行染色。测定血管数目，如先前所述(Taguchi et al.，2004，J Clin Invest 114 330-338)。脑血流(cerebral blood flow, CBF)之测量将实验大鼠以立体定位仪定位，并且在脑部缺血后，于麻醉状态下以雷射都卜勒血流仪(LDF monitor, Moor Instrutments, Axminster, U. K.),监控底线区域之皮质血流(baseline local cortical blood flow，bCBF)，如先前所述(Park et al. ,2005, J Neurosci 25:1769-1777)。简言之，CBF值的计算是相较于bCBF之增加的百分比。原位酶谱分析(In situ zymography, ISZ)与免疫组织化学染色为找出明胶酶活性区域，以标记FITC之明胶在脑切片上进行原位酶谱分析。将缺血脑部(在不同时间点移植后3天、7天、14天以及28天)快速移出，而不进行固定，然后于干冰上冷冻，如先前所述(Amantea et al.，2008，Neuroscience 152 :8_17)。在冷冻切片 (每片20μπι)后，依制造商之说明书，使标本于37°C与萤光标记明胶(Invitrogen)共育。 通过使用此技术，基质之蛋白水解造成绿萤光之解除阻断。ISZ结合针对Neu-N与Epacl之神经元-特异性标记之免疫组织化学染色，其它另外的切片接着以2%三聚甲醛固定并且使用与 Cy-3(1 500 Jackson Immunoresearch)共轭之 Neu-N(1 200，Chemicon)以及 Epacl (1 ； 400, Santa Cruz) ^ifl{φ, ill^T^Mfeid (Amantea et al. , 2008, Neuroscience 152 8-17)。西方墨点分析法使用西方墨点 分析法在hUCB34-处理组与对照组动物中测量右脑皮质与纹状体区域蛋白质表现，如先前所述(Shyu et al. ,2005, J Neurosci 25:8967-8977)。简言之，实验动物在脑部缺血后3天断头。从中风脑之周围区域(边缘区域)与纹状体取得缺血的脑皮质样本。在这些样本上进行西方墨点分析。接着将缺血的脑组织在含有320mM蔗糖、5mM HEPESU μ g/mL亮抑酶与1 μ g/mL抑肽酶之缓冲液中均质与溶解。溶解物在13000g下离心 15分钟。将产生的沉淀物重新悬浮于样本缓冲液中(62. 5mM Tris_HCl、10%甘油、2% SDS、 0. 溴酚蓝与50mM DTT)，并进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(4至12% )电泳。然后移转至 Hybond-P尼龙膜上。接着与适当稀释之Bcl-2(稀释率1 200 ；Santa Cruz，USA)、Bax (稀 200 ；Santa Cruz,USA) 200 ；Transduction Laboratories,USA) >
MMP2(1 200，Abeam)、Epacl(l 400，Santa Cruz)、CXCR4 (1 200，R&D System)以及 i3-Actin(稀释率1 : 2000，Santa Cruz，USA)之抗体作用。依照制造商之使用明，针对各别抗体进行膜阻断、初级与次级抗体共育及化学发光反应。每个条带之强度用Kodak Digital Science ID Image Analysis System (Eastman Kodak，Rochester，NY)测量。与内对照组比较，计算出西方墨点之条带强度比例。胶体酶谱法分析将带有等量脑萃取物与细胞溶解物之蛋白质装载至具明胶(Bio-Rad，CA)之10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。于电泳后，胶体在5% Triton X_100中清洗然后与MMP分析缓冲液共育(Bio-Rad)。条带以考马斯亮蓝显现并在30%甲醇与10%醋酸退染。体内神经轴再生之评估将脑组织样品进行免疫染色，以测量神经轴向外生长。神经轴再生之测量如先前所述进行之(Cafferty et al. ,2004, J Neurosci 24:4432-4443)。简言之，将各实验大鼠之脑组织样品固定并且以抗β-微管(1 400 ；Sigma)之专一抗体免疫染色。为了定量分析，具有大于细胞本体直径两倍以上之突起的神经元视为具有神经轴之细胞而并入计算。 使用数位影像与影像分析软体(SigmaScan 4. 01. 003)，从数位影像测量每个神经元最长神经轴之长度并予以定量。基因转殖与剔除小鼠谱系Nestin-EGFP 基因转殖小鼠为 Dr. Docherty (Bernardo et al. ,2006, Mol Cell Endocrinol 253 14-21)所赠。MMP9 缺陷小鼠(MMP9-/-)购自 Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA)。MMP2 同型合子缺陷小鼠(MMP2-/-)通过与来自 RIKEN Brain Science Institute之异型合子杂交而得。所有动物实验皆通过中国医药大学动物研究伦理委员会的审查与批准。脑组织之免疫组织化学评估动物以水化氯醛(0.4g/kg，腹腔注射)麻醉后，以盐水灌流心脏，接着以泡入 4%三聚甲醛而予以灌流，由此将脑固定，如先前所述(Shyu et al. ,2004, Circulation110:1847-1854)。以与 FITC(1 500 Jackson Immunoresearch)或 Cy3(l 500 ； Jackson Immunoresearch)共辄之抗 Epacl (1 ； 400，Santa Cruz) >MMP2 (1 ； 50，Abeam)、 GFAP(1 400 ；Sigma)、MAP-2(1 200 ；BM), Neu-N(1 200 ;Chemicon)及 vWF (1 400 ； Sigma)之特异性抗体进行双重免疫萤光技术，如先前所述。组织切片以Carl Zeiss LSM510 雷射扫瞄共轭显微镜分析。分离GFP+之神经干细胞(GFP+NSCs)将3天大之NeStin-EGFP-C57BL/6基因转殖小鼠之脑取出。在移除脑膜后，从侧脑室侧壁无菌地分离并分解海马回脑室下区，如先前所述(Wachs et al. ,2003, Lab Invest 83:949-962)。然后，细胞重新悬浮在 Neurobasal (NB)培养液中(Gibco BRL，Germany)， 添加 B27 (Gibco BRL, Germany)、2mM L-麸酰胺酸(PAN, Germany) U00U/ml 盘尼西林与 0. lmg/L链霉素(Gibco，Germany)。为了培养物之维持与扩增，NB/B27额外添加2 μ g/mL 肝素(Sigma, Germany), 20ng/mL FGF-2 (R&D Systems, Germany)以及 20ng/mL EGF (R&D Systems, Germany)。培养在37°C潮湿的5% C02培养箱中。使用继代培养数为4到6之 GFP+NSC于整个研究中CD34+细胞与GFP+NSCs之共培养利用胰蛋白酶获得GFP+NSCs (1 X 106)，接着分配至6孔组织培养盘之各孔中，俾与⑶34+共同培养。免疫筛选的⑶34+约为1 X 104细胞/mL，重新悬浮于在6-孔组织培养盘中之2mL混合物中，其包含 10%FBS、2mmol/L L-麸酰胺酸、IX ITS-S(Life Technologies, San Francisco，CA，USA)、足量的人类重组促血小板生成素(rhTPO ;Kirin Brewery, Tokyo, Japan) >50ng/mL flt3- # (FL ；R&D systems, Minneapolis, MN, USA) >50ng/ mM^ -3(Interleukin-3, IL-3 ；R&D systems, Minneapolis, MN, USA)与 25ng/mL S 素-6(Interleukin-6, IL—6 ；R&D systems, Minneapolis, MN, USA)及 DMEM。每 2 天添力口 1 毫升新鲜培养液至各孔中，总共达8天。免疫细胞化学分析以PBS清洗细胞培养物，然后在4%三聚甲醛下于室温固定30分钟，如先前所述(Cafferty et al. ,2004, J Neurosci 24:4432-4443)。在 PBS 清洗后，以阻断溶液处理固定后的培养细胞达30分钟(PBS内含10g/L BSA.0. 03% Triton X-100、以及4%血清)。以初级抗体与细胞于4°C共育一夜，其包括神经胶酸性纤维蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP, 1 300 ;Chemicon)、基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor 1，SDF-I，1 200 ；Chemokine)、第 4 型 CXC 受器(CXCR4,1 200 ；Chemokine)、 MMP9(1 200，Abeam)、β III-微管(Tuj_l，l 200 ;Chemicon)、微管相关蛋白-2 (MAP-2， 1 300 ；Chemicon)以及神经细胞核抗原(Neu-N, 1 50 ;Chemicon)，达3小时，随后与共轭于FITC之次级抗体共育达3小时，然后在PBS中润洗3次。最后，玻片以DAPI轻度对比染色，以清水润洗，然后封片。活体外神经轴再生之评估为了 β-微管之免疫染色，细胞培养物以PBS清洗并在室温下于4%三聚甲醛固定 30分钟。以PBS清洗后，固定的细胞培养物以阻断溶液处理30分钟(PBS内含10g/L BSA、 0. 03% Triton X-100、以及4%血清)。细胞与抗β -微管(1 200 ；Chemicon)之初级抗体于4°C共育一夜，达3小时，随后与共轭于FITC的次级抗体次级抗体共育达1小时，然后在PBS中润洗3次。最后，玻片以DAPI轻度对比染色，清水润洗然后封片。评估具有神经轴细胞之数目以及神经轴长度，如先前所述加以修改之(Cafferty et al. ,2004, J Neurosci 24:4432-4443)。简言之，各处理组在0⑶后分盘、固定且对β -微管进行免疫染色。为了定量分析，具有大于细胞本体直径两倍以上之突起的神经元视为具有神经轴之细胞而并入计算。使用数位影像与影像分析软体(SigmaScan 4. 01. 003)，从数位影像测量每个神经元最长神经轴之长度并予以定量。所有测量数据是从3次重复的实验计算而来。统计分析本研究中所 有测量皆为盲目(blindly)进行。结果以平均值士SEM.表示。行为分数已为常态性而评估之。学生t-试验用以评估对照组与处理组间平均差异。缺少正常分布之数据是以单因子变异分析(One-Way AN0VA)进行分析。P值小于0. 05视为显著。结果HP提升hUCB34细胞的良好功效西方墨点显示在低氧条件下20至24小时，在蛋白质浓度上，确认HP-hUCB34中有增加的Epacl表现(图IA-I至1A-2)。以DFX处理之HP-hUCB34，在低氧或正常氧条件下，达到远高于对照组细胞之Epacl浓度(图1A)。我们也在HP-与DFX-处理的hUCBs34中测得低氧诱发因子-1 α (HIF-1 α )之蛋白质浓度增加(图1Α-1至1Α-2)。短暂低氧之HP-hUCB34 增加Rapl的GTP-键结活化态，并且在刺激15分钟后达到最大值。这些数据显示HP-hUCBs34 表现出功能性的Epacl以及低氧能在HP-hUCB34激活Rapl-GTP之活性。为了获得HIF-I α与Epacl启动子之间交互作用的直接证据，我们用染色体免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)分析法，测量针对 Epacl 启动子之 HIF-Ia 吸引反应。虽然在正常氧调控下未观察到HIF-I α与Epacl启动子之间有交互作用，但是在低氧调控4小时后明显测到针对Epacl启动子之HIF-I α吸引反应。在脑部缺血后脑内移植HP-hUCB34增进神经病学的行为使用神经病学的行为测量方法，评估在HP-hUCB34-(η = 10)及hUCB34-处理大鼠(η =10)与对照组大鼠(η = 10)上，于MCA结扎前后之神经病学的功能(图2Α)。行为的测量分数皆与基准分数校正。因为脑部缺血造成运动能力不平衡，所有的实验大鼠在脑部缺血1天后，发生明显肢体不协调与脑部缺血侧之对侧旋转。通过磁珠分离法(MACS)分离出 hUCBs34。分离出来的hUCB34之纯度以FACS分析法鉴定系大于90% (数据未显示)。在处理14至28天后，相较于hUCB34-处理和对照组，以HP-hUCB34移植处理的大鼠显示出肢体不协调性显著地减少(图2B)。测验所有动物在脑部缺血前后之运动能力。大鼠接受脑部缺血后HP-hUCB34移植组相较于hUCB34-处理与对照组在第14与28天间垂直活动、垂直移动时间以及垂直移动次数显著地增加(图2C、D与E)。另外，抓力的测量用于测验所有实验大鼠在处理前与其它两种处理28天后的前肢力。结果显示，在HP-hUCB34组较hUCB34-处理组与对照组有较高的抓力比率(图2F)。相反地，各实验大鼠在HP-hUCB34植入后(η = 8)， 接受腹腔注射MMP抑制剂(GM6001)在神经病学的行为测量显示几乎无恢复，其与空白对照组大鼠在脑部缺血后的测量相同(图2Β至F)。另外，通过抑制Epacl活性，缺血大鼠移植以布雷菲德菌素A(brefeldin Α)诱导后之HP-hUCB34，在神经病学的功能障碍改善程度会向下调节至与对照组相同(η = 8)(图2B至F)。HP-hUCB34-处理的中风大鼠之葡萄糖的代谢活性增加
为证实是否脑内移植 HP-hUCB34能增加葡萄糖的代谢活性，各实验大鼠接受 18FDG-PET检测。在各处理1周后通过FDG microPET测量葡萄糖代谢。摄入的FDG在 microPET下影像显示出HP-hUCB34处理组中整个右脑皮质摄入的FDG明显增加(图2G-1 至2G-2)。脑右半球(相对于非中风的脑半球)之相对葡萄糖代谢活性的半定测量量，显示HP-hUCB34-处理大鼠(η = 8)相较于hUCB34-处理(η = 8)以及对照组大鼠(η = 8)明显地增加(图2G-2)。脑内移植HP-hUCB34增加活体内细胞植入与神经分化为了判定是否外源性移植HP_hUCB34可成功植入缺血脑部并且在实验大鼠的缺血脑部能分化成神经元以及神经胶细胞，使用雷射扫瞄共轭显微镜进行免疫萤光共定位研究。以双苯甲亚胺标记之移植的HP-hUCBs34适当地植入缺血脑部(图3A-1与3A-2)。在 HP-hUCB34处理过的缺血大鼠脑部之边缘部位中，共定位研究显示某些双苯甲亚胺标记细胞与MAP-2、Neu-N与GFAP的抗体具有共同位置(图3B_D)。HP-hUCB34-处理过的大鼠分化率( 5. 5% MAP-2+、 4% Neu-N+ 与 9. 5% GFAP+) (η = 8)也高于 hUCB34_ 处理过的大鼠( 3% MAP-2+、 2% Neu-N+ 与 5% GFAP+) (η = 8)。此夕卜，在 HP-hUCB34-处理大鼠通过注射GM6001(n = 8)与布雷菲德菌素A-预处理(η = 8)也会降低植入细胞之数目 (图 3Α-2)。脑内移植HP-hUCB34诱发血管新生以促进脑血流量(facilitate cerebral blood flow, rCBF)为了侦测HP-hUCB34是否能诱发血管新生，在HP-hUCB34-处理、hUCB34-处理与空白_对照组大鼠的脑切片上进行双重免疫萤光染色、FITC-葡聚糖灌流检查与血管密度分析。结果指出在几组移植过HP-hUCB34 (双苯甲亚胺-标记)在缺血的脑部之边缘区域中显示血管的形态(vWF细胞)围绕在周边血管与内皮区域(图3E)。目视检查指出HP-hUCB34 处理组(η = 8)比hUCB34处理组(η = 8)和对照组(η = 8)，其充满FITC-葡聚糖的脑微血管有明显的增加(图3F)。血管密度的定量通过⑶31免疫染色检查(图3F)，发现边缘区域中以HP-hUCB34处理的缺血大鼠(η = 6)比以hUCB34处理的缺血大鼠(η = 8)或对照组大鼠(η = 8)，表现出显著较多的新生血管。为了验证是否增加的血管密度能增强缺血脑部之CBF的功能，在脑部缺血后于麻醉情况下以雷射都卜勒血流仪(LDF)监测实验大鼠。脑部缺血后一周，相较于hUCB34-处理 (η = 8)和对照组大鼠(η = 8)，HP-hUCB34-处理的大鼠(η = 8)之皮质中间脑动脉之CBF 显著增加。(图3G-1与3G-2)。脑内移植HP-hUCB34可通过增加抗-凋亡蛋白、Epacl与MMP2之表现援救神经组织为了研究移植HP-hUCB34影响重塑之分子机制，我们检测凋亡_相关蛋白之表现。西方墨点法显示，在移植后3天，相较于hUCB34-处理(η = 6)和对照组大鼠(η = 6)， HP-hUCB34-处理大鼠(n = 6)有显著地向上调节的抗凋亡蛋白(如Bcl_2)(图4A-1与 4A-2)。为了检测移植HP-hUCB34是否会提高脑部缺血大鼠之Epacl与MMP2之表现，我们使用原位酶谱法(ISZ)、胶体酶谱法(GZ)、免疫组织化学法以及西方墨点法分析。ISZ证实明胶酶活性会表现于整个脑，尤其是在移植HP-hUCB34后的整个预移植区域(图4B-1至4B-3)。ISZ之增加的明胶酶活性显示在移植HP-hUCB34后与Epacl共表现(图4B-2与 4B-3)。移植7天后，ISZ结合IHC分析显示HP-hUCB34-处理大鼠(η = 6)比hUCB34-处理大鼠之脑切片有更多的明胶-Neu-N-双苯甲亚胺之共表现细胞(4C-1与4C-2)。GZ显示在移植7天后，HP-hUCB34-处理大鼠(η = 6)比hUCB34-处理大鼠(η = 6)之明胶酶活性(ΜΜΡ2) 明显增加(图4D-1与4D-2)。西方墨点蛋白质表现数据显示在3至7天后HP-hUCB34移植大鼠比hUCB34-处理⑶(η = 6)和空白-对照组大鼠(Cv) (η = 6)之Epacl与ΜΜΡ2明显增加(4Ε-1与4Ε-2)。移植HP-hUCB34会增加Rapl之GTP-键结活性，在移植后3天达到最高。在IHC实验，3D共定位显示移植HP-hUCB34会提升处理后第7天植入细胞中Epacl与 MMP2的共同表现(图4F)。脑内移植HP -hUCB34提升神经元新生以增进活体内神经轴再生为了侦测在实验大鼠缺血脑中移植的HP-hUCB34是否能经由Epacl活化调节以分化成神经元与神经胶细胞，使用雷射_扫瞄共轭焦显微镜进行免疫萤光共定位实验。在三度空间的共定位实验，结果显示在HP-hUCB34-处理与hUCB34-处理的缺血大鼠脑部边缘处， 某些双苯甲亚胺标记的细胞与Epacl+细胞具有共同位置，亦进一步与其它MAP2+、Neu-N+ 或GFAP+细胞具有共同位置(图5A-1至5A-3)。测量干细胞移植组和对照组神经轴形成，以确认HP-hUCB34或hUCB34的移植是否会刺激神经轴向外生长。脑内移植HP-hUCB34比hUCB34-处理和对照组大鼠明显的增进神经轴的再生(图5B-1)。在脑部缺血28天后，HP-hUCB34-处理大鼠(η = 8)比hUCB34-处理(η = 8)或对照组大鼠(η = 8)明显有较长的神经轴延伸至整个边缘区域(图5Β-2)。再者，在脑部缺血28天后，HP-hUCB34-处理大鼠(η = 8)比hUCB34-处理(η = 8)或对照组大鼠(η = 8)， 在边缘区域以及纹状体中有更多的具有神经轴之神经元。然而，在脑内缺血大鼠中移植以布雷菲德菌素A(brefeldin Α)诱发之HP-hUCB34 (η = 8)无法促进神经轴再生(图5Β-1至 5Β-3)。再者，在脑内缺血后之ΜΜΡ2-/-小鼠移植HP-hUCB34与hUCB34(n = 8，每组)与同窝对照组小鼠(η = 8)相比，无法显著地改善神经轴退化(图5C-1与5C-2)。前述结果证明以⑶34—免疫收集之人类脐带血之造血干细胞(HP-hUCB34)之HP可激活通过HIF-I α诱发由cAMP活化的交换蛋白_1 (Epacl)。通过HP之Epacl活化是通过测量 Rapl GTP 酶-活化蛋白(Rapl GTPase-activating protein, Rapl-GTP)之表现而表示之。在干细胞移植脑部缺血模式中，在HP-hUCB34中活化的Epacl-Rap讯息传递通过增进神经病学上的缺损及葡萄糖的代谢活性而增强神经重塑性，并提升神经前驱细胞(neural progenitor cells, NPCs)的复位。此外，在 HP-hUCB34 中经由 Epacl-Rapl 传递增加 MMP2 之活性也促进了干细胞移植后的中风大鼠之血管新生与神经轴再生。总结，在hUCB34中通过HP活化之EapcI-Rapl讯息传递进一步调控MMP2活性，其在HP-hUCB34移植的脑部缺血模式中提供神经重塑的微环境。其它具体实施例所有于本说明书所揭露之特征可以任何组合方式组合。于本说明书所揭露之每一特征可通过另一相同、等效、或相似目的之可替换特征来置换。因此，除非明确陈述，否则每一揭露之特征仅为各种等效或相似特征的一般系列之例示。于前述说明中，本领域技术人员可轻易确认本发明之必要技术特征，在无脱离其精神及范围下，可对本发明进行各种不同改变及修改以使其适用于各种不同之用途及情况。因此，其它之具体实施例亦在以下权利要求之范畴内。
权利要求
1.一种增进具脑组织损伤之患者之神经病学的行为功能的方法，其特征在于，包括 鉴定出患有脑部组织损伤的患者，以及将包含有效量之多能性细胞之组合物投予该患者，其中该多能性细胞通过一种包括在低氧条件下培养该细胞之流程而制备。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该多能性细胞为CD34+细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该多能性细胞为CD34+细胞并且从脐带血获得。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该流程进一步包括在低氧条件下培养该细胞后，评估该细胞中的Epacl浓度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该组合物从脑内投予。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法进一步包括通过非侵入性技术来评估该患者的治疗效果。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养该细胞通过将细胞置放于包含60至600mM去铁胺(Desferrioxamine，DFX)之培养液中达12至48小时而进行。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养该细胞是通过将细胞置放于包含100至450mM去铁胺(Desferrioxamine，DFX)之培养液中达16至36小时而进行。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养该细胞是通过将细胞置放于包含200至350mM去铁胺(Desferrioxamine，DFX)之培养液中达20至24小时而进行。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养该细胞是通过将细胞置放于包含0. 5至3% O2之培养箱中达6至48小时而进行。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养该细胞通过将细胞置放于包含0. 8至1. 5% O2之培养箱中达12至36小时而进行。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养该细胞通过将细胞置放于包含0. 9至1. O2之培养箱中达23至25小时而进行。
13.一种用于增加患者之组织的血管新生的方法，其特征在于，包括将包含有效量之多能性细胞之组合物投予有需要的患者之组织，其中该多能性细胞通过一种包括在低氧条件下培养该细胞之流程而制备。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该患者具脑组织损伤且该组织为该患者之脑部。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养该细胞是通过将细胞置放于包含10至500 μ M COCl2之培养液中达12至48小时而进行。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在低氧条件下培养该细胞是通过将细胞置放于包含100 μ M COCl2之培养液中达12至48小时而进行。
17.—种包括一或多种多能性细胞与低氧试剂的组合物。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述一或多种多能性细胞为CD34+细胞。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述一种或多种多能性细胞从脐带血获得。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，该低氧试剂为去铁胺或C0C12。
全文摘要
本发明揭露一种用于调适干细胞以及使用调适后之干细胞治疗脑组织损伤之方法。
文档编号A61P25/00GK102448474SQ201080022286
公开日2012年5月9日 申请日期2010年5月21日 优先权日2009年5月21日
发明者徐伟成, 李谢秀梅, 李鸿, 林欣荣 申请人:史坦赛特股份有限公司