专利名称：适合临床应用于免疫介导性疾病的、具有增强型抑制功能的调节性t细胞的体外扩增方法
技术领域：
本发明涉及增强调节性T细胞的抑制功能的方法。具体地讲，本发明提供了调节性T细胞的体外扩增方法，所述细胞表现出增强的抑制特性。
背景技术：
众所周知的是，调节性T细胞(或Treg)在通过抑制免疫系统的激活而维持对自身抗原的耐受方面起着关键作用。在罹患炎性/自身免疫疾病(例如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿性关节炎、哮喘、溃疡性结肠炎和克隆氏病)的患者中，表达转录因子 Foxp3的⑶4+⑶25+Treg出现功能缺陷或频率降低。在这些自身免疫疾病中，人体的免疫系统无法将细胞或细胞的一部分识别为自身的，从而导致组织破坏。在对多种动物疾病模型(包括但不限于类风湿关节炎、哮喘和移植物抗宿主病 (“GVHD”))进行治疗的过程中已表明施用⑶4+⑶25+Treg具有治疗效果。在治疗应用中采用Treg却困难重重，因为它们只占人外周血单核细胞非常小的百分比，大约1至2%。因此，开发了体外激活和扩增或增殖Treg的方法，以用于治疗某些疾病。
图1为示出取自实例1群体的⑶4+FoXp3+Treg的频率的曲线图。图2为示出实例2的⑶4+Treg的纯度的曲线图。图3为示出实例3的Treg扩增情况的曲线图。图4为示出实例3中表达了 Foxp3的体外扩增细胞的百分比的曲线图。图5为示出实例4的扩增所得Treg的抑制活性的曲线图。
具体实施例方式本发明提供了⑶4+⑶25+Treg的体外扩增方法、由此方法所得的组合物以及使用此组合物的方法。使用此方法得到的细胞证实与原代Treg细胞相比，其具有增强的抑制活性。本发明提供了制备体外扩增Treg的方法，这些Treg可用于抑制人体对自身抗原或过敏原的有害免疫反应。另外，体外扩增的Treg可供治疗炎性/自身免疫疾病。在一个实施例中，本发明提供了一种方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成以及由以下步骤组成a)从个体获得T细胞群；b)从T细胞群中分离和纯化出 ⑶4+⑶25+Treg亚群；以及c)扩增所述亚群中的Treg细胞，其中与取自个体的新鲜纯化的未扩增Treg群相比，扩增的Treg细胞表现出增强的抑制活性。本发明发现了取自罹患自身免疫/炎性疾病(包括但不限于系统性红斑狼疮(“SLE”)、多发性硬化症(“MS”)、哮喘、类风湿性关节炎(“RA”)、克隆氏病 (“⑶”)和溃疡性结肠炎(“UC”))的患者的Treg在与取自同一患者的新鲜纯化的Treg 相比时，表现出增强的抑制T细胞增殖的抑制活性。本发明还发现了 Treg可体外扩增100至1，000倍同时具有增强的抑制功能。在本发明方法的第一个步骤中，首先获得T细胞群。T细胞可从任何合适的来源获得，包括但不限于个体的外周血、胸腺、淋巴结、脾或骨髓。优选地，T细胞得自人体的外周血。更优选地，T细胞得自罹患自身免疫/炎性疾病的个体，并且最优选地，得自罹患SLE、 MS、哮喘、RA、CD和UC中一种或多种疾病的个体，而不论所述疾病是已缓解还是处于疾病活跃期。最优选地，人CD4+CD25+Treg由全血单位或Ieukpak纯化而得。然后使用任何基于Treg特异性细胞标记物的简便分离技术(包括但不限于以任何简便方法开展的流式细胞术)从T细胞群中分离出CD4+CD25+Treg亚群。例如，多种用于实行此类分离和纯化的试剂盒可商购获得。可商购获得的试剂盒包括但不限于适于 Auotmacs, ClinMACS等的Miltenyi Treg试剂盒。优选地，直到所得群体中Foxp3的阳性率大于40%并且⑶4的阳性率大于90%，才进行分离和纯化。然后使用自身抗原特异性调节性T细胞刺激组合物对Treg亚群进行体外扩增。优选地，该组合物以抗原特异性的方式结合和活化T细胞受体复合物。更优选地，扩增是在存在有效量的第一和第二激活因子及共刺激激活因子的情况下进行的。所谓有效量是指该量能够有效刺激调节性T细胞至所需程度。第一激活因子为TCR/⑶3激活因子，其可为TCR/⑶3的多价抗体或配体，包括但不限于抗原非特异性激活因子(例如抗-CD抗体)和抗原特异性激活因子(例如MHC-肽多聚体，其中肽为自身免疫/炎性疾病相关肽)。优选地，TCR/CD3激活因子为抗-CD3抗体。组合物包含第二激活因子，其为另外合适的调节性T细胞刺激因子。该组分可包括但不限于白介素。优选使用IL-2。IL-2通常以重组形式使用并且用量为约l，000IU/ml。对TCR共刺激因子具有特异性的多价抗体或配体可用作共刺激激活因子。优选地，共刺激激活因子为⑶28。可通过使用一种或多种添加剂增强该激活因子，所述添加剂包括但不限于雷帕霉素、P13激酶抑制剂、抗-IL6等。将TCR/CD3激活因子和TCR共刺激激活因子优选地固定在三维固体表面上，更优选地固定在小珠上。合适的小珠可商购获得，例如细胞扩增仪Dynalbeads (Invitrogen)。 Treg与小珠的比率优选为1 3。最佳的小珠粒度将取决于有效聚集抗体所需的粒度考量，通常粒径为约1至10微米。小珠表面上抗-⑶3和抗-⑶28抗体比率可从约1变化至 20或从约20变化至1。将扩增进行到至少100倍扩增水平，优选地进行到大于1，000倍扩增水平。扩增水平将取决于刺激因素和培养时长。然而，培养时间越长的话，培养物中可能会引入其他变量，因此优选的是这样的培养时间，其允许获得最多的细胞但又不会大量引入其他不利因
ο本发明将通过以下非限制性实例阐明。SM实例1从9名SLE患者、7名RA患者、7名哮喘患者、10名MS患者和7名⑶患者以及11 名未患自身免疫疾病的人中各采集50cc的大约5至10个外周血样。从这些样品的外周血单核细胞(“PBMC”)中分离和纯化出⑶4+Treg。通过采用聚蔗糖-泛影葡胺(Amersham)的密度梯度离心从血样中分离出PBMC。使用人⑶4+⑶25+
4调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)按照制造商说明书通过autoMACS 从PBMC纯化出⑶4+⑶25+Treg。简而言之，首先通过用抗人⑶8、⑶14、⑶16、⑶19、⑶36、 ⑶56、⑶123、TCR γ / δ和⑶235a的单克隆抗体的混合物耗尽非⑶4细胞，对PBMC中的 CD4+T细胞进行阴性分离。然后用抗人CD25抗体偶联的微珠对富集的CD4+细胞群中的人 CD4+CD25+Treg进行阳性分离。使用细胞内Foxp3染色法评估表达Foxp3的CD4+Treg并通过流式细胞术对其进行分析。结果示于下图1中，图中示出了各个人的CD4+细胞库群体中 CD4+Foxp3+Treg 的百分比。实例2从9名SLE患者、7名RA患者、7名哮喘患者、8名MS患者和7名⑶患者以及25 名未患自身免疫疾病的人中各采集50cc的大约5至10个外周血样。从样品的PBMC中纯化出⑶4+Treg。纯化是使用实例1中所述的方法进行的。使用细胞内Foxp3染色法评估O天时纯化的CD4+Treg的纯度，并通过流式细胞术对其进行分析，结果示于图2的曲线图中。大约40至75%的纯化细胞表达了 Foxp3。实例3SLE、RA、哮喘、MS、CD和UC患者中各采集50cc的大约5至10个外周血样。从样品的PBMC中纯化出⑶4+Treg。纯化使用实例1中所述的方法进行。将CD4+Foxp3+Treg 培养于 X-VIVO 15 培养基(Cambrex Bio-ffhitaker, East Rutherford, NJ)中，该培养基补充有10%混合人AB血清(Cambrex)并存在1000IU/M1的人rIL-2 (Proleukin)。此夕卜，以1 3的细胞与小珠比率添加抗-⑶3/抗-⑶28包被的小珠(Dynal，Oslo, Norway)。在37°C的培养箱中培养3周后，扩增的Treg达到超过100至 1，000倍的扩增水平，或达到了 10亿个细胞，如图3中的曲线图所示。图4的曲线图示出， 平均40至50%的体外扩增细胞表达了 Foxp3(通过在第2周时进行细胞内染色得出)。实例 4在2周时按照以下标准化抑制测定法评估实例3的Treg。对于抗-CD3刺激的培养物，将来自同一供体的异源CD4+CD25+人T细胞(5 X IO4细胞/孔)用作应答细胞，将Img/ ml抗-CD3(0KT3)和异源人树突状细胞(得自一个供体，5 X IO3细胞/孔)以及系列稀释的扩增Treg以一式三份的方式加入96孔板中。对于同种异体抗原刺激的培养物，将来自一个供体的⑶4+⑶25+人Treg细胞(5 X IO4细胞/孔)、来自另一个供体的5 X IO3人树突状细胞以及系列稀释的扩增Treg以一式三份的方式接种到96孔板中。体外功能测定的结果(示于图5的曲线图中)证实，体外扩增的人Treg具有抑制 T细胞增殖的有效抑制活性。另外，与从同一人中新鲜纯化的Treg相比，该Treg的抑制活性得到增强。这种抑制活性可用来抑制自身免疫/炎性疾病中有害的人免疫反应并且表现出对自身免疫/炎性疾病的临床治疗潜力。
权利要求
1.一种方法，所述方法包括a)从罹患免疫介导性疾病的个体中获得T细胞群，所述免疫介导性疾病选自系统性红斑狼疮、多发性硬化症、哮喘、类风湿性关节炎、克隆氏病、或溃疡性结肠炎；b)从所述T细胞群中分离和纯化出CD4+CD25+Treg亚群；以及c)扩增所述亚群的所述Treg细胞，其中与取自所述个体的新鲜纯化的未扩增Treg群相比，所述扩增的 Treg细胞表现出增强的抑制活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增水平介于约100至1，000倍之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增进行约3周的时间。
4.一种对罹患免疫介导性疾病的个体进行治疗的方法，所述方法包括a)从罹患免疫介导性疾病的个体中获得T细胞群，所述免疫介导性疾病选自系统性红斑狼疮、多发性硬化症、哮喘、类风湿性关节炎、克隆氏病、或溃疡性结肠炎；b)从所述T细胞群中分离和纯化出⑶4+⑶25+Treg亚群；c)扩增所述亚群的所述Treg细胞；以及d)将所述⑶4+⑶25+调节性T细胞的一部分施用给待治疗所述免疫介导性疾病的人体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫介导性疾病为系统性红斑狼疮。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫介导性疾病为多发性硬化症。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫介导性疾病为哮喘、类风湿性关节炎。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫介导性疾病为类风湿性关节炎。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫介导性疾病为克隆氏病。
10.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫介导性疾病为溃疡性结肠炎。
全文摘要
本发明公开了用于体外扩增CD4+CD25+Treg的方法。本发明还公开了制备体外扩增Treg的方法，这些Treg可用于抑制人体对自身抗原或过敏原的有害免疫反应。另外，体外扩增的Treg可供治疗炎性/自身免疫疾病。
文档编号A61P29/00GK102459577SQ201080022507
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月17日 优先权日2009年5月18日
发明者L·李, T·曹 申请人:特拉科斯有限公司