用于保护人受试者的重组亚单位西尼罗病毒疫苗的制作方法

专利名称：用于保护人受试者的重组亚单位西尼罗病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及疫苗领域。本发明涉及被设计用于保护人免患由西尼罗病毒引起的疾病的疫苗。具体地，所述疫苗包含在昆虫细胞生产系统中生产的西尼罗病毒的重组囊膜(envelope，Ε)糖蛋白的截短形式(version)和基于铝的佐剂。
背景技术：
黄病毒科包括原型黄热病病毒(YFV)，登革热病毒的4种血清型(DENV-1， DENV-2, DENV-3和DENV-4)，日本脑炎病毒(JEV)，蜱传脑炎病毒(TBEV)，西尼罗病毒 (WNV)，圣路易斯脑炎病毒(SLEV)和约70种其他引起疾病的病毒。黄病毒是包含单条正链 RNA基因组的小的、有囊膜的病毒。10种基因产物由单个开放阅读框编码并翻译为以如下顺序组织的多聚蛋白衣壳(C)，“膜前体”(preMembrane，prM，其在病毒粒子从细胞释放前才被加工成“膜”(M))，“囊膜” (E)，接着是非结构(NS)蛋白NSU NS2a、NS2b、NS3、NS4a、 NS4b 和 NS5 (在 Chambers, Τ. J. ^A , Annual Rev Microbiol (1990) 44:649-688; Henchal, Ε. Α.禾口 Putnak, J. R. , Clin Microbiol Rev. (1990) 3:376-396 中综述)。 然后通过由宿主以及病毒编码的蛋白酶介导的精确的加工事件产生各个黄病毒蛋白。黄病毒的囊膜来源于宿主细胞膜并包含病毒编码的膜锚定的膜(M)和囊膜 (E)糖蛋白。E糖蛋白是最大的病毒结构蛋白并包含负责细胞表面附着和内体内融合 (intra-endosomal fusion)活性的功能结构域。其也是宿主免疫系统的主要靶，诱发病毒中和抗体的产生，这与保护性免疫相关。西尼罗病毒已成为在美国新出现的传染病。此病毒感染鸟，鸟充当病毒的天然储存库，此外还感染人和马，人和马是偶见宿主(incidental host)。其是虫媒传播病毒，由包括库蚊属(XMex)的多种属的超过42种蚊子传播。首个文件记录的WNV病例在1937年乌干达的西尼罗河区域发现(Smithburn 等人，Am J Trop Med Hyg (1940) 20:471-492)。 从那以后其传播至中东、大洋洲、欧洲和亚洲的部分，并且最近在美洲出现。自1999年在纽约市记录到首个在美国的人感染的病例之后，病毒迅速传播，遍及美国东海岸并已穿过大陆向西传播。现在已经在所有48个大陆州的鸟群体中发现此病毒。WN疾病的人病例已在50个州的47个中有文件记录，仅在阿拉斯加、夏威夷和缅因州未报导有人病例2008，57(26) :720-23) 大部分感染WNV的个体经历类似流感的症状。然而，大量感染个体会出现严重的疾病，其具有3-15%的病死率并在老年人中病死率最高。另外，其在高百分比的非致死病例中导致永久性的神经障碍。在2003年，在9，862位有症状的感染个体中，2，866位( %)具有神经侵入性疾病(被定义为西尼罗脑膜炎、脑炎和脊髓炎)且264位死于此疾病。在2004 年，神经侵入性并发症升高至36%_汉，vol. 53 Nov. 19，2004)。最近的研究显示，从病毒感染中恢复需要比原先想象的显著更多的时间。一项研究已推断出中值恢复时间为60 天(Comment, J/w Tflier. Med. (2004), 141 153)，而另一项研究记录了仅 37% 的患者在 1 年后完全恢复(Klee等人，Emerg. Inf. Dis. (2004) 10:1405-1411)。病毒导致的神经损伤治愈较慢，且有时损伤是永久的。近年来，一些个体已遭受类似脊髓灰质炎的急性弛缓性麻痹症状。在老年患者中临床表现显著更差。在最近以色列爆发的WNV感染的研究中，在 233位住院患者的研究组中，总体的病死率为14%。然而，在70岁或更老的患者中，病死率 *^%(Chowers 等人，Emerg. Inf. Dis. (2001) 7:675-78)。在最近罗马尼亚(Tsai 等人，Lancet (1998) ；352:767-771)和俄罗斯(Platonov 等人，Emerg. Inf. Dis. (2001) 7:128-32)的流行中也报导了类似的发现。因此，特别在老年/免疫衰老、免疫受损和免疫抑制的群体中，具有显著的与WN疾病相关的发病率和死亡率。WNV囊膜蛋白与其他黄病毒特别是日本脑炎(JE)血清复合型(serocomplex) JEV、圣路易斯脑炎(SLEV)和墨莱溪谷脑炎(MVEV)病毒的囊膜蛋白共有显著的同源性。针对包含在囊膜蛋白中的特定表位的抗体能够中和病毒，即抑制病毒在体外感染易感细胞。 已将中和抗体表位定位至黄病毒(包括WNV)的E糖蛋白的所有3个结构域(Diamond等人， Immunol. Rev. (2008) 225:212-25)。通常公认高滴度的病毒中和抗体是体内保护免于黄病毒感染和其导致的疾病的最佳体外相关指标(correlate) (Markoff Vaccine (2000) 18:26-32; Ben-Nathan 等人，J. Inf. Diseases ( 2003) 188:5-12; Kreil 等人，J. Virol. (1998) 72:3076-3081; Beasley 等人，Vaccine (2004) 22:3722-26)。因此，诱发高滴度WNV中和抗体应答的疫苗将类似地保护疫苗接种者免于由WNV引起的疾病。迄今为止，黄病毒疫苗的开发已取得了多个成功(mixed success)。为了产生保护免于由黄病毒引起的疾病的候选疫苗，已实施了 4种基本方法。这4种方法是活减毒病毒、 失活的全病毒、重组亚单位蛋白质和DNA。为YFV开发的活减毒病毒疫苗已存在了数十年， 并证明了此方法的有效性。失活的全病毒疫苗的应用已被证明用于TBEV和JEV，具有基于此方法的用于这2种疾病靶标的注册产品。如上所述，开发用于YFV、JEV和TBEV的疫苗已经取得成功。然而，使用活减毒病毒和失活病毒法开发其他黄病毒的疫苗遇到了很大的挑战。例如，已在开发候选的活减毒登革热疫苗株中花费了大量精力；然而，许多检测的疫苗株已证实不令人满意的(见，例如，Eckels, K. H. ^A , Am. J. Trop. Med. Hyg. (1984) 33:684—689; Bancroft, W. H. ^A, Vaccine (1984) 149:1005-1010; McKee, K. Τ. , ^A, Am. J. Trop. Med. Hyg. (1987) 36:435-442)。尽管这些最初不令人满意的结果，仍在继续努力开发和检测登革热活减毒候选疫苗株(在J . J. Trop. Med. Hyg. (2003) 69:1-60中综述)。在使用传统活减毒法开发WNV疫苗中没有投入太多精力。为了开发黄病毒疫苗，作为传统活减毒法的可选方案，已经使用了重组嵌合法。此方法使用已知的活减毒黄病毒株作为基础并用来自相关目的病毒的合适基因(对于黄病毒为prM和E)取代基础病毒的等同基因。已用于WNV和DENV疫苗开发的一种方法是使用基于减毒的DENV-4株的intertypic嵌合体(Bray, Μ.等人’ J. Virol. (1996) 70:4162-4166; Chen, W. , ^A, J. Virol. (1995) 69:5186-5190; Bray, M.和 Lai, C. -J. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:10342-10346; Lai, C. J. ^A, Clin. Diagn. Virol. (1998) 10:173-179)。另一种方法是使用YFV 17D减毒株作为基础来开发 JEV、DENV 和 WNV 的重组嵌合疫苗(Lai, C.J.和 Monath Τ. P. Adv Virus Res (2003) 61:469-509; Monath 等人.Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:6694)。尽管使用活减毒嵌合法相比传统活减毒法有优势，但是嵌合法仍受到开发合适的减毒株所面临的困难的困扰，以及在DENV疫苗的情况下，获得针对4种登革热病毒的平衡的四价应答所面临的困难的困扰。此外，活减毒法可能不适用于靶向脑炎疾病的疫苗(由于提高的风险因素) 或具有受损的免疫系统的目的群体。这两种因素都适用于WNV疫苗开发。目前存在使用全失活病毒法生产的用于JE和TBE的可商业获得的疫苗。如同活减毒病毒法，失活病毒法在某些黄病毒中的应用不能保证在其他黄病毒中成功。例如，开发失活的DENV或WNV疫苗的努力遇到了一定困难(limited success).此方法受限于从细胞培养系统中得到足够的病毒产量的能力。从昆虫细胞例如C6/36细胞中得到的病毒产量一般在IO4至IO5 pfu/ml的范围，远低于产生低成本的失活病毒疫苗所需的水平。从哺乳动物细胞(包括LLC-MK2和Vero细胞)中得到的产量较高，但从单一的Vero细胞系得到的约 IO6 pfu/ml的最高产量仍低于获得低成本疫苗产品所需的水平。为了开发用于DENV、JEV、TBEV和WNV的非复制型黄病毒疫苗，还已评估了裸DNA 法的应用(在 Putnak, R.等人 000；3) Α/κ Virus Res. 61 445-68 中综述)。DNA 法提供易于生产、使用确定的序列、由于体内病毒抗原的表达引发体液和细胞免疫二者的潜力的优点。尽管具有这些优点，在人中诱发持续和强烈的免疫应答，特别是抗体应答的能力始终是此方法的主要障碍。另外，DNA疫苗面临额外的法规审查，因为担忧质粒序列整合进宿主基因组和产生针对双链DNA的自身抗体的潜能。迄今为止没有批准任何人用DNA疫苗， 且不清楚此方法何时可被认为适用于预防性的人疫苗。用于黄病毒疫苗开发的重组亚单位蛋白质的使用是非复制型病毒方法的另一个实例。此方法提供产生非常确定的产品和引发特异性免疫应答的潜能的优点。尽管存在产生有关的和强烈的免疫应答的潜能，也存在与使用重组亚单位蛋白质疫苗相关的挑战。这是因为在引发期望的免疫应答中蛋白质的质量(类似天然的结构)和对佐剂的需要二者。重组亚单位蛋白质疫苗具有历史悠久的安全性和保护效力，最有效的证据是重组亚单位乙肝疫苗(例如Engerix B 和Recombivax HB )，和最近的人乳头瘤病毒疫苗(例如Gardasif和 Cervarixe)0在生产中的任意时间不存在复制性病毒的事实有助于保证在预防背景下对健康或免疫受损个体施用亚单位疫苗相关的极其有限的风险。此外，已显示乙肝和人乳头瘤病毒疫苗是高度免疫原性和有效的。重组黄病毒蛋白质的表达已集中在结构蛋白C、prM和E以及非结构蛋白NSl上。 E蛋白是大多数研究的对象，因为此蛋白质暴露在病毒的表面，涉及病毒生命周期的重要生物学方面(例如结合受体和介导融合)，并且在受感染的宿主中是中和抗体的靶(Chambers， 如上;Mason, P. W., J. Gen Virol (1989) 70:2037-2048)。此外，针对纯化的黄病毒
5E蛋白的单克隆抗体在体外是中和性的并且已显示有些在体内赋予被动保护(Henchal， Ε. A. ^A , Am. J. Trop. Med. Hyg. (1985) 34:162-169; Heinz, F. X. ^A , Virology (1983) 130:485-501; Kimura-Kiroda, J.和Yasui, K. , J. Immunol. (1988) 141:3606-3610; Trirawatanapong, T. ^A, Gene (1992) 116:139—150; Morrey, J. D. 等人，J. Inf. Dis (2006) 194:1300-8)。已利用了多种表达系统例如大肠杆菌cWi)、酵母和杆状病毒产生重组黄病毒蛋白质用于疫苗使用。这些尝试受到低产量、黄病毒蛋白质的不正确加工和中等至较差的免疫原性的困扰(Eckels, KHiPPutnak, R, Adv. Virus Res. (2003) 61:395-418)。 在Hawaii Biotech，Inc. (HBI)进行的表达重组E亚单位蛋白的工作已确定需要维持E 蛋白的类似天然结构以使重组蛋白作为有效的免疫原。产生具有天然类似结构的重组E蛋白的能力高度依赖于使用的表达系统。美国专利6，165，477公开了在酵母细胞中表达DENV E蛋白质亚单位的方法。在酵母细胞中表达的E亚单位证明了相比细菌系统的改进的结构， 但仍然面临有关过度糖基化、产量和产物一致性的问题。在最近的研究中，已经确定使用稳定转化的昆虫细胞表达E蛋白的截短形式得到维持类似天然结构的一致产物，如通过X光结晶学所测定的(Modis，Y.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100:6986-91; Modis, Y.等人，Nature (2004) 427 :313-19;禾口 Zhang, Y.等人，Structure (2004) 12 1607-18)。使用稳定转化的昆虫细胞系统已得到来自DENV-I、-2、-3、-4、JEV、TBEV和WNV的截短的重组E亚单位蛋白的成功表达。美国专利6，136, 561公开了在稳定转化的昆虫细胞中表达DENV、JEV、TBEV和YFV 的重组E亚单位蛋白的方法。美国专利6，432，411公开了当与包含皂素的类似ISCOM结构组合时，在稳定转化的昆虫细胞中表达的黄病毒E重组亚单位蛋白作为候选疫苗的效用。 最近报导了由稳定转化的昆虫细胞系产生的截短的重组WNV囊膜亚单位蛋白(WN-80E)和非结构蛋白 1 (WN-NSl)的临床前评估(Lieberman 等人，Vaccine (2008) 25:414-423; Watts 等人，Vaccine (2007) 25:2913-2918; Siirin 等人，Am. J. Trop. Med. Hyg. (2008) 79:955-962)。在这些报导中，在小鼠和仓鼠模型中评估了用包含皂素的佐剂配制的E和NSl组合，以评估保护效力。这些专利和出版物证明，当与包含皂素的佐剂组合时，由稳定转化的昆虫细胞表达的黄病毒重组亚单位蛋白在动物模型中产生适当的抗体应答的效用。美国专利6，432，411以及Lieberman等人2007 (见上)和Watts等人2007 (见上)也证明了在疫苗制剂中包含重组NSl在动物模型中的益处。然而，这些专利和出版物没有提出或预测仅基于E的已证明适于人用的疫苗制剂。大体上，使用非复制型病毒疫苗法例如失活病毒、重组亚单位蛋白和DNA相比活减毒病毒疫苗法具有若干优点。这些优点基本上涉及安全性，因为没有对受试者递送活病毒，并且优点涉及通过调整剂量调节和平衡免疫应答的能力。在开发用于人的黄病毒疫苗中，基于在动物模型中的临床前数据难以预测候选疫苗在人受试者中的安全性和免疫原性。已证明许多已进入人临床试验的活减毒病毒候选疫苗面临挑战。最令人瞩目的完全失败的实例是克隆的登革热病毒3型分离株展示的安全特性，其在非人灵长类中展示了非常吸引人的安全特性，但其在香港的疫苗接受者中引发登革热(Sanchez 等人，FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2006) 24:4914-26)。通过使用非复制型病毒疫苗可减少此挑战，其不需要与复制型病毒疫苗相同水平的病毒/宿主相互作用以获得疫苗效力。然而，存在大量在临床前模型中显示了良好的安全性和保护效力，而在人中不能作为安全和有效的疫苗起作用的非复制型病毒候选疫苗的实例(例如，灭活的 RSV 疫苗；Murphy 等人，乂 Clin. Microbiol. (1986) 24: 197-202)。因此，可能存在与开发用于黄病毒的安全和有效的疫苗相关的多重挑战且开发经常需要数年的试验和错误。此夕卜，基于动物模型的临床前研究可能不能预测疫苗在人受试者中的表现；和因此，人数据对证明候选疫苗的效用是关键的。尽管在临床前研究和开发中的多个阶段中有若干研究中的WNV疫苗，但据以前的报导仅有3种候选疫苗进入人临床试验。已在临床研究中检测的3种疫苗是(1)活的、 减毒的登革热血清型4-西尼罗嵌合体(Pletnev等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3036-41) ； (2)活的、减毒的黄热-西尼罗嵌合体(Chimerivax； Monath等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103:6694)；和(3)编码 prM 和 E 基因的“裸”DNA 疫苗(Martin 等人，J. Infect. Dis. (2007) 196:1732-40)。3 种候选疫苗中的每一种都具有相关的内在困难和潜在的缺点。临床检测的前两种疫苗都是活减毒疫苗。对所有提供给健康受试者的活病毒疫苗来说最重要的就是安全性方面的担忧。病毒减毒不足可导致病毒相关的副作用，而减毒过度可削弱疫苗的效力。此外，可能发生回复为野生型或突变为提高的毒性(或降低的效力)。此外，即使适当地减毒，活病毒疫苗对特定患者群体，例如免疫缺陷或免疫抑制患者， 以及正常群体的特定部分，例如怀孕妇女或老年个体是禁忌的。Chimerivax技术特别令人担忧的是YF 17D疫苗(其充当嵌合体的骨架)在老年和免疫受损个体中的安全特征。自20 世纪90年代末以来，已记录了大量致命的、传播的、亲内脏的和亲神经的疫苗病毒感染的病例，特别是在老年和免疫受损个体中。这已导致反对在这些群体中使用YF 17D疫苗的建议，除非YF病毒感染风险非常高之外(Barrett, ADT和iTeuwen, DE (2009) Curr. Opin. Immunol. 21:308-1 。根据WNV感染在老年受试者中的发病率和死亡率之间的重要联系，从安全性观点来看对此目的疾病应用活减毒疫苗法是非常有问题的，因此前两种候选疫苗没有为西尼罗疫苗的需求提供安全的解决方案。在临床试验中已检测的第三种西尼罗疫苗是DNA疫苗。目前裸DNA疫苗未证实用于任何感染性疾病，且由于诱发针对DNA的自身免疫应答而引起的潜在免疫病理学问题长期未得到解决。最近报导了 WNV DNA疫苗临床试验的结果(Martin等人，J Infect Dis (2007) 196:1732)。引发了低水平的中和抗体；然而，显然已放弃了此DNA疫苗的临床开发，可能与安全性挑战有联系。因此，DNA疫苗没有为开发人用的WNV疫苗提供安全和有效的解决方案。如上所述，已进行了努力以产生既安全又具有充分免疫原性的保护人免患由WNV 感染引起的疾病的疫苗。尽管进行了这些努力，仍未研制出完全满足这些条件的人用WNV 疫苗。因此，本发明待解决的技术问题是发现满足2种主要条件的WNV疫苗；(1)在接种的个体(人受试者)中诱发相关保护性免疫应答，和(2)根据包括老年和免疫受损个体的主要高危群体，在人受试者中维持优越的安全特性的能力。这代表了在WNV疫苗开发中的重大挑战，且迄今为止没有一种疫苗方法已显示了充分解决此技术问题的所有方面。随着西尼罗病毒感染传播的流行，对解决方案存在尚未满足且日益增长的需求。发明_既述本发明提供了唯一的人疫苗用于保护免患与WNV感染有关的疾病。所述疫苗通过组合 WNV囊膜蛋白衍生的重组亚单位蛋白和氢氧化铝佐剂形成。所述疫苗能够诱发相关保护性免疫应答，并在接种的人志愿者中已证明可接受的安全特性。这种唯一的疫苗制剂依赖于新的、适当折叠的重组囊膜亚单位蛋白(“西尼罗80E”或“WN-80E”)和基于铝的佐剂的组合，以产生疫苗制剂HBV-002。这种疫苗(1)在健康的人志愿者中诱发了相关的保护性免疫应答，例如病毒中和抗体，和(2)维持对健康和免疫受损个体施用的可接受的安全特性。本发明的其他方面包括在可接受的载体中使用治疗有效量的疫苗用作针对由WNV 感染引起的疾病的免疫预防药，和在可接受的载体中使用治疗有效量的疫苗作为药物组合物。


图1. WN-80E重组亚单位蛋白的氨基酸序列。氨基酸编号从蛋白质的氨基端开始指示。图2.纯化的西尼罗80E的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶(A)和蛋白质印迹(B)。 所有样品在10%的凝胶上在非还原条件下电泳。使用针对西尼罗病毒产生的兔多克隆抗血清显色蛋白质印迹。在凝胶和印迹的左侧指示分子量标记的大小(以kD为单位)。在每个泳道顶端指示样品上样量(以yg为单位)。图3.在用西尼罗HBV-002疫苗制剂接种的人志愿者中诱发的病毒中和抗体应答。发明详述
本文描述的发明提供了用于人的保护免于由西尼罗病毒感染导致的疾病的疫苗。所述疫苗包含WNV重组亚单位囊膜糖蛋白(WN-80E)和铝佐剂。将所述人用疫苗制剂称为 HBV-002。HBV-002在人志愿者中有效诱发强烈的病毒中和抗体应答。此外，HBV-002具有对于健康和高危(at-risk)人受试者的可接受的安全特性。西尼罗病毒囊膜蛋白亚单位(WN-80E)
本发明的WNV疫苗使用WN-80E重组亚单位蛋白，所述蛋白通过基于果蝇khneider 2 (S2)细胞的细胞培养表达系统产生。使用此系统得到维持类似天然结构的重组囊膜亚单位蛋白。WNV重组囊膜蛋白在C末端截短，剩下80%的天然囊膜蛋白(“80E”)。因此WN-80E 被定义为从首个N-端氨基酸开始E的约前80%的连续氨基酸。C-端截短被设计为缺失WN E蛋白的膜锚定部分(约50个氨基酸或10%的全长E蛋白的羧基端末端)，换句话说，从其 N-端的第一位氨基酸开始的WN E蛋白的最多前90%的连续氨基酸，因此允许其被分泌至细胞外培养基且便于回收。可克隆和分泌超过90%，但少于100%的E蛋白，即蛋白质可为90%+ 的长度，羧基端截短的，并可包括部分跨膜结构域，只要截短的E蛋白可分泌。“可分泌”指能够被分泌，和通常从表达系统的转化细胞中被分泌。80E截短蛋白进一步缺失了连接E的胞外结构域和膜锚定部分的WN E蛋白的“茎”部分。茎部分不包含重要的抗原表位和因此未被包含。包含在WNV疫苗中的优选抗原是WN-80E。在果蝇S2表达系统中表达的WN-80E重组亚单位蛋白被分泌至培养基中，被适当地糖基化，并维持类似天然的构象(通过与构象敏感的单克隆抗体4G2的反应性测定)。如在本发明中证明的，人用重组WN-80E亚单位蛋白的合适制剂导致在人受试者中诱发有效的病毒中和抗体的能力。因此，本发明的WNV疫苗制剂为关键的技术问题——产生证明在人受试者中具有高水平的安全性和免疫原性的西尼罗疫苗——提供了新的解决方案。本发明的优选疫苗制剂包含适于人用的佐剂。优选的佐剂是基于铝的佐剂(例如， Alhydrogel )。具有铝的制剂包含掺合剂，由此允许WN-80E抗原结合Alhydrogel，从而使 ^ 75%的抗原结合氢氧化铝。在优选的实施方案中，WN-80E包含WNV，NY99株的第1_401位氨基酸。图1提供了 WN-80E的氨基酸序列。从包含编码WNV prM蛋白和80E蛋白的合适的DNA片段的载体中优选地产生WN-80E蛋白。编码的prM段在宿主细胞中被细胞酶加工从而以类似在天然 WNV成熟过程中发生的方式释放成熟的WN-80E蛋白(图1)。图2中显示了由S2细胞表达的纯化的WN-80E产物。在本发明的另一个实施方案中，WN-80E被更广泛地定义为在Cysl-Cys2、 Cys3_Cys8、Cys4_Cys6、Cys5_Cys7、Cys9_CyslO 和 Cysll_Cysl2 处包含 6 个二硫键的西尼罗病毒囊膜蛋白亚单位；其中所述多肽作为重组蛋白从果蝇细胞中分泌；且其中所述多肽当施用于人受试者时引起针对西尼罗病毒的中和抗体应答。在更优选的实施方案中，重组WNV囊膜蛋白亚单位还包含所述二硫键模式和亲水性特征，其特征在于从天然WNV囊膜蛋白的N端的首个氨基酸开始与囊膜蛋白的80%同源的部分(80E)。换句话说，在包含WN-80E的序列中的氨基酸可被取代，只要维持二硫键和亲水性特征以确保重组亚单位蛋白保留类似天然的结构和合适的免疫原性(引发病毒中和抗体的能力)。优选地，使用主细胞库(Master Cell Bank)在无血清培养基中表达WN-80E重组亚单位蛋白并使用以前描述的单克隆抗体(例如，4G2) (Ivy #U ,美国专利号6，432，411)， 通过免疫亲和层析(IAC)纯化。这样得到可在适于人用的疫苗制剂中使用的WN-80E产物。令人惊讶地，且与在其他黄病毒制剂中包含非结构蛋白例如非结构蛋白1 (NSl) 的描述的额外益处形成对比(McDonell等人，US 6，416，763)，本发明的仅包含WN-80E 蛋白的疫苗制剂在非人灵长类(Lieberman等人，Clin. Vaccine Immunol. (2009) 16:1332-37)和人受试者中可作为有效的免疫原性疫苗，甚至在不包含NSl的情况下。图3 中显示了在用包含WN-80E蛋白和基于铝的佐剂的HBV-002疫苗制剂接种的人志愿者中诱发的病毒中和抗体应答。钽
在优选的实施方案中，本发明的WNV疫苗包含与基于铝的佐剂(统称“铝”或“基于铝的佐剂”)例如氢氧化铝、磷酸铝或其混合物一起配制的WN-80E重组亚单位蛋白。氢氧化铝 (可以“Alhydrogel ”商业地获得)用于制备临床材料并因此是优选的铝形式。基于铝的佐剂是在美国和全世界首个注册的人用佐剂，且其有效性是被广泛公认的。认为基于铝的佐剂至少部分通过储存机制起作用，且具有类似天然结构的重组WN-80E抗原和铝的佐剂作用的组合足以在接种的个体(包括免疫缺陷群体成员)中诱发有效的免疫应答。具有铝的制剂包含掺合剂，由此允许WN 80E抗原结合Alhydrogel 从而使> 75%的抗原结合氢氧化
ο优选地，在动态药品生产管理规范(cGMP)下实施WN_80E+Alhydrogel的WNV疫苗
9制剂和用优选的疫苗制剂(HBV-002)填充小瓶的生产。这样得到适于人用的包含WN-80E和铝的WNV疫苗制剂。施用和用涂
本发明提供了预防或减弱由WNV感染引起的疾病的手段。如本文中使用的，如果对个体施用疫苗导致个体对疾病的完全或部分免疫性，或与疾病相关的症状或病症的完全或部分减弱(即，抑制)，则称疫苗预防或减弱疾病。如果接受的患者可耐受组合物的施用，则称组合物为“药理学可接受的”。如果施用的量是生理学显著的，则称以“治疗有效量”施用这样的药剂。如果药剂的存在导致接受的患者的生理学中可检测的变化，则其是生理学显著的。在本发明中在接受的患者中可检测的变化是诱发针对WNV的中和抗体。本发明的活性疫苗可单独使用，或与其他活性疫苗(例如包含使其有效量的其他活性亚单位的疫苗)组合使用。在特定制剂中可包含一种或几种病毒或血清型的对应的或不同的亚单位。本发明的活性疫苗可还包含药学上可接受的赋形剂。所述发明的治疗组合物可通过皮下、肌肉内或皮内注射非肠道地施用；然而，也可应用其他全身性施用模式。用于本发明的优选施用方法是肌肉内途径。当使用多次施用方案时，存在许多不同的技术用于免疫的时间选择。优选地使用本发明的组合物多于1次以提高被免疫的受试者表达的免疫球蛋白库的表达水平和多样性。通常，如果给予多次免疫，将间隔1至2个月给予免疫。本发明的优选免疫时间表是在 0、1和2个月时免疫受试者。也可使用其他免疫时间表。例如，可使用例如0、1和3个月， 或0、1和6个月，或0、1、12个月的可选的免疫时间表。可在规定的时间间隔例如每5至10 年施用额外的加强免疫。为了免疫受试者以抵抗例如WNV引起的疾病，使用通常包括多次施用疫苗的常规的免疫方案对受试者施用包含重组亚单位蛋白和佐剂的疫苗制剂。施用通常通过注射，通常为肌肉内或皮下注射进行；然而，也可应用其他全身性施用模式。根据所述发明，治疗组合物的“有效量”是足以获得预期的生物学效果的量。大体上，提供组合物有效量所需的剂量将取决于下述因素而变化，例如受试者的年龄、病症、性别和疾病程度(如果有的话)，以及本领域普通技术人员可调整的其他变量。本发明的抗原性制备物可以有效量的单个或多个剂量施用。本发明的组合物的有效量可在0. Ol-IOOyg/ 剂量，更优选从5-50 μ g/剂量，和最优选15-50 μ g/剂量中变化。本发明的组合物可还包含药学上可接受的赋形剂。
实施例以下给出的实施例提供了本发明的基础。实施例证明了能够大规模地且在cGMP 下制备重组WN-80E蛋白和HBV-002疫苗制剂，以支持对人受试者施用(实施例1_3)。实施例还证明了疫苗在健康的成年志愿者中的安全性和免疫原性(效力)(实施例4)。HBI WNV 疫苗的安全性和效力取决于2个不同方面的新型组合。一方面，重组亚单位蛋白与基于铝的佐剂的组合的内在安全性为最严重的疾病提供了预防靶向老年和免疫受损个体——特别虚弱的高危群体的疾病的最佳方法。第二方面，在cGMP下，以足够实际应用的量生产构象相关(类似天然结构)的重组WN-80E抗原得到在人受试者中诱发病毒中和抗体的疫苗，提供了保护免于疾病的机制。这两方面的独特组合导致在人受试者中安全和有效的WNV疫苗的新发明。这些疫苗制剂的进一步特征在于以下意料之外的发现，即对于有效的免疫原性和保护不需要包含非结构蛋白NS1。此外，公开的西尼罗疫苗独特地处于这样的位置，即解决了在接种的个体中诱发相关保护性免疫应答同时维持可接受的安全特性的技术问题，特别是针对那些处于患严重疾病的极高风险下的受试者，老年和免疫受损个体。以下实施例旨在说明而非限制本发明。实施例1
^MM S2系统中表汰和钝化西原罗80E蛋白
表达质粒pMttbns (来源于pMttPA)包含以下元件黑腹果mXDrosophila 识ster)金属硫蛋白启动子，人组织纤溶酶原激活物分泌前导序列(tPAL)和SV40早期多聚腺苷酸化信号。在Hawaii Biotech，从pMttbns载体上切除14个碱基对的片段以得到包含唯一的损ol位点以及现有的唯一的/^_/11位点的pMttA)(h0。此表达载体促进表达的蛋白质分泌至培养基。使用这些唯一的^^711和损ol位点将西尼罗序列引入PMttAB10载体。为表达羧基端截短的西尼罗囊膜蛋白，合成了编码西尼罗病毒的整个PrM蛋白和E蛋白的第1-401位氨基酸的合成基因(Midland Certified Reagent Co.， Midland, TX)。合成基因的核苷酸序列符合1999年在纽约市分离的西尼罗病毒的已公布的序列。在E蛋白第401位氨基酸的E蛋白C-端截短去除了跨膜结构域，并因此可分泌至培养基。将最终的prM80E质粒构建体称为pMttWNprM80E。在S2细胞中表达后，prM序列由宿主细胞蛋白酶从80E序列上切除。401个氨基酸的WN-80E重组亚单位蛋白被分泌至培养基。图1中提供了 WN-80E蛋白的氨基酸序列。使用(i)磷酸钙共沉淀法或(ii)Cellfectin (Invitrogen Kits, Carlsbad, CA)，根据制造商的建议，用pMttWNprM80E表达质粒和编码潮霉素抗性的pCoHygro选择质粒共转化S2细胞。用20 1的表达质粒与选择质粒的比例，用20 μ g总DNA共转化细胞。 用 300 μ g/ml 的潮霉素 B(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)选择转化体。在选择后，使细胞适应在无血清培养基Excel 420 (JRH, Lenexa, KS)中生长。为了研究表达，在Excel 420,300 μ g/ml潮霉素中培养细胞，并用200 PMCuSO4诱导。以2 X IO6个细胞/ml的密度接种细胞并允许生长6-7天。在最佳条件下，在6-7天的生长后得到大于2 X IO7个细胞/ml的细胞密度。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹检查培养物上清中的表达蛋白。为了在蛋白质印迹上检测WN-80E，使用兔多克隆抗西尼罗病毒抗体(BioReliance Corp. , Rockville, MD)或与西尼罗病毒E蛋白交叉反应的兔多克隆抗-DEN纯化失活病毒，接着使用抗-兔IgG-碱性磷酸酶缀合的第二抗体。使用NBT/BCIP (Sigma Chem. Co.) 固相碱性磷酸酶底物显色印迹。使用单克隆抗体(MAb)4G2，通过免疫亲和层析(IAC)实现WN-80E蛋白的纯化。简单地说，程序涉及表达后的培养基的澄清。然后将原材料上样至IAC柱，其包含通过N-羟基琥珀酰亚胺化学法共价连接的固定化的MAb。在样品上样后，用包含0.05% (ν/ν)吐温-20的10 mM磷酸缓冲液(PBS)，pH7. 2 (PBST, 140 mM NaCl)清洗基质。用20 mM甘氨酸缓冲液，PH 2. 5从IAC柱上洗脱结合的蛋白质。中和洗脱液然后将缓冲液替换为PBS。 通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使用考马斯或银染、蛋白质印迹、紫外光吸收和夹心ELISA常规地分析纯化产物，以分别测定纯度、身份(identity)、量和生物活性。另外，通过N-端氨基酸测序和氨基酸分析来分析样品。这些分析提供了纯化产物的身份和量的验证。图2中显示了纯化的WN-80E蛋白的代表性SDS-PAGE和蛋白质印迹谱。为了分析，在非还原条件下电泳样品。WN-80E分子以单个条带迁移并具有与从氨基酸组成测定的一致的相对分子量(即43kD)。实施例2
在cGMP下牛产WN-80E以支持临床测试
在cGMP条件下从用pMttprMWN80E质粒转化的S2细胞中制备主细胞库(MCB)。cGMP制造方法包括将S2 MCB细胞系扩增至搅拌槽生物反应器和然后收获包含分泌的蛋白质的培养基。使用深层滤器通过过滤将细胞从培养基中分离。然后通过使用4G2单克隆抗体的免疫亲和层析从得到的澄清上清中纯化WN 80Eo免疫亲和纯化产物然后经历低pH病毒失活步骤和病毒过滤步骤，使用具有能够去除20nm颗粒的孔径的PVDF膜来进行。WN-80E蛋白的最终处理包括缓冲液替换和通过超滤浓缩，然后是最终的通过0.2 Mm滤器的过滤。如下所述实现在cGMP下制备WN-80E的代表性批次。解冻MCB小瓶并在10 mL体积的EX-CELL培养基中于^TC下培养5天。将每份培养物扩增至一次性摇瓶。使培养物培养至得到1.5 X 107/mL的细胞密度。合并培养瓶并用于在一次性摇瓶中接种更多的培养物，然后将其培养至得到2 X IO7个细胞/mL的密度。然后在一次性摇瓶中将培养物扩增为多份培养物。将这些培养物培养至得到1. 6 X IO7个细胞/mL的平均细胞密度。合并培养瓶中的细胞并用于接种20L的不锈钢生物反应器。将培养物培养至得到1.2 X IO7个细胞/mL的细胞密度。将合适量的细胞从20L生物反应器转移至100L不锈钢生物反应器以得到2 X IO6个细胞/mL的初始细胞密度。将培养物培养至得到>4. 0 X IO6个细胞/mL 的细胞密度。然后通过加入硫酸铜至培养物以得到0.2 mM的终浓度，诱导培养物。然后将培养物培养5天。使用0.45 μ m滤芯(filter cartridge)，接着使用0. 2 μ m滤芯，通过深层过滤收获100L的培养物。在单个使用袋中以10 L体积收集滤过液并贮存于-20°C。解冻WN-80E整批收获物(bulk harvest)并通过使材料通过5 μ m孔径的滤器去除颗粒。将滤过的整批收获物直接上样至4G2-琼脂糖凝胶柱。上样后，用包含0.05%吐温-20的11 mM PBS, pH 7. 1 (PBST)洗涤柱，然后通过用甘氨酸缓冲液降低pH洗脱保留的 WN-SOE0合并亚批次，然后通过降低pH至3. 8的终pH并在室温(15_25°C )孵育材料16-24 小时进行病毒失活，然后将PH调节至7.0 士 0.5。使材料通过0.2 μ m的预滤器以去除小颗粒，然后使用20 nm孔径的膜过滤。然后通过超滤浓缩材料和替换缓冲液，并通过0.2 μ m滤器直接滤入无菌袋完成最终的无菌过滤。在释放用于配置成HBV-002疫苗前，对纯化的WN-80E生物物质进行大量的安全性、身份、强度和纯度的评估。实施例3
配制HBV-002疫苗用于临床研究
解冻在实施例2中描述的纯化的WN-80E生物物质并转移至Class 100层流流动区。 将WN-80E加入无菌容器并加入无菌Dulbecco，s磷酸缓冲液(DPBS)以得到0. 20 mg/mL的最终蛋白质目的浓度。无菌过滤稀释的WN-80E。加入一定体积的Alhydrogel ‘85至含有 DPBS的无菌容器至14. 0 mg/mL的最终Alhydrogel浓度。然后将WN-80E蛋白溶液定量转移至Alhydrogel悬浮液并在2_8°C下过夜温和混合。在过夜吸收以后，测定未被吸收的WN-80E蛋白的量。最低75%的吸收是前进至 HBV-002疫苗的填充所必需的。在准备好的无菌小瓶中分装HBV-002疫苗。用塞子塞住填充的小瓶，封口并压褶。将填充的HBV-002疫苗小瓶贮存于2-8°C。在临床研究中使用 HBV-002疫苗之前，进行了大量的安全性、强度、身份、效力和纯度的检测。实施例4
HBV-002 mfp^nm^mir^mm^^m
在临床试验中检测了如实施例3中所述的在cGMP下制造的HBV-002疫苗。在健康成年志愿者中的HBV-002生物产品的1期、标签开放式、临床研究评估了具有相同量Alhydrogel ‘85’佐剂的疫苗活性成分(WN-80E)的3种不同剂量水平或不含Alhydrogel ‘85’的WN-80E 的最高剂量水平。受试者在第0、4和8周接受研究疫苗的单次IM注射。在下表1中总结了研究设计。表1.临床研究HBV-002-C-101的设计
权利要求
1.一种疫苗，其包含有效量的纯化的重组西尼罗病毒囊膜(“E”)蛋白，其中所述E蛋白构成野生型E的从其N-端第一位氨基酸残基开始约80%的长度(WN-80E)，使得当在宿主细胞中重组表达时， 所述E蛋白可被分泌至生长培养基；和有效量的基于铝的佐剂，其中所述疫苗在人受试者中诱发中和抗体的产生。
2.权利要求1的疫苗，其中所述E蛋白在昆虫宿主细胞中重组产生和表达。
3.权利要求1的疫苗，其中所述E蛋白在黑腹果蝇(Mrosophilamelanogaster ) Schneider 2 (S2)宿主细胞中重组产生和表达。
4.权利要求1、2或3的疫苗，其还包含药学上可接受的赋形剂。
5.权利要求1、2或3的疫苗，其用于免疫缺陷群体。
6.一种在人中引起保护性免疫应答的方法，其包括以治疗可接受的方式施用治疗有效量的权利要求1、2或3的疫苗。
7.—种在人中提供针对西尼罗病毒诱发的疾病的免疫保护的方法，其包括施用有效量的权利要求1、2或3的疫苗，由此提供免患西尼罗疾病的保护。
8.权利要求4的疫苗，其用于免疫缺陷群体。
9.一种在人中引起保护性免疫应答的方法，其包括以治疗可接受的方式施用治疗有效量的权利要求4的疫苗。
10.一种在人中提供针对西尼罗病毒引起的疾病的免疫保护的方法，其包括施用有效量的权利要求4的疫苗，由此提供免患西尼罗疾病的保护。
全文摘要
描述了用于人用的西尼罗病毒疫苗，其优选地包含截短的西尼罗病毒囊膜糖蛋白的重组产生形式和铝佐剂。所述疫苗可用于一般群体，包括免疫抑制、免疫受损和免疫衰老个体。所述疫苗可安全和有效地用于所有健康和高危群体。在所述疫苗中也可包含药学上可接受的载体。
文档编号A61K39/12GK102481355SQ201080023950
公开日2012年5月30日 申请日期2010年6月1日 优先权日2009年5月31日
发明者科勒 B., L. 维克斯-莱维 C., A. 奥加塔 S., 佩 V. 申请人:默沙东公司