Bmp-alk3拮抗剂和促进骨生长的用途的制作方法

专利名称：Bmp-alk3拮抗剂和促进骨生长的用途的制作方法
BMP-ALK3拮抗剂和促进骨生长的用途
相关申请
本申请要求保护2009年3月30日提交的美国临时专利申请号61/211，557,2010 年2月19日提交的61/306，331和2010年3月16日提交的61/314，556的权益。上述申请的全部教导通过引用结合到本文中。
发明背景
骨病，从骨质疏松症到骨折，代表着一类病理状态，对其有效的药剂很少。治疗反而集中在物理和行为干预，包括固定、运动和饮食改变。为了治疗各种骨病，具有促进骨生长和增加骨密度的治疗药物将会是有益的。
骨生长和骨矿化取决于两种细胞类型即破骨细胞和成骨细胞的活性，虽然软骨细胞和脉管系统细胞也参与这些过程的重要方面。从发育来看，骨形成通过两种机制即软骨内骨化和膜内骨化而产生，其中前者负责纵向骨形成，后者负责局部结构扁骨的形成，例如颅骨。软骨内骨化需要软骨结构在生长面上相继形成和降解，所述生长面用作成骨细胞、破骨细胞、脉管系统形成和随后矿化的模板。在膜内骨化期间，骨在结缔组织上直接形成。两种过程都需要成骨细胞的浸润和随后的基质沉积。
骨折和其它的骨结构破坏至少从表面上看通过类似于骨发生发育事件顺序的过程而愈合，包括软骨组织的形成和随后的矿化。骨折愈合过程可以两种方式产生。直接或一期骨愈合在无骨痂形成的情况下发生。间接或二期骨愈合伴随骨痂前体期发生。骨折的一期愈合包括在紧紧固定的骨破坏处重新形成机械连续性。在合适条件下，骨破坏周围的骨吸收细胞显示隧道效应性吸收反应(tunnelling resorptive response)，建立穿透血管的途径，并且随后愈合。骨的二期愈合沿炎症、软骨痂形成、骨痂矿化和骨痂重建的过程进行。在炎症期，因损伤部位的骨膜和骨内膜血管破坏导致血肿和形成出血。炎性细胞侵入该区域。在软骨痂形成期，细胞产生新血管、成纤维细胞、胞内物质和支持细胞，在骨折碎片间的空间形成肉芽组织。由纤维组织或软骨组织(软骨痂)建立骨破裂的临床愈合。成骨细胞形成，并介导软骨痂矿化，软骨痂然后被板层骨替换，并进行正常的重建过程。
除了骨折和骨结构的其它物理破坏以外，骨矿物质含量和骨质量的丢失可因各种条件引起，并可导致严重的医学问题。在个体生命期内，以相对可预测的方式发生骨质量的改变。直到30岁左右，男性和女性两者的骨通过软骨内生长面的线性生长和径向生长，生长至最大质量。约30岁(对于骨小梁，例如扁骨，例如椎骨和骨盆)和40岁(对骨皮质， 例如存在于四肢中的长骨)后，男性和女性两者都发生缓慢的骨丢失。女性中，还会出现大量骨丢失的最后阶段，可能是由于绝经后雌激素缺乏引起的。在这个阶段，女性可丢失额外 10%的来自骨皮质的骨质量，而且小梁区室可损失25%。进行性骨丢失是否导致病理病况 (例如骨质疏松症)很大程度上取决于个体最初的骨质量和是否有恶化条件。
骨丢失有时以正常骨重建过程失衡为特征。健康骨不断进行重建。重建始于由破骨细胞引起的骨吸收。然后被吸收的骨被新的骨组织替代，其特征在于由成骨细胞引起的胶原形成和随后的钙化。在健康个体中，吸收和形成的速率是平衡的。骨质疏松症是一种慢性进行性病况，以向吸收转变为标志，导致骨质量和骨矿化的总体下降。人的骨质疏松症之前是临床骨质减少(骨矿物质密度以大于1标准差但小于2. 5标准差低于青年成人骨的平均值)。全球范围内，约7500万人面临骨质疏松症的风险。
因此，用于控制破骨细胞和成骨细胞活性之间的平衡的方法可用于促进骨折和其它骨损伤的愈合以及与骨质量和骨矿化丢失有关的诸如骨质疏松症等病症的治疗。
至于骨质疏松症，雌激素、降钙素、骨钙蛋白与维生素K或高剂量的膳食钙均用作治疗性干预。骨质疏松症的其它治疗方法包括二膦酸盐、甲状旁腺激素、拟钙剂 (calcimimetics)、他汀类、同化激素、镧盐和锶盐以及氟化钠。然而，这类治疗药常与不良副作用有关。
骨丢失还是许多癌症的重大并发症，可因肿瘤转移至骨、破骨细胞的活化或化疗治疗的影响而引起。特别是广泛用于治疗乳癌的抗雌激素疗法可引起大量骨丢失。
其它骨病(例如成骨不全)可由遗传、发育、营养或其它病理和缺乏症引起。
因此，本公开内容的一个目的是提供用于促进骨生长和矿化的组合物和方法。
发明概述
在某种程度上，本公开内容证实具有ALK3或BMP拮抗剂活性的分子(“ALK3拮抗剂”和“BMP拮抗剂”)可用于增加骨密度、促进骨生长和/或提高骨强度。鉴于大量文献和临床经验表明许多BMP，特别是BMP2、BMP4和BMP7，是骨形成的有效刺激物，这个观察结果是特别出人意料的。本公开内容证实，ALK3的可溶形式起BMP-ALK3信号转导的抑制剂的作用，体内促进骨密度的提高、促进骨生长和提高骨强度。虽然无意束缚于任何特定的机制， 但似乎ALK3的可溶形式通过抑制BMP2和/或BMP4和通过ALK3传递信号的可能的其它配体来达到这种效果。因此，本公开内容证实，BMP-ALK3信号转导途径的拮抗剂可用来增加骨密度和促进骨生长。虽然可溶性ALK3可通过BMP拮抗作用以外的机制对骨产生影响，但是本公开内容表明，可根据BMP-ALK3拮抗剂活性选择所需要的治疗药物。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供使用BMP-ALK3拮抗剂以治疗与低骨密度或低骨强度相关的病症 (例如骨质疏松症)或促进有需要的患者(例如骨折患者)的骨生长的方法，所述BMP-ALK3 拮抗剂包括例如BMP-结合ALK3多肽、抗BMP抗体、抗ALK3抗体、靶向BMP或ALK3的小分子和适体以及降低BMP和ALK3表达的核酸。在其它实施方案中，本公开内容鉴定具有有利性质并保持适当的BMP2或BMP4结合的ALK3多肽的截短形式(例如ALK3_Fc多肽)。
在某些方面，本公开内容提供包含与BMP2和/或BMP4结合的可溶性ALK3多肽的多肽。可溶性ALK3多肽还可与其它配体结合。可将ALK3多肽配制成包含BMP-结合ALK3 多肽和药学上可接受的载体的药物制剂。优选与BMP2和/或BMP4结合的BMP-结合ALK3 多肽的Kd小于1微摩尔或者小于100、10或1纳摩尔。通过大小排阻层析法进行评价，优选所述成分相对于其它多肽成分的纯度至少为95%，更优选所述成分的纯度至少为98%。 用于这类制剂的BMP-结合ALK3多肽可以是本文公开的任何BMP-结合ALK3多肽，例如具有选自 SEQ ID NO :3、7、11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 或 41的氨基酸序列的多肽，或者具有以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO :3、7、11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 或 41 的氨基酸序列有至少 80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 同一性，包括 SEQ ID NO :3 的不超过 1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 个氨基酸的 N 端和/或C端截短，且任选在有或没有接头时与!^c融合蛋白融合。具体地说，本公开内容提供在ALK3E⑶部分的N端有0-7个氨基酸截短和在ALK3 E⑶部分的C端有0_12个氨基酸截短的ALK3多肽，因此描述了相当于SEQ ID NO 3的氨基酸8-117的功能部分和包含与SEQ ID NO 3的8-117的氨基酸序列有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的蛋白质的多肽。值得注意的是，人ALK3和鼠ALK3在胞外域的氨基酸序列水平上有97-98% 同一性，本文表明包含来自人或小鼠蛋白质的这类结构域的蛋白质在体外和体内具有类似活性。BMP-结合ALK3多肽可包括天然ALK3多肽的功能片段，例如包含选自SEQ ID NO: 1或3的序列的至少10、20或30个氨基酸的功能片段。出人意料的是，正如本文证实的一样，在ALK3胞外域的C端区包括氨基酸缺失的ALK3蛋白保持针对BMP2和BMP4的活性，而针对其它配体(例如BMP6和BMP7)的活性消失，因此在配体选择性方面提供了改进，这通常对在临床开发或商品化中消除未预料到的脱靶作用(off-target effect)而言是需要的。这类变化可包括SEQ ID NO 3的C端不超过6或7个、不超过12个或不超过M个氨基酸的缺失。任选在C端截短的形式还可在N端截短不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。 ALK3蛋白的前述变化可包括在ALK3-FC融合蛋白中，该融合蛋白可包含本文公开的任何接头(或根本无接头)(包括具有序列GGG或TGGG或SGGG的接头)和来源于人IgGl、IgG2、 IgG3或IgG4或其它哺乳动物免疫球蛋白的Fc部分。
与天然存在的ALK3多肽相比，可溶性BMP-结合ALK3多肽在氨基酸序列中(例如在配体结合域中)可包括1、2、5个或更多个改变。氨基酸序列的改变可例如改变多肽的糖基化(当在哺乳动物、昆虫或其它真核细胞中产生时)，或者与天然存在的ALK3多肽相比， 改变多肽的蛋白酶剪切。
BMP-结合ALK3多肽可以是融合蛋白，其具有ALK3多肽(例如ALK3的配体结合部分)作为一个结构域和一个或多个提供所需性质(例如药代动力学改进、更容易纯化、靶向特定组织等)的其它结构域。例如，融合蛋白的结构域可提高以下性质的一种或多种体内稳定性、体内半寿期、摄取/给予、组织定位或分布、蛋白质复合体的形成、融合蛋白的多聚化和/或纯化。BMP-结合ALK3融合蛋白可包括免疫球蛋白Fc结构域(野生型或突变型) 或血清白蛋白或提供所需性质(例如药代动力学改进、溶解度提高或稳定性提高)的其它多肽部分。在一个优选的实施方案中，ALK3-FC融合物包含位于Fc结构域和胞外ALK3结构域之间相对松散的接头。该松散接头可相当于ALK3胞外域的C端，或者可为1、2、3、4或5 个氨基酸或者相对缺乏二级结构长度介于5和15、20、30、50个或更多个氨基酸之间的人工序列，或者两者的混合物。接头可富含甘氨酸和脯氨酸残基，并可含有例如苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列或者苏氨酸/丝氨酸和/或甘氨酸的重复序列(例如GGG、GGGG、TG4, SG4^TG3或单一序列或重复序列)。融合蛋白可包括纯化亚序列，例如表位标签、FLAG标签、聚组氨酸序列和GST融合物。任选可溶性ALK3多肽包括一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。药物制剂还可包括一种或多种其它的化合物，例如用于治疗骨病的化合物。优选药物制剂基本上无致热原。一般而言，优选在哺乳动物细胞系中表达ALK3蛋白，所述哺乳动物细胞系适当介导ALK3蛋白的天然糖基化以减少患者不利免疫应答的可能性。已成功利用人和CHO细胞系，预期其它常见的哺乳动物表达系统将是有用的。
在某些方面，本公开内容提供编码可溶性BMP-结合ALK3多肽的核酸。分离多核苷酸可包含诸如上述等可溶性BMP-结合ALK3多肽的编码序列。例如，分离核酸可包括编码ALK3的胞外域(例如配体结合域)的序列和以下序列，其编码部分或全部ALK3的跨膜结构域和/或胞质结构域，但不编码位于跨膜结构域或胞质结构域内或者位于胞外域和跨膜结构域或胞质结构域之间的终止密码子。例如，分离多核苷酸可包含全长ALK3多核苷酸序列(例如SEQ ID NO 2或4)或者部分截短的形式，所述分离多核苷酸还包含在3’端之前至少600个核苷酸或位于其它部位的转录终止密码子，使得多核苷酸的翻译产生任选与全长ALK3的截短部分融合的胞外域。优选的核酸序列是SEQ ID NO :12、13、15、16、19、21、 M、27、32或37以及在严格杂交条件下与这类核酸或其互补序列杂交的核酸。本文公开的核酸可与用于表达的启动子有效连接，而且本公开内容提供用这类重组多核苷酸转化的细胞。优选细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
在某些方面，本公开内容提供用于制备可溶性BMP-结合ALK3多肽的方法。这类方法可包括在合适的细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中表达本文公开的任何核酸 (例如 SEQ ID 而2、4、12、13、15、16、19、21、24、27、32或37)。这类方法可包括a)在适于表达可溶性ALK3多肽的条件下培养细胞，其中所述细胞用可溶性ALK3表达构建体转化；和 b)回收如此表达的可溶性ALK3多肽。可溶性ALK3多肽可作为未加工流分、部分纯化流分或高纯化流分回收。纯化可通过一系列的纯化步骤实现，包括例如任何顺序的以下1、2或3 种或更多种方法:A蛋白层析法、阴离子交换层析法(例如Q琼脂糖凝胶)、疏水相互作用层析法(例如苯基琼脂糖凝胶(phenyls印harose))、大小排阻层析法和阳离子交换层析法。
在某些方面，本文公开的BMP-ALK3拮抗剂，例如可溶性BMP-结合ALK3多肽，可用于促进受试者的骨生长或增加受试者的骨密度的方法。在某些实施方案中，本公开内容提供用于治疗有需要的患者的与低骨密度相关的病症或促进骨生长的方法。方法可包括给予有需要的受试者有效量的BMP-ALK3拮抗剂。在某些方面，本公开内容提供BMP-ALK3拮抗剂在制备用于治疗本文所述病症或病况的药物中的用途。
在某些方面，本公开内容提供用于鉴定刺激骨生长或提高骨矿化的物质的方法。 所述方法包括a)鉴定与BMP或与ALK3多肽的配体结合域结合的试验物质；和b)评价所述物质对骨生长或骨矿化的作用。
附图简述


图1表示人ALK3前体的天然氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。ALK3胞外域(残基 24-152)用下划线表示。
图2表示编码人ALK3前体的天然核苷酸序列(SEQ ID NO :2)。编码ALK3胞外域的序列(核苷酸70-456)用下划线表示。
图3表示人ALK3胞外域的天然氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。
图4表示编码人ALK3胞外域的天然核苷酸序列(SEQ ID NO 4)。
图5表示人IgGlFc结构域的天然氨基酸序列(SEQ ID NO 5)。
图6表示编码人IgGlFc结构域的天然核苷酸序列(SEQ ID NO 6)。
图7表示无前导序列的hALK3(M-152)-hFc的氨基酸序列(SEQ ID NO 7)。人 ALK3胞外域(SEQ ID NO 3)用下划线表示，TGGG接头序列用黑体字表示。
图8表示具有TPA前导序列的hALK3 04-15 -hFc的完整氨基酸序列(SEQ ID NO 11)。人ALK3胞外域(SEQ ID NO 3)用下划线表示，TGGG接头序列用黑体字表示。
图9表示编码具有TPA前导序列的hALK3(M-152)_hFc的核苷酸序列。SEQ ID NO: 12相当于编码链，SEQ ID NO :13相当于反编码链。编码人ALK3胞外域的序列(SEQ ID NO 4)用下划线表示。
图10表示具有TPA前导序列的hALK3 (24-152) -mFc的完整氨基酸序列(SEQ ID N0:14)。人ALK3胞外域(SEQ ID NO 3)用下划线表示，TGGG接头序列用黑体字表示。
图11表示编码具有TPA前导序列的hALK3 04-152)-mFc的核苷酸序列。SEQ ID NO: 15相当于编码链，SEQ ID NO 16相当于反编码链。编码人ALK3胞外域的序列(SEQ ID NO 4)用下划线表示。
图12表示hALK3 (24-152) -mFc治疗对雌性小鼠的整体骨矿物质密度的影响。通过双能X线吸收测定法(DEXA)进行测定。数据为平均值(n = 8只/组)士SEM。*，通过非配对t检验得到的相对于溶媒P < 0. 05。在治疗31和42天后，hALK3 (24-152) -mFc显著增加整体骨密度。
图13表示hALK3(M-152)-mFc治疗对雌性小鼠的椎骨矿物质密度的作用。通过DEXA对含有第四和第五腰椎(L4，L5)的区域进行测量。数据为平均值(n = 8只/ 组)士SEM。**，通过非配对t检验得到的相对于溶媒的P < 0. 005。在治疗31和42天后， hALK3 (24-152)-mFc显著增加椎骨密度。
图14表示hALK3 (24-152) -mFc治疗对雌性小鼠的骨皮质厚度的作用。右胫骨近端的测量通过显微计算机断层扫描术(显微CT)进行。数据为平均值(n = 8只/组)，误差棒表示士 2XSEM。**，通过非配对t检验得到的相对于溶媒的P < 0. 005。在6周治疗后，hALK3 (24-152)-mFc显著提高骨皮质厚度。
图15表示hALK3 (24-152) -mFc治疗对雌性小鼠骨小梁体积的作用。右胫骨近端的测量通过显微CT进行。数据为平均值(n = 8只/组)，误差棒表示士 2 X SEM。***，通过非配对t检验得到的相对于治疗前基线或溶媒的P < 0. 001。在4周治疗后，hALK3 (24-152) -mFc 使骨小梁的比例翻倍以上。
图16表示hALK3 (24-152) -mFc治疗对雌性小鼠的平均小梁厚度的作用。右胫骨近端的测量通过显微CT进行。数据为组平均值(n = 8只/组)，误差棒表示士2XSEM。 ***，通过非配对t检验得到的相对于治疗前基线或溶媒的P < 0. 001。在4周治疗后， hALK3 (24-152)-mFc显著增加小梁厚度。
图17表示hALK3 04-152)-mFc治疗4周对雌性小鼠骨小梁微结构的作用。通过显微CT产生胫骨近端骨小梁的代表性三维图像。比例尺=300 μ m。
图18表示本文公开的为了刺激骨形成而通过BMP-ALK3信号转导轴干扰信号转导的三种方法的实例。A :ALK3-Fc。B :抗选定BMP配体的抗体。C 抗ALK3胞外域配体结合区的抗体。“BMP2”用来说明BMP可以是BMP2、BMP4或ALK3的其它高亲和力配体。
图19表示hALK3 (24-152) -mFc治疗6周对雌性小鼠最大骨载荷的作用。用 Instron机械测试装置离体进行股骨单侧分析。数据为平均值(n = 8只/组)士SEM，单位为牛顿(N)。**，相对于溶媒的P < 0.01o hALK3 (24-152)-mFc增加最大骨载荷达30%。
图20表示hALK3(M-152)_mFc治疗6周对雌性小鼠骨刚度(bone stiffness) 的作用。用Instron机械测试装置离体进行股骨单侧分析。数据为平均值(n = 8只/ 组)士 SEM，单位为牛顿(N) /mm。*，相对于溶媒的P < 0. 05。hALK3 (24-152) -mFc提高骨刚度达14%。
图21表示hALK3 04-152)-mFc治疗6周对雌性小鼠骨断裂能量(energy to bone failure)的作用。用Instron机械测试装置离体进行股骨单侧分析。数据为平均值(η = 8只/组)士 SEM,单位为毫焦耳(mj)。*，相对于溶媒的P < 0. 05。hALK3 (24-152) -mFc提高断裂能量达32%。
图22表示mALK3 (24-152) -mFc治疗对已确立的骨质减少的OVX小鼠模型的骨小梁体积的作用。胫骨近端的测量通过显微CT进行。数据为平均值(n = 7-8只/组)，误差棒表示士2SEM。*，相对于OVX+溶媒的P < 0. 05。给药前，与假手术小鼠相比，OVX小鼠的骨小梁体积减小。在治疗的28和56天，与OVX对照相比，mALK3(M-152)-mFc显著增加骨体积。
图23表示mALK3 (24-152) -mFc治疗对骨质减少OVX小鼠模型的骨皮质厚度的作用。骨皮质的测量通过显微CT进行。数据为平均值(n = 7-8只/组)，误差棒表示士 2SEM。 *，相对于OVX+溶媒的P < 0. 05。治疗56天时，与OVX对照相比，mALK3 (24-152) -mFc显著增加皮质厚度。
图M表示mALK3(M-152)-mFc治疗对骨质减少OVX小鼠模型的骨内膜周长的作用。胫骨干的测量通过显微CT进行。数据为平均值(n = 7-8只/组)，误差棒表示士2SEM。 *，相对于OVX+溶媒的P < 0. 05。治疗56天时，与OVX对照相比，mALK3 (24-152) -mFc显著缩小骨内膜周长，因此提供了骨皮质生长的额外证据。
图25表示用DEXA测定的mALK3 (24-152) -mFc治疗对骨质减少OVX小鼠模型的整体骨矿物质密度的作用。数据为平均值(n = 7-8H/^i)±SEM。*，相对于OVX+溶媒的P < 0. 05。在治疗14、28、42和56天时，与OVX对照相比，mALK3 (24-152) -mFc显著增加整体骨密度。
图沈表示mALK3(M-152)-mFc治疗对骨质减少OVX小鼠模型的椎骨矿物质密度的作用。通过DEXA对腰脊柱(椎骨L1-L6)进行分析。数据为平均值(n = 7_8只/ 组)士SEM。*，相对于OVX+溶媒的P < 0. 05。在治疗的14、28、42和56天时，与OVX对照相比，mALK3 (24-152)-mFc显著增加椎骨密度。
图27表示通过DEXA测定的mALK3-mFc治疗对骨质减少OVX小鼠模型的股骨-胫骨骨矿物质密度的作用。整个股骨和胫骨近端的分析通过DEXA进行。数据为平均值(η = 7-8只/组)士SEM。*，相对于OVX+溶媒的P < 0. 05。在治疗观、42和56天时，与OVX对照相比，mALK3 (24-152)-mFc显著增加股骨-胫骨的骨密度。
图28表示mALK3 (24-152) -mFc持续56天对骨质减少OVX小鼠模型的椎骨微结构的作用。腰椎(L5)骨小梁的代表性三维图像通过显微CT离体产生。比例尺= 300μπι。
图四表示在股骨远端通过组织形态测定法评价的mALK3 (24-152) -mFc对雌性小鼠骨体积的作用。数据为平均值士SEM;n = 6只/组/时间点。**，相对于相应时间点的溶媒的P < 0. 01。与溶媒相比，mALK3 (24-152)-mFc在所有时间点上显著增加骨体积。
图30表示在股骨远端通过组织形态测定法评价的mALK3 (24-152) -mFc对雌性小鼠骨形成速度的作用。数据为平均值士SEM ；η = 6只/组/时间点。*#，相对于相应时间点的溶媒的P < 0. 001。与溶媒相比，在治疗28天时，mALK3(M-152)-mFc显著提高骨形成速度，因此提供了合成代谢骨形成的证据。11CN 102548617 A
图31表示在股骨远端通过组织形态测定法评价的mALK3 (24-152) -mFc对雌性小鼠骨矿化表面的作用。数据为平均值士SEM ；η = 6只/组/时间点。#，P <0.01 ；*，P <0. 05，相对于相应时间点的溶媒。在治疗14和观天时，与溶媒相比，mALK3(M-152)-mFc 显著增加矿化表面，因此提供了合成代谢骨形成的额外证据。
图32表示在股骨远端通过组织形态测定法评价的mALK3 (24-152) -mFc对雌性小鼠破骨细胞表面的作用。数据为平均值士SEM ;n = 6只/组/时间点。**，相对于相应时间点的溶媒的P < 0. 01。在治疗28天时，与溶媒相比，mALK3 (24-152)-mFc显著减少破骨细胞表面，因此提供了抗吸收性骨形成的证据。
图33表示通过Luminex xMAP 测定法测定的mALK3 (24-152) -mFc对雌性小鼠的RANKL(核因子κ B配体的受体激活物)的血清水平的作用。数据为平均值士SEM ；η = 6只/组/时间点。**，P < 0.01 ；*，P < 0. 05，相对于相应时间点的溶媒。与溶媒相比， mALK3 (24-152) -mFc在所有时间点上显著降低循环RANKL水平。
图34表示通过Luminex xMAP 测定法测定的mALK3 (24-152) -mFc对雌性小鼠的血清护骨蛋白(OPG)水平的作用。数据为平均值士SEM;n = 6只/组/时间点。**， P < 0.01 ；*，P < 0.05，相对于相应时间点的溶媒。治疗观和42天时，与溶媒相比， mALK3 (24-152) -mFc显著提高循环OPG水平。
图35表示通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)评价的mALK3 (24-152) -mFc对雌性小鼠股骨和胫骨的硬化蛋白(sclerostirOmRNA水平的作用。数据为平均值士SEM。***， P < 0. 001 ；*，P < 0.05，相对于相应时间点的溶媒。与溶媒相比，在治疗2、7和28天时， mALK3 (24-152)-mFc显著降低硬化蛋白mRNA水平。
图36表示hALK3 (24-152) -hFc对雌性小鼠骨体积的作用。在第0天(基线)和再次在第42天(离体)通过显微CT对胫骨近端的骨体积进行评价。数据为平均值士SEM ； η = 6只/组。***，相对于溶媒的P <0.001。在实验过程中，溶媒治疗的对照的骨体积降低接近20 %，但用hALK3 (24-152) -hFc治疗增加超过80 %。
发明详述
1.综述
在某种程度上，本公开内容证实BMP-ALK3信号转导途径的抑制剂(例如ALK3_Fc 蛋白)在动物中促进骨形成的出人意料的结果。ALK3是转化生长因子-β (TGF-β)/骨形态发生蛋白(BMP)超家族成员的受体。TGF-β/BMP超家族含有各种生长因子，其都有共同的序列元件和结构基序。已知这些蛋白质在脊椎动物和无脊椎动物两者中对多种细胞类型发挥生物作用。该超家族的成员在图式形成和组织特化的胚胎发育期间发挥重要功能，可影响各种分化过程，包括脂肪形成、肌发生、软骨发生、心脏发生、血细胞生成、神经发生和上皮细胞分化。通过操控TGF-β家族成员的活性，常常可引起生物体的重大生理改变。例如Piedmontese和Belgian Blue牛品种在GDF8 (亦称肌肉生长抑制因子)基因中携带引起肌肉质量明显增加的功能缺失突变。Grobet等，Nat Genet. 1997,17(1) :71_4。此外，在人中，⑶F8的无活性等位基因与肌肉质量增加和据报道的异常强度有关。khuelke等，N Engl J Med 2004，350 :2682_8。
TGF-β信号受I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合物介导，所述受体在配体刺激时磷酸化和激活下游Smad蛋白(Massagu6，2000，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 169-178)。这些I型和II型受体是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸区的配体结合胞外域、 跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的胞质结构域组成。I型受体是信号转导所必需的；II型受体是结合配体和I型受体表达所必需的。I型和II型活化素受体在配体结合后形成稳定的复合体，导致I型受体被II型受体磷酸化。
活化素受体样激酶_3(ALK3)是在BMP家族中介导多种配体的作用的I型受体，亦称为骨形态发生蛋白受体IA型(BMPRlA)或活化素A受体II型样激酶(ACVRLK)。与具有遍在组织表达的若干I型受体不同，ALK3显示与更特化的功能性一致的限制性表达形式(ten Dijke, 1993，Oncogene 8 :2879-2887)。ALK3 通常被视为 BMP2、BMP4、BMP7 和 BMP 家族其它成员的高亲和力受体。BMP2和BMP7是成骨细胞分化的有效刺激物，目前在临床上用于诱导脊柱融合术和某些不愈合骨折中的骨形成。ALK3在成骨细胞中被视作介导BMP2和BMP4 信号转导的关键受体(Lavery 等，2008，J. Biol. Chem. 283 :20948-20958)。纯合子 ALK3 敲除小鼠在胚胎发生早期(第9. 5天)死亡，然而，最新报道指出，成骨细胞中携带条件性破坏的ALK3的成年小鼠的骨质量增加，虽然新形成的骨显示杂乱无序的迹象(Kamiya，2008， J. Bone Miner. Res. 23 :2007-2017 ；Kamiya,2008, Development 135 :3801-3811)。与 BMP2 和BMP7(ALK3的配体)在临床应用中作为骨构建剂的功效相比，这个研究结果令人震惊。
正如本文所证实的一样，大体上优先结合BMP2和BMP4的可溶性ALK3多肽 (ALK3-Fc)体内有效促进骨生长和增加骨密度。虽然无意受任何特定机制的束缚，但是考虑到用于这些研究的具体的可溶性ALK3构建体具有非常强的BMP2和BMP4结合(微微摩尔解离常数)，预期ALK3的作用主要是由BMP拮抗剂作用引起的。不论机制，本文提供的数据清楚表明BMP-ALK3拮抗剂在正常小鼠中的确增加骨密度。出人意料的是，用ALK3-FC治疗所产生的骨未显示在ALK3条件性敲除小鼠中观察到的杂乱无序类型的迹象。应注意的是， 骨是动态组织，其中生长或收缩以及密度提高或降低取决于产生骨和刺激矿化的因素(主要是成骨细胞)与破坏骨和使骨去矿化的因素(主要是破骨细胞)的平衡。可通过增加产生性因素、通过减少破坏性因素或者上述两者来提高骨生长和矿化。术语“促进骨生长”和 “增加骨矿化”是指在骨中可观察到的物理变化，至于骨变化赖以发生的机制而言意图是中立的。
用于本文所述研究的骨生长/密度的小鼠模型被认为在人体功效方面具有高预测性，因此，本公开内容提供使用ALK3多肽和其它BMP-ALK3拮抗剂以促进人的骨生长和增加骨密度的方法。BMP-ALK3拮抗剂包括例如BMP-结合可溶性ALK3多肽、与BMP结合并破坏ALK3结合的抗体、与ALK3结合并破坏BMP结合的抗体、针对BMP或ALK3结合选择的非抗体蛋白(参见例如 W0/2002/088171、W0/2006/055689、W0/2002/032925、W0/2005/037989、 US 2003/0133939和US 2005/0238646，例如用于设计和选择所述多肽、抗体或非抗体蛋白的这类蛋白质和方法)、针对BMP或ALK3结合选择的、常附有Fc结构域的随机肽。具有BMP 或ALK3结合活性的两种不同的蛋白质(或其它部分)，尤其是分别阻断I型(例如可溶性 I型活化素受体)结合部位和II型(例如可溶性II型活化素受体)结合部位的BMP结合剂，可连接在一起产生双功能结合分子。还考虑抑制BMP-ALK3信号转导轴的核酸适体、小分子和其它物质。另外，核酸，例如抑制BMP或者特别是抑制ALK3表达的反义分子、siRNA 或核酶也可用作BMP-ALK3拮抗剂。
在本发明的上下文中，以及在使用各个术语具体的上下文中，用于本说明书的术语一般具有本领域的一般含义。下文或本说明书其它部分论述某些术语，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用所述组合物和方法时，对从业人员提供额外的指导。 术语任何用法的范围或含义从使用术语的具体上下文来看将是显而易见的。
“约”和“大约”总的来讲应意指给定测量的性质或精度，对所测定的量的可接受的误差度。示例性误差度通常在给定值或值的范围的20 %、优选10 %、更优选5 %内。
或者，特别是在生物系统中，术语“约，，和“大约，，可意指在给定值的数量级以内、 优选5倍以内、更优选2倍以内的值。本文给出的数值的量是近似值，除非另有说明，意指在未明确表示时可表示术语“约”或“大约”。
本发明的方法可包括将序列彼此进行比较的步骤，包括野生型序列与一个或多个突变型(序列变体)比较。这类比较通常包括多聚体序列的比对，例如应用本领域众所周知的序列比对程序和/或算法(例如BLAST、FASTA和MEGALIGN等)。技术人员可容易理解的是，在其中突变含有残基插入或缺失的这类比对中，序列比对可在不含插入残基或缺失残基的多聚体序列中引入“空位”(通常用破折号或“A”表示)。
在所有其语法形式和拼法变化中的“同源的”，是指具有“共同进化起源”的两种蛋白质之间的关系，包括来源于同一生物物种超家族的蛋白质以及来源于不同生物物种的同源蛋白质。这类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的一样，不论就百分比同一性而言，或者就特定残基或基序和保守位置的存在情况而论。
在所有其全部语法形式中的术语“序列相似性”是指可能有或没有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或一致性程度。
然而，在普通用法中，以及在本申请中，术语“同源的”当用副词(例如“高度地”) 修饰时，可以是指序列相似性，并且可能与共同进化起源有关或无关。
2. ALK3 多肽
在某些方面，本发明涉及ALK3多肽。本文使用的术语“ALK3”是指来源于任何物种的活化素受体样激酶-3 (ALK3)[亦称为骨形态发生蛋白受体IA型(BMPRlA)或活化素A 受体II型样激酶(ACVRLK)]蛋白家族以及通过诱变或其它修饰衍生于这类ALK3蛋白的变体。本文对ALK3的提及要理解为提及任一种目前已鉴定的形式。ALK3家族的成员一般是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸区的配体结合胞外域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/ 苏氨酸激酶活性的胞质结构域组成。
术语“ALK3多肽”包括包含ALK3家族成员的任何天然存在的多肽及其保持有用活性的任何变体(包括突变型、片段、融合物和肽模拟形式)的多肽。例如，ALK3多肽包括来源于任何已知ALK3序列、具有以下序列的多肽，所述序列与ALK3多肽序列有至少约80 %同一性、优选至少85%、90%、95%、97%、99%或更大同一性。例如，本发明的ALK3多肽可与 ALK3蛋白和/或BMP结合并抑制ALK3蛋白和/或BMP的功能。优选ALK3多肽促进骨生长和骨矿化。ALK3多肽的实例包括人ALK3前体多肽(SEQ ID NO 1)和可溶性人ALK3多肽(例如 SEQ ID NO :3、7、11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 或 41)。
人ALK3前体蛋白序列(SEQ ID NO :1)见图1，编码人ALK3前体蛋白的核酸序列 (SEQ ID NO 2 ；Genbank登录号匪_0043四的核苷酸讨9_2144)见图2。人ALK3可溶性(胞外)的加工多肽序列(SEQ ID NO 3)见图3，编码人ALK3胞外域的序列的核酸序列(SEQID NO 4 ；Genbank登录号匪_0043四的核苷酸618-1004)见图4。在一个具体的实施方案中，本发明涉及可溶性ALK3多肽。本发明描述的术语“可溶性ALK3多肽” 一般是指包含ALK3蛋白的胞外域的多肽。本文使用的术语“可溶性ALK3 多肽”包括ALK3蛋白的任何天然存在的胞外域及其任何变体(包括突变型、片段和肽模拟形式)。BMP-结合ALK3多肽是保持与BMP结合、特别是与BMP2和BMP4结合的能力的多肽。 优选BMP-结合ALK3多肽与BMP结合的解离常数为InM或更低。人ALK3前体蛋白的氨基酸序列见图1。ALK3蛋白的胞外域与BMP结合，且一般是可溶性的，因此可称为可溶性BMP-结合ALK3多肽。可溶性BMP-结合ALK3多肽的实例包括SEQ ID NO :3、7、11、14、20、22、23、 25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 或 41 中所述的可溶性多肽。SEQ ID NO :7 称为ALK3(M-152)-hFc，在实施例中有进一步的描述。除包含ALK3蛋白的胞外域以外，可溶性BMP-结合ALK3多肽的其它实例还包含信号序列，例如天然ALK3前导序列(SEQ ID NO 8)、组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO 9)或蜜蜂蜂毒肽前导序列(SEQ ID NO 10)。SEQ ID NO 11所示ALK3_hFc多肽利用TPA前导序列。可通过筛选由编码ALK3多肽的核酸的相应片段重组产生的多肽，来获得ALK3多肽的功能活性片段。另外，可采用本领域已知技术，例如常规Merrifield固相f_Moc或 t-Boc化学法，以化学法合成片段。片段可(以重组法或通过化学合成)产生并测试以鉴定可起ALK3蛋白或由BMP介导的信号转导的拮抗剂(抑制剂)作用的肽基片段。可通过对由编码ALK3多肽的相应的诱变核酸重组产生的修饰多肽文库进行筛选，来获得ALK3多肽的功能活性变体。可产生变体，并测试以鉴定可起ALK3蛋白或由BMP 介导的信号转导的拮抗剂(抑制剂)作用的变体。在某些实施方案中，ALK3多肽的功能变体包含与选自 SEQ ID NO :3、7、11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、 40或41的氨基酸序列有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些情况下，所述功能变体具有与选自 SEQ ID NO :3、7、11、14、20、22、23、25、26、沘、29、30、31、33、34、；35、36、38、39、40或 41的氨基酸序列有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。为了诸如提高治疗功效或稳定性(例如离体保存期限和体内蛋白酶降解抗性)等目的，可通过修饰ALK3多肽的结构来产生功能变体。如果选择保持BMP结合，则这类修饰的ALK3多肽被视为天然存在的ALK3多肽的功能等同物。修饰的ALK3多肽还可通过例如氨基酸取代、缺失或添加来产生。例如，有理由预期，亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸单独置换、 天冬氨酸被谷氨酸单独置换、苏氨酸被丝氨酸单独置换，或者氨基酸被结构上相关的氨基酸进行类似置换(例如保守突变)将不会对所得分子的生物活性产生重大影响。保守置换是发生在其侧链上是相关的氨基酸家族内的置换。可通过评价变体ALK3多肽以类似于野生型ALK3多肽的方式在细胞中产生反应的能力，来容易地确定ALK3多肽的氨基酸序列的改变是否产生功能同源物。在某些实施方案中，本发明考虑ALK3多肽的特定突变以改变多肽的糖基化。可选择这类突变，使得引入或剔除一个或多个糖基化位点，例如0-联糖基化位点或N-联糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点一般包含被合适的细胞糖基化酶特异性识别的三肽序列，即天冬酰胺-χ-苏氨酸(或天冬酰胺-χ-丝氨酸)(其中“X”为任何氨基酸)。还可通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至野生型ALK3多肽的序列(对于0-联糖基化位点)，或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代野生型ALK3多肽的序列，来进行改变。在糖基化识别位点第一或第三氨基酸位置的一个或两个上的各种氨基酸取代或缺失(和/或在第二位置上的氨基酸缺失)在修饰三肽序列上导致非糖基化。在ALK3多肽上增加糖部分的数目的另一种方法是将糖苷与ALK3多肽化学偶联或酶促偶联。根据所采用的偶联方式，可将糖连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，例如半胱氨酸的巯基；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(e)芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法参见1987年9月11日公布的 WO 87/05330 以及 Aplin 和 Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem.，第 259-306 页，通过引用结合到本文中。可用化学方法和/或酶方法实现ALK3多肽上存在的一个或多个糖部分的脱去。化学去糖基化可包括例如将ALK3多肽暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等同化合物中。这种处理导致除连接糖(N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰半乳糖胺)以外的大部分或所有糖被切割，同时保持氨基酸序列完整。化学去糖基化另参见Hakimuddin等(1987) Arch. Biochem. Biophys. 259 :52 和 Edge 等(1981) Anal. Biochem. 118 :131。ALK3 多肽上的糖部分的酶促切割可通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶完成，参见Thotakura等 (1987)Meth. Enzymol. 138 :350。适当时，可根据所采用的表达系统类型，调整ALK3多肽的序列，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞均可引入可受所述肽的氨基酸序列影响的不同糖基化模式。一般而言，用于人的ALK3蛋白可在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系(例如 HEK293或CHO细胞系)中表达，虽然预期具有工程改造的糖基化酶的其它哺乳动物表达细胞系、酵母细胞系以及昆虫细胞也是有用的。本公开内容还考虑产生突变型、特别是数套ALK3多肽的组合突变型以及截短突变型的方法；组合突变型库尤其可用于鉴定功能变体序列。筛选这类组合文库的目的可以是产生例如可用作激动剂或拮抗剂或者总之具有新活性的ALK3多肽变体。下面提供各种筛选测定法，这类测定法可用来评价变体。例如，可针对与ALK3配体结合的能力筛选ALK3 多肽变体，以防止ALK3配体与ALK3多肽结合或干扰由ALK3配体引起的信号转导。还可以在基于细胞的测定法或体内测定法中测试ALK3多肽或其变体的活性。例如，可对ALK3多肽变体对参与骨产生或骨破坏的基因的表达的作用进行评价。这可根据需要在一种或多种重组ALK3配体蛋白(例如BMP2或BMP4)存在下进行，可以转染细胞以产生ALK3多肽和/或其变体，任选ALK3配体。同样，可将ALK3多肽给予小鼠或其它动物，并可评价一种或多种骨性质，例如密度或体积。还可以评价骨折的愈合速度。双能X线吸收测定法(DEXA)是一种评价动物骨密度的十分完善的无创性定量技术。在人中，可采用中枢 DEXA系统评价脊柱和骨盆的骨密度。这些是总体骨密度的最佳预测因子。可采用外周DEXA 系统评价外周骨的骨密度，包括例如手骨、腕骨、踝骨和足骨。可采用传统的χ射线成像系统(包括CAT扫描)评价骨生长和骨折愈合。也可以评价骨的机械强度。可以制备具有选择性或相对于天然存在的ALK3多肽功效普遍提高的组合衍生的变体。同样，诱变可产生与相应的野生型ALK3多肽相比胞内半寿期十分不同的变体。例如， 对于蛋白酶降解或者导致天然ALK3多肽破坏或以其它方式失活的其它细胞过程，经改变的蛋白质可更稳定或更不稳定。可利用这类变体和编码所述变体的基因，以通过调节ALK3 多肽的半寿期改变ALK3多肽水平。例如，短的半寿期可产生更短暂的生物作用，并且可供更密切地控制患者的重组ALK3多肽水平。在Fc融合蛋白中，可在接头(如有的话)和/或Fc部分中进行突变以改变该蛋白质的半寿期。可通过编码多肽文库的基因的简并文库产生组合文库，所述多肽文库的每一个多肽包含可能的ALK3多肽序列的至少一部分。例如，可以酶的方法将合成寡核苷酸的混合物与基因序列连接，使得可能的ALK3多肽核苷酸序列的简并组可作为个别多肽表达，或者作为一组较大的融合蛋白表达(例如用于噬菌体展示)。存在许多可从简并寡核苷酸序列产生可能的同源物文库的方法。简并基因序列的化学合成可在自动DNA合成仪中进行，合成基因然后与用于表达的合适载体连接。简并寡核苷酸的合成是本领域众所周知的(参见例如Narang，SA(1983)Tetrahedron 39:3; Itakura 等(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules,主编 AG Walton, Amsterdam :Elsevier，第 273-289页；Itakura等(1984) Annu. Rev. Biochem. 53 323 ；Itakura ^ (1984)Science 198 :1056 ;Ike 等(1983)Nucleic Acid Res. 11:477)。 这类技术已应用于其它蛋白质的定向进化中(参见例如Scott等(1990)kience 249 386-390 ；Roberts 等(199》PNAS USA 89 :2429-2433 ；Devlin 等(1990)kience 249 404-406 ；Cwirla 等(1990)PNAS USA 87 :6378-6382 ；以及美国专利号 5,223,409、 5，198，346 和 5，096，815)。或者，可利用其它诱变形式产生组合文库。例如，可采用以下诱变，通过筛选从文库中产生和分离ALK3多肽变体例如丙氨酸扫描诱变等(Ruf等(1994)Biochemistry 33 :1565-1572 ；Wang 等(1994) J. Biol. Chem. 269 :3095-3099 ；Balint 等(1993)Gene 137 109-118 ；Grodberg 等(1993)Eur. J. Biochem. 218 :597-601 ；Nagashima 等(1993)J. Biol. Chem. 268 :2888-2892 ；Lowman 等(1991)Biochemistry 30 :10832-10838 ；以及 Cunningham 等(1989) Science 244 1081-1085)，通过接头扫描诱变(Gustin 等(1993) Virology 193 653-660 ；Brown 等(1992)Mol. Cell Biol. 12 :2644-2652 ；McKnight 等(1982)Science 232 316)；通过饱和诱变(Meyers 等(1986) Science 232 :613)；通过 PCR 诱变(Leung 等 (1989)Method Cell Mol Biol 1 :11-19)；或者通过随机诱变，包括化学诱变等(Miller等 (1992)A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY ； 以及Greener等(1994) Mrategies in Mol Biol 7 =32-34) 接头扫描诱变，特别在组合背景下，是用于鉴定截短(生物活性)形式的ALK3多肽的有吸引力的方法。本领域已知以下各种技术，其用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物，和在这方面筛选具有某些性质的基因产物的cDNA文库。这类技术一般可适用于快速筛选由ALK3多肽的组合诱变所产生的基因文库。最广泛采用的筛选大型基因文库的技术通常包括将基因文库克隆至可复制的表达载体中，用所得载体文库转化合适的细胞，并在这样的条件下表达组合基因，即其中所需活性的检测有利于相对容易地分离编码被检测产物的基因的载体。优选的测定法包括BMP结合测定法和BMP介导的细胞信号转导测定法。在某些实施方案中，除天然存在于ALK3多肽中的任何修饰以外，本发明的ALK3多肽还可包含翻译后修饰。这类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。因此，修饰的ALK3多肽可含有非氨基酸成分，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸酯。可按照本文有关其它ALK3多肽变体方面所述，测试这类非氨基酸成分对ALK3多肽的功能性的作用。如果ALK3多肽在细胞中通过切割ALK3多肽的新生形式产生，则翻译后加工对于蛋白质的正确折叠和/或功能也可能十分重要。对于这类翻译后活性，不同的细胞(例如CH0、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或ΗΕΚ29!3)具有特定的细胞机器和特有机制，可选择不同的细胞以确保ALK3多肽的正确修饰和加工。在某些方面，ALK3多肽的功能变体或修饰形式包括具有ALK3多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域的融合蛋白。这类融合结构域的众所周知的实例包括但不限于聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重链恒定区(Fe)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可选择融合结构域以提供所需要的性质。例如，一些融合结构域特别可用于通过亲和层析法分离融合蛋白。为了亲和纯化的目的，使用用于亲和层析法的相关基质，例如谷胱甘肽缀合树脂、淀粉酶缀合树脂和镍缀合树脂或钴缀合树脂。这类基质的许多种可以“试剂盒”形式获得，例如Wiarmacia GST纯化系统和可与(HI&)融合配偶体一起使用的QIAexpress 系统Oliagen)。作为另一个实例，可选择融合结构域以促进ALK3多肽的检测。这类检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如GFP)以及“表位标签”，其通常是短肽序列，可获得其特异性抗体。易获得其特异性单克隆抗体的众所周知的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点，例如允许相关蛋白酶部分消化融合蛋白，从而从中释放重组蛋白的因子fe或凝血酶。然后，可通过随后的层析分离，从融合结构域分离出释放的蛋白质。在某些优选的实施方案中，ALK3多肽与体内稳定ALK3多肽的结构域(“稳定剂”结构域)融合。所谓“稳定”意指延长血清半寿期的任何方法，不论这是否是因为破坏减少、肾清除率降低或其它药代动力学作用。已知与免疫球蛋白的i^c部分的融合物赋予多种蛋白质所需要的药代动力学性质。同样，与人血清白蛋白的融合物可赋予所需要的性质。 可选择的融合结构域的其它类型，包括多聚化(例如二聚化、四聚化)结构域和功能结构域 (根据需要，赋予其它生物功能，例如进一步刺激骨生长或肌肉生长)。作为一个具体实例，本发明提供包含与Fc结构域(例如图5中的SEQ ID NO 5) 融合的ALK3可溶性胞外域的融合蛋白。Fc结构域的实例如下所示THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*任选Fc结构域在例如Asp465、赖氨酸322和Asn-434残基上具有一个或多个突变。在某些情况下，与野生型Fc结构域相比，具有这些突变的一个或多个(例如Asp-265 突变)的突变型Fc结构域与Fc γ受体结合的能力降低。在其它情况下，与野生型Fc结构域相比，具有这些突变的一个或多个(例如Asn-434突变)的突变型Fc结构域与MHC I类相关Fc受体(FcRN)结合的能力提高。要理解的是，融合蛋白的不同组分可以与所需功能性一致的任何方式排列。例如， 可将ALK3多肽置于异源结构域的C端，或者，可将异源结构域置于ALK3多肽的C端。ALK3 多肽结构域和异源结构域在融合蛋白中不一定邻接，在任一结构域的C端或N端或者在结构域之间可包括其它结构域或氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的ALK3多肽含有能够稳定ALK3多肽的一种或多种修饰。例如，这类修饰延长ALK3多肽的体外半寿期、延长ALK3多肽的循环半寿期或降低ALK3 多肽的蛋白酶降解。这类稳定修饰包括但不限于融合蛋白(包括例如包含ALK3多肽和稳定剂结构域的融合蛋白)、糖基化位点的修饰(包括例如糖基化位点加至ALK3多肽上)和糖部分的修饰(包括例如从ALK3多肽中脱去糖部分)。在融合蛋白的情况下，ALK3多肽与稳定剂结构域(例如IgG分子(例如Fc结构域))融合。本文使用的术语“稳定剂结构域” 不仅仅是指融合蛋白的情况下的融合结构域(例如Fe)，而且还包括非蛋白质修饰(例如糖部分)或非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇)。 在某些实施方案中，本发明可获得ALK3多肽的分离和/或纯化形式，其与其它蛋白酶分离或者基本上不含其它蛋白质。ALK3多肽一般可通过由重组核酸表达而产生。
3.编码ALK3多肽的核酸在某些方面，本发明提供编码任何ALK3多肽(例如可溶性ALK3多肽)(包括本文公开的片段、功能变体和融合蛋白)的分离核酸和/或重组核酸。例如，SEQ ID N0:2编码天然存在的人ALK3前体多肽，而SEQ ID NO 4编码ALK3的经加工的胞外域。主题核酸可呈单链或双链。这类核酸可以是DNA或RNA分子。可将这些核酸用于例如制备ALK3多肽的方法或作为直接治疗药物(例如在基因疗法中)。在某些方面，编码ALK3多肽的主题核酸进一步理解为包括是SEQ ID NO :2或4的变体的核酸。变体核苷酸序列包括因一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变体。在某些实施方案中，本发明提供与SEQID NO :2、4、12、13、15、16、19、21、24、27、32 或37有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的分离核酸序列或重组核酸序列。本领域普通技术人员应理解的是，与SEQ ID NO :2、4、12、13、15、16、19、21、24、 27、32 或 37 及 SEQ ID NO :2、4、12、13、15、16、19、21、24、27、32 或 37 的变体互补的核酸序
列也在本发明的范围内。在其它实施方案中，本发明的核酸序列可被分离、重组和/或与异源核苷酸序列融合，或者存在于DNA文库中。在其它实施方案中，本发明的核酸还包括以下核苷酸序列，其在高严格条件下与 SEQ ID N0:2、4、12、13、15、16、19、21、24、27、32 或 37 所指定的核苷酸序列、SEQ ID NO :2、 4、12、13、15、16、19、21、24、27、32或37的互补序列或者其片段杂交。如上所述，本领域的普通技术人员应容易地理解的是，可以改变促进DNA杂交的适当严格性条件。本领域的普通技术人员应容易地理解的是，可以改变促进DNA杂交的适当严格性条件。例如，可在6. Ox 氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下于约45°C进行杂交，接着2. Ox SSC于50°C洗涤。例如，可从约 2. Ox SSC于50°C的低严格性到约0. 2x SSC于50°C的高严格性，选择洗涤步骤的盐浓度。 另外，可从室温约(22°C)下的低严格性条件提高洗涤步骤的温度到约65°C下的高严格性条件。温度和盐两者均可改变，或者可保持温度或盐浓度恒定，而改变另一个变量。在一个实施方案中，本发明提供在6x SSC于室温的低严格性条件下杂交接着h SSC于室温洗涤的核酸。因遗传密码简并而不同于SEQ ID NO :2、4、12、13、15、16、19、21、24、27、32 或 37 所
示核酸的分离核酸也在本发明的范围内。例如，用不只一个三联体标示多个氨基酸。限定同一氨基酸的密码子或同义密码子(例如CAU和CAC是组氨酸的同义密码)，可导致不影响蛋白质的氨基序列的“沉默”突变。然而，预期在哺乳动物细胞中可存在确实引起主题蛋白质氨基酸序列改变的DNA序列多态性。本领域技术人员应理解的是，由于天然等位基因变化所致，在给定物种的个体之间，这些变化可存在编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(多至约3-5%的核苷酸)中。任何和所有这类核苷酸变化和所得氨基酸多态性也在本发明的范围内。在某些实施方案中，在表达构建体中，本发明的重组核酸可与一个或多个调节核苷酸序列有效连接。调节核苷酸序列一般可适于用于表达的宿主细胞。本领域已知用于各种宿主细胞的合适表达载体和合适调节序列的许多类型。所述一个或多个调节核苷酸序列通常可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列及增强子或激活物序列。本发明考虑本领域已知的组成型启动子或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或将不止一种启动子的元件组合的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞的附加体上，例如质粒，或者表达构建体可插入染色体中。在一个优选的实施方案中，表达载体含有选择标记基因以供转化宿主细胞的选择。选择标记基因是本领域众所周知的，并可随所采用的宿主细胞而改变。在本发明的某些方面，在包含编码ALK3多肽的核苷酸序列并与至少一个调节序列有效连接的表达载体中提供主题核酸。调节序列是本领域公认的，并被选择来直接表达ALK3多肽。因此，术语调节序列包括启动子、增强子和其它表达调控元件。示例性的调节序列参见 Goeddel ；Gene Expression Technology :Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA(1990)。例如，控制DNA序列表达的各种表达调控序列的任一种当与 DNA序列有效连接时，可用于这些载体以表达编码ALK3多肽的DNA序列。这类有用的表达调控序列包括例如SV40的早期启动子和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达受T7 RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的调控区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶启动子(例如Wio5)、酵母α-交配因子启动子、杆状病毒系统的多角体(polyhedron)启动子和已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列及其各种组合。应当理解的是，表达载体的设计可取决于以下因素，例如待转化的宿主细胞的选择和/或欲表达的蛋白质类型。此外，还应考虑载体拷贝数、控制该拷贝数的能力和由该载体编码的任何其它蛋白质的表达，例如抗生素标记。可通过将克隆的基因或其部分连接到适于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中来产生本发明的重组核酸。用于产生重组ALK3多肽的表达载体包括质粒和其它载体。例如，合适的载体包括用于在原核细胞(例如大肠杆菌 (E. coli))中表达的以下类型的质粒pBR322衍生质粒、pEMBL衍生质粒、pEX衍生质粒、 PBTac衍生质粒和pUC衍生质粒。一些哺乳动物表达载体既含有利于载体在细菌中繁殖的原核序列，又含有在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、 pSVaieo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo 和 pHyg 衍生载体是适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体的一些用来源于细菌质粒(例如PBR322)的序列修饰，以利于在原核细胞和真核细胞两者中复制和进行药物抗性选择。或者，可使用诸如牛乳头瘤病毒(BPV-I)或埃巴病毒(pHEBo、pREP衍生物和？20幻等病毒衍生物在真核细胞中瞬时表达蛋白质。其它病毒(包括反转录病毒)表达系统的实例可见下面基因疗法递送系统的描述。用于质粒制备和宿主生物转化中的各种方法是本领域众所周知的。对于原核和真核细胞两者的其它合适的表达系统以及通用重组方法，参见Molecular CloningA Laboratory Manual,第 3 版，编辑 Sambrook,Fritsch 禾口 Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 0在某些情况下，可能需要通过利用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。这类杆状病毒表达系统的实例包括PVL衍生载体(例如pVL1392、pVL1393和 pVL941)、pAcUW衍生载体 Gfi^npAcUWl)和 pBlueBac 衍生载体(例如含 β -gal WpBlueBac III)。在一个优选的实施方案中，可设计在CHO细胞中产生主题ALK3多肽的载体，例如 Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif. )>pcDNA4 (Invitrogen,Carlsbad, Calif.)和pCI-neo载体(!Iomega，Madison，Wise.)。显然，可使用主题基因构建体在培养基中繁殖的细胞中使主题ALK3多肽表达，例如产生蛋白质(包括融合蛋白或变体蛋白质) 以便纯化。本公开内容还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包括一种或多种主题 ALK3 多肽的编码序列(例如 SEQ ID NO :2、4、12、13、15、16、19、21、24、27、32 或 37)。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，可在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞 (例如利用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达本发明的ALK3多肽。其它合适的宿主细胞为本领域技术人员所知。因此，本发明还涉及产生主题ALK3多肽的方法。例如，可将用编码ALK3多肽的表达载体转染的宿主细胞培养在合适的条件下以允许表达ALK3多肽。可使ALK3多肽分泌并从细胞和含有ALK3多肽的培养基的混合物中分离出来。或者，可将ALK3多肽保持在胞质或在膜部分中，然后收获、裂解细胞并分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其它副产品。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。可采用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术，包括离子交换层析法、凝胶过滤层析法、超滤法、电泳、使用对ALK3多肽的特定表位有特异性的抗体进行免疫亲和纯化以及用结合与ALK3多肽融合的结构域的物质进行亲和纯化(例如A蛋白柱可用来纯化ALK3-FC融合物)，将主题ALK3多肽从细胞培养基、宿主细胞或两者中分离出来。在一个优选的实施方案中，ALK3多肽是含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。在一个优选的实施方案中，通过一系列的柱层析步骤达到纯化，包括例如任何顺序的下列三种或更多种方法A蛋白层析法、Q琼脂糖凝胶层析法、苯基琼脂糖凝胶层析法、大小排阻层析法和阳离子交换层析法。纯化可用病毒过滤和缓冲液更换来完成。正如本文所证实的一样，将ALK3-hFc蛋白纯化到通过大小排阻层析法测定的> 98% 的纯度和通过SDS PAGE测定的>95%的纯度。这种纯度水平足以在小鼠中达到所需要的对骨的作用，以及在小鼠、大鼠和非人类灵长类动物中达到可接受的安全特征。在另一个实施方案中，编码纯化前导序列(例如重组ALK3多肽的所需部分的N端上的聚-(His)/肠激酶切割位点序列)的融合基因，可允许使用Ni2+金属树脂通过亲和层析法对表达的融合蛋白进行纯化。然后，纯化前导序列随后可通过肠激酶处理除去，得到纯化的 ALK3 多肽(例如参见 Hochuli 等(1987) J. Chromatography 411 :177 ；以及 Janknecht 等，PNAS USA 88 :8972)。制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接按照常规技术进行，采用用于连接的平端或交错端，限制性内切酶消化以提供合适末端，适当时补平黏性末端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接，并进行酶促连接。在另一个实施方案中，融合基因可通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪。或者，可使用在两
21个连续基因片段之间产生互补突出端的锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述基因片段随后可退火得到嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，编辑 Ausubel 等，John Wiley & Sons :1992)。4.备诜的BMP和ALK3拮抗剂本文提供的数据表明，BMP-ALK3信号转导的拮抗剂可用于促进骨生长和骨矿化。 虽然可溶性ALK3多肽，特别是ALK3-FC，是优选的拮抗剂，而且虽然这类拮抗剂可通过BMP 拮抗作用以外的机制影响骨(例如BMP抑制可以是物质抑制多种分子(可能包括TGF-β 超家族的其它成员)的活性的趋势的指示，且这类共同抑制可导致所需要的对骨的作用)， 预期BMP-ALK3拮抗剂的其它类型是有用的，包括抗BMP (例如BMP2或BMP4)抗体、抗ALK3 抗体、、抑制ALK3、BMP2或BMP4产生的反义核酸、RNAi核酸或核酶核酸和BMP或ALK3的其它抑制剂，特别是破坏BMP-ALK3结合的抑制剂。与ALK3多肽(例如可溶性ALK3多肽)特异性反应并且与ALK3多肽竞争结合配体或者以其它方式抑制ALK3介导的信号转导的抗体，可用作ALK3多肽活性的拮抗剂。同样，与BMP多肽特异性反应并且破坏ALK3结合的抗体也可用作拮抗剂。可通过标准方案，使用来源于ALK3多肽或BMP多肽的免疫原，制备抗蛋白质/抗月太抗血清或单克隆抗体(参见例如Antibodies :A Laboratory Manual, Harlow禾口 Lane编辑(Cold Spring Harbor Press :1988))。哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔可用免疫原形式的ALK3多肽、能够诱导抗体应答的抗原片段或融合蛋白免疫接种。赋以蛋白质或肽免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域众所周知的其它技术。可在佐剂存在下给予ALK3或BMP 多肽的免疫原性部分。可通过检测血浆或血清中的抗体效价监测免疫接种的过程。可应用标准ELISA或其它免疫测定法用免疫原作为抗原评价抗体水平。在动物用ALK3多肽的抗原制备物进行免疫接种后，可获得抗血清，如有需要，可从血清中分离出多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，可从经免疫接种的动物中收获产抗体细胞(淋巴细胞)，并通过标准体细胞融合方法与永生化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合，得到杂交瘤细胞。这类技术是本领域众所周知的，包括例如杂交瘤技术(最初由Kohler和 Milstein, (1975) Nature，256 :495-497 开发)；人 B 细胞杂交瘤技术(Kozbar 等(1983) Immunology Today，4 :72)；以及产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer herapy, Alan R. Liss, Inc.第 77-96 页)。可按免疫化学法筛选杂交瘤细胞以产生与ALK3多肽特异性反应的抗体，并从包含这类杂交瘤细胞的培养物中分离单克隆抗体。本文使用的术语“抗体”旨在包括其同样与主题多肽特异性反应的片段。可采用常规技术使抗体片段化，并以与上述用于完整抗体同样的方法针对效用筛选片段。例如，可通过用胃蛋白酶处理抗体得到F(ab)2片段。可处理所得F(ab)2片段，以将二硫键还原得到 Fab片段。本发明的抗体还旨在包括双特异性、单链、嵌合、人源化和完整人分子，其具有由抗体的至少一个⑶R区提供的对ALK3或BMP多肽的亲和力。抗体还包含与之连接并且能够检出的标记(例如标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。在某些实施方案中，抗体是重组抗体，该术语包括部分通过分子生物学技术产生的任何抗体，包括CDR移植抗体或嵌合抗体、人抗体或从文库选择抗体结构域装配的其它抗体、单链抗体和单一结构域抗体(例如人Vh蛋白或骆驼(camelid) Vhh蛋白)。在某些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体，而在某些实施方案中，本发明可获得产生新抗体的方法。例如，产生与ALK3多肽或BMP多肽特异性结合的单克隆抗体的方法，可包括给予小鼠有效刺激可检测的免疫应答的量的包含抗原多肽的免疫原性组合物，由小鼠得到产抗体细胞(例如得自脾的细胞)，并将产抗体细胞与骨髓瘤细胞融合，得到产抗体杂交瘤，测试产抗体杂交瘤以鉴定产生与抗原特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤。一旦得到所述杂交瘤， 便可将杂交瘤在细胞培养物中增殖，任选在杂交瘤衍生细胞产生与抗原特异性结合的单克隆抗体的培养条件下。可从细胞培养物中纯化出单克隆抗体。正如本领域通常理解的一样，用于提及抗体的形容词“与......特异性反应的”
意指抗体在目标抗原(例如ALK3多肽)与其它非目标抗原之间有足够选择性，使得所述抗体至少可用于在特定的生物样品类型中检测目标抗原的存在情况。在某些使用抗体的方法中，例如治疗应用，在结合中可能需要较高程度的特异性。单克隆抗体通常具有有效区分所需抗原和交叉反应多肽的较大趋势(与多克隆抗体相比)。影响抗体抗原相互作用的特异性的一个特征是抗体对抗原的亲和力。虽然可在不同亲和力范围内达到所需特异性，但是优选的抗体一般具有约10_6、10_7、10_8、10_9或更少的亲和力(解离常数)。假定在BMP和 ALK3之间有非常紧密的结合，则预期中和抗BMP或抗ALK3抗体一般可具有10_9或更低的解离常数。另外，用于筛选抗体以鉴定所需要的抗体的技术可影响所得抗体的性质。例如，如果抗体被用于在溶液中结合抗原，则可能需要测试溶液结合。可获得用于测定抗体和抗原之间的相互作用以鉴定特别需要的抗体的各种不同技术。这类技术包括ELISA、表面等离振子共振结合测定法(例如Biacore 结合测定法，Biacore AB, Uppsala, Sweden)、夹心测定法(例如顺磁珠系统，IGEN International, Inc. , Gaithersburg, Maryland)、蛋白质印迹、 免疫沉淀测定法和免疫组织化学法。作为BMP或ALK3拮抗剂的核酸化合物类别的实例包括反义核酸、RNAi构建体和催化性核酸构建体。核酸化合物可以是单链或双链的。双链化合物还可包括其中链的一条或另一条是单链的突出端区或非互补区。单链化合物可包括自我互补区，意指化合物形成具有双螺旋结构区的所谓“发夹”或“茎-环”结构，。核酸化合物可包含以下核苷酸序列，其与由不超过全长ALK3核酸序列或BMP核酸序列的1000个、不超过500个、不超过250个、不超过100个或不超过50、35、30、25、22、20或18个核苷酸组成的区域互补。互补区优选可为至少8个核苷酸，任选至少10个或至少15个核苷酸，任选介于15和25个核苷酸。互补区可落入靶转录物的内含子、编码序列或非编码序列中，例如编码序列部分。核酸化合物的长度一般可为约8-约500个核苷酸或碱基对，任选长度可为约14-约50个核苷酸。核酸可以是DNA(特别用作反义物)、RNA或RNA:DNA杂合体。任一条链可包括DNA和RNA的混合物以及不容易归类为DNA或RNA的修饰形式。同样，双链化合物可以是DNA:DNA、DNA:RNA或 RNA RNA,任一条链还可包括DNA和RNA的混合物，以及不易归类为DNA或RNA的修饰形式。 核酸化合物可包括各种修饰的任一种，包括骨架(天然核酸中的糖-磷酸酯部分，包括核苷酸间键)或碱基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一种或多种修饰。反义核酸化合物的长度可优选为约15-约30个核苷酸，并且通常含有一种或多种修饰以改进特性，例如在血清、细胞或化合物很可能被递送至的部位(例如在口服递送化合物的情况下为胃，而对吸入化合物而言为肺)中的稳定性。在RNAi构建体的情况下，与靶转录物互补的链一般是RNA或其修饰物。另一条链可以是RNA、DNA或任何其它变异物。双链或单链“发夹” RNAi 构建体的双链体部分的长度优选可为18-40个核苷酸，任选长度为约21-23个核苷酸，只要它用作切酶底物即可。催化性核酸或酶促核酸(enzymatic nucleic acid)可以是核酶或 DNA酶，并且还可含有修饰形式。当在生理条件下和在其中无义或有义对照几乎没有作用或者没有作用的浓度下与细胞接触时，核酸化合物可抑制靶标表达达约50 %、75 %、90 %或更高。测试核酸化合物的作用的优选浓度为1、5和10微摩尔。也可测试核酸化合物对例如骨生长和矿化的作用。5.筛诜测定法在某些方面，本发明涉及ALK3多肽(例如可溶性ALK3多肽)和BMP多肽鉴定作为BMP-ALK3信号转导途径的激动剂或拮抗剂的化合物(物质)的用途。可对通过这种筛选法鉴定的化合物进行测试以评价其体外调节骨生长或矿化的能力。任选还可在动物模型中对这些化合物进行测试以评价其体内调节组织生长的能力。有许多针对通过靶向BMP和ALK3多肽调节组织生长筛选治疗药物的方法。在某些实施方案中，可进行高通量的化合物筛选以鉴定干扰BMP或ALK3介导的对骨的作用的物质。在某些实施方案中，进行所述测定法以筛选和鉴定特异性抑制或降低ALK3多肽与BMP 的结合的化合物。或者，所述测定法可用于鉴定促进ALK3多肽与BMP结合的化合物。在又一个实施方案中，可通过其与BMP或ALK3多肽相互作用的能力来鉴定化合物。各种测定形式便可满足需要，然而根据本公开内容，本领域的普通技术人员仍应了解未在本文明确描述的测定形式。如本文所述，可通过任何组合化学方法产生本发明的试验化合物(物质)。或者，主题化合物可以是天然存在的体内或体外合成的生物分子。待测定其起组织生长调节剂作用的能力的化合物(物质)可通过例如细菌、酵母、植物或其它生物产生(例如天然产物)、以化学法产生(例如小分子，包括肽模拟物)或以重组法产生。本发明考虑的试验化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素和核酸分子。在一个具体的实施方案中，试验物质是有机小分子，分子量小于约2，000道尔顿。发明的试验化合物可以单一的分散实体提供，或者以较复杂的文库提供，例如通过组合化学制备的文库。这些文库可包含例如醇、烷基商化物、胺、酰胺、酯、醛、醚和有机化合物的其它类别。向试验系统中提供的试验化合物可呈分离形式或作为化合物的混合物， 尤其在最初的筛选步骤中。任选化合物可任选用其它化合物衍生化并具有利于化合物分离的衍生化基团。衍生化基团的非限制实例包括生物素、荧光素、洋地黄毒苷(digoxygenin)、 绿色荧光蛋白、同位素、聚组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S转移酶(GST)、可光活化的交联剂或其任何组合。在测试化合物文库和天然提取物的许多药物筛选程序中，需要高通量测定法以便在给定时间内使研究的化合物的数目最大化。在无细胞系统(例如可用纯化的或半纯化的蛋白质衍生)中进行的测定法，常常优选作为“初步”筛选，因为可产生无细胞系统以允许快速显现和相对容易地检测由试验化合物介导的分子靶标中的改变。此外，在体外系统中一般可忽略试验化合物的细胞毒性或生物利用度的作用，测定法反而主要集中在药物对分子靶标的作用，如可表现在ALK3多肽和BMP之间结合亲和力的改变。仅举例来说，在本发明的示例性筛选测定法中，将目标化合物与通常能够与BMP 结合的分离和纯化的ALK3多肽接触。然后向化合物和ALK3多肽的混合物中加入含有ALK3配体的组合物。ALK3/BMP复合体的检测和定量测定提供用于测定化合物抑制(或增强)在 ALK3多肽和BMP之间形成复合体的功效的手段。可通过从使用试验化合物的不同浓度所得到的数据绘制剂量反应曲线，来评价化合物的功效。此外，还可进行对照测定，以提供比较基线。例如，在对照测定中，将分离和纯化的BMP加入含有ALK3多肽的组合物中，在缺乏试验化合物时，定量测定ALK3/BMP复合体的形成。应理解的是，一般可以改变可使反应物混合的顺序，并且可以同时混合。此外，可使用细胞提取物和裂解物替换经纯化的蛋白质以提供合适的无细胞测定系统。可通过各种技术，检测ALK3多肽和BMP之间的复合体形成。例如，可使用例如可检测标记的蛋白质，例如放射性标记(例如^、、、吨或3!!)、荧光标记(例如FITC)或酶标记的ALK3多肽或BMP，通过免疫测定或通过层析检测，定量测定复合体形成的调节。在某些实施方案中，本发明考虑在直接或间接测定ALK3多肽与其结合蛋白间的相互作用的程度中，采用荧光偏振测定法和荧光共振能量转移(FRET)测定法。另外，其它检测方式，例如基于光波导(PCT公布号WO 96/26432和美国专利号5，677，196)、表面等离振子共振(SPR)、表面电荷传感器和表面力传感器的检测方式都适于本发明的许多实施方案。此外，本发明考虑采用相互作用陷阱测定法(interaction trap assay)，亦称“双杂合测定法(two hybrid assay)”，鉴定干扰或增强ALK3多肽与其结合蛋白间的相互作用的物质。参见例如美国专利号 5，283，317 ；Zervos 等(199 Cell 72 :223-232 ；Madura 等 (1993)J Biol Chem 268 :12046-12054 ；Bartel ^ (1993)Biotechniques 14 :920-924;以及Iwabuchi等(199 Oncogene 8:1693-1696)。在一个具体的实施方案中，本发明考虑采用反相双杂交系统(reverse two hybrid system)鉴定离解ALK3多肽与其结合蛋白间的相互作用的化合物(例如小分子或肽)。参见例如Vidal和Legrain，(1999)Nucleic Acids Res 27 :919-29 ;Vidal 和 Legrain，(1999) Trends Biotechnol 17 :374-81 ；以及美国专利号 5，525，490,5, 955，280 和 5，965，368。在某些实施方案中，通过其与本发明的ALK3或BMP多肽相互作用的能力来鉴定主题化合物。化合物和ALK3或BMP多肽间的相互作用可以是共价的或非共价的。例如，可采用体外生化方法在蛋白质水平上鉴定这类相互作用，包括光致交联、放射性同位素标记配体结合和亲和层析法(Jakoby WB等，1974，Methods in Enzymology 46:1)。在某些情况下，可在基于机制的测定法中筛选化合物，例如检测与BMP或ALK3多肽结合的化合物的测定法。这可包括固相或液相结合事件。或者，可将编码BMP或ALK3多肽的基因与报道系统 (例如半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白)转染至细胞，优选通过高通量筛选针对文库进行筛选或用文库的各个成员进行筛选。可采用基于其它机制的结合测定法，例如检测自由能变化的结合测定法。结合测定法可用固定于孔、珠粒或芯片或被固定化抗体俘获或被毛细管电泳分离的靶标进行。一般可采用比色法或荧光法或表面等离振子共振检测结合的化合物。在某些方面，本发明提供用于调节(刺激或抑制)骨形成和增加骨质量的方法和物质。因此，可在体外或体内在完整细胞或组织中测定所鉴定的任何化合物，以证实其调节骨生长或矿化的能力。可将本领域已知的各种方法用于此目的。例如，可在基于细胞的测定法中，通过测定Msx2的诱导或骨原细胞分化成成骨细胞，来测定ALK3或BMP多肽或试验化合物对骨或软骨生长的作用(参见例如Daluiski等， Nat Genet. 2001，27(1) :84-8 ;Hino 等，Front Biosci. 2004，9 :1520-9)。基于细胞的测定法的另一个实例包括分析间充质祖细胞和成骨细胞中主题ALK3或BMP多肽和试验化合物的成骨活性。举例来说，可构建表达BMP或ALK3多肽的重组腺病毒以感染多能间充质祖细胞C3H10T1/2细胞、前成骨细胞C2C12细胞和成骨细胞TE-85细胞。然后通过测定碱性磷酸酶、骨钙蛋白和基质矿化的诱导，来测定成骨活性(参见例如Cheng等，J bone Joint Surg Am. 2003，85-A(8) :1544-52)。本发明还考虑测定骨或软骨生长的体内测定法。例如，Namkung-Matthai等， Bone, 28 =80-86(2001)公开了大鼠骨质疏松模型，其中研究了骨折后早期期间的骨修复。 Kubo 等，Meroid Biochemistry & Molecular Biology,68 :197-202(1999)也公开了大鼠骨质疏松模型，其中研究了骨折后晚期期间的骨修复。Andersson等，J. Endocrinol. 170 5四-537披露了小鼠骨质疏松症模型，其中小鼠卵巢被切除，这引起小鼠丧失大量的骨矿物质含量和骨矿物质密度，其中骨小梁失去大约50%的骨矿物质密度。可通过给予诸如甲状旁腺激素等因子，提高切除卵巢小鼠的骨密度。在某些方面，本发明采用本领域已知的骨折愈合测定法。这些测定法包括骨折技术、组织学分析和生物力学分析，可参见例如美国专利号6，521，750，其通过引用其有关引起骨折以及测定骨折程度的实验方案和修复方法的公开内容以其整体结合。6.示例件治疗应用在某些实施方案中，本发明的BMP-ALK3拮抗剂(例如ALK3多肽)可用于治疗或预防与骨损伤(不论是例如经由破裂、丧失还是去矿化引起的)。有关的疾病或病况，在某些实施方案中，本发明提供通过给予有需要的个体治疗有效量的BMP-ALK3拮抗剂，特别是 ALK3多肽，治疗或预防所述个体的骨损伤的方法。考虑到对骨吸收和形成的双重作用的潜力，这类化合物可用于目前用同化激素类药(例如甲状旁腺激素及其衍生物)或抗吸收药 (例如二膦酸盐)治疗的多种疾病。在某些实施方案中，本发明提供通过给予有需要的个体治疗有效量的BMP-ALK3拮抗剂，特别是ALK3多肽，来促进所述个体的骨生长或矿化的方法。这些方法任选目的在于动物(更优选人)的治疗性和预防性治疗。在某些实施方案中， 本公开内容提供BMP-ALK3拮抗剂(特别是可溶性ALK3多肽和靶向BMP或ALK3的中和抗体)在治疗与低骨密度或骨强度降低相关的病症中的用途。本文使用的“预防”病症或病况的治疗药是指以下化合物，其在统计样本中，与未治疗对照样品相比，减少治疗样品中的病症或病况的发生，或者与未治疗对照样品相比，延缓病症或病况的一种或多种症状发作或者降低病症或病况的一种或多种症状的严重程度。 本文使用的术语“治疗”包括指定病况的预防或者病况一旦确立便改善或根除病况。在任一情况下，可通过医师给出的诊断和给予治疗药物的预期结果来分辨预防或治疗。本公开内容提供诱导骨和/或软骨形成、预防骨丢失、增加骨矿化或预防骨去矿化的方法。例如，主题BMP-ALK3拮抗剂已用于治疗骨丢失病症(例如骨质疏松症)及人和其它动物的骨折和软骨缺陷或其它骨缺陷、损伤和病症的愈合。ALK3或BMP多肽可用于诊断为亚临床低骨密度的患者，作为针对形成骨质疏松症的预防措施。在一个具体的实施方案中，本发明的方法和组合物可在人和其它动物的骨折和软骨缺陷的愈合中具有医疗用途。主题方法和组合物还可在闭合性和开放性骨折复位术以及改进人工关节固定方面具有预防用途。由成骨剂(osteogenic agent)诱导的从头骨形成有助于先天性、创伤诱发的或肿瘤切除术诱发的颅面缺陷的修复，并且也可用于美容整形手术。在某些情况下，主题BMP-ALK3拮抗剂可提供吸引成骨细胞、刺激成骨细胞生长或诱导成骨细胞祖细胞分化的环境。本发明的BMP-ALK3拮抗剂还可用于治疗骨质疏松症。Rosen 等(编辑)Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism,第 7 版· American Society for Bone and Mineral Research, Washington D. C.(通过引用结合到本文)详尽论述了可用ALK3-BMP拮抗剂进行治疗的骨病。本文提供了部分名单。本发明的方法和组合物可用于特征是骨丢失或引起骨丢失的病况，例如骨质疏松症(包括继发性骨质疏松症)、甲状旁腺功能亢进、慢性肾病-矿物质和骨异常(chronic kidney disease mineral bone disorder)、性激素剥夺或切除(例如雄激素和/或雌激素)、糖皮质激素治疗、类风湿性关节炎、重度烧伤、甲状旁腺功能亢进、高钙血症、低钙血症、低磷酸盐血症、骨软化(包括瘤源性软骨病)、高磷酸盐血症、维生素D缺乏症、甲状旁腺功能亢进(包括家族性甲状旁腺功能亢进)和假性甲状旁腺功能减退症、肿瘤骨转移、肿瘤或化学疗法引起的骨丢失、骨与骨髓肿瘤(例如多发性骨髓瘤)、缺血性骨病、牙周病和口腔骨丢失、库欣病(Cushing's disease)、佩吉特病(Paget’ s disease)、甲状腺毒症、慢性腹泻状态或吸收不良、肾小管性酸中毒或神经性厌食症。本发明的方法和组合物还可用于以骨形成或愈合失败为特征的病况，包括不愈合骨折、在其它方面愈合缓慢的骨折、胎儿和新生儿骨发育异常(例如低钙血症、高钙血症、钙受体缺陷和维生素D缺乏症)、骨坏死(包括颂骨坏死)和成骨不全。另外，合成代谢作用可引起这类拮抗剂减轻与骨损伤或侵蚀相关的骨疼痛。由于抗吸收作用，这类拮抗剂可用于治疗异常骨形成的病症， 例如成骨细胞肿瘤转移(例如原发性前列腺癌或乳癌有关的肿瘤转移)、骨原性骨肉瘤、骨硬化症、进行性骨干发育异常、骨内膜骨质增生(endosteal hyperostosis)、全身脆弱性骨硬化和肢骨纹状肥大。可治疗的其它病症包括纤维性结构不良和软骨发育不全。除以上论述以外，具有任一种以下特征的人可以为用ALK3拮抗剂治疗的候选人 绝经后女性且未采用雌激素或其它激素替代疗法；有个人或母亲髋骨折史或吸烟史的人； 个高(超过5英尺7英寸)或瘦(小于125磅)的绝经后女性；患有骨丢失相关临床病况的男性；使用已知引起骨丢失的药物的人，包括皮质留类(例如!Prednisone )、各种抗癫痫药(例如Dilantin 和某些巴比妥类)或高剂量甲状腺替代药物；患有1型糖尿病、肝病、 肾病、骨质疏松症家族史的人；患有骨更新的人(例如尿样中胶原过量)；患有甲状腺病况 (例如甲状腺功能亢进)的人；仅轻微创伤后经历骨折的人；具有脊椎骨折χ射线证据或骨质疏松症的其它体征的人。骨质疏松症(一般而言意指低骨密度或强度的状态)可由多种因素引起或与多种因素有关。作为女性，特别是绝经后女性，体重轻和过着久坐生活方式的均是骨质疏松症的风险因素(导致骨折风险的骨矿物质密度丢失)。骨质疏松症还可以是与另一种病症有关的病况的结果或者是因使用某些药物的结果。由药物或另一种医学病况引起的骨质疏松症称为继发性骨质疏松症。在称为库欣病的病况中，由机体产生的过量皮质醇引起骨质疏松症和骨折。与继发性骨质疏松症有关的最普通的药物是皮质留类，像由肾上腺天然产生的激素皮质醇一样起作用的药物类别。 虽然骨骼发育需要适当水平的甲状腺激素(其由甲状腺产生)，但过量的甲状腺激素可随时间减少骨质量。当患有肾病的人(特别是经历透析的人)摄入高剂量含有铝的抗酸剂时，可导致骨丢失。可引起继发性骨质疏松症的其它药物包括用于预防癫痫发作的苯妥英 (Dilantin)和巴比妥类；甲氨蝶呤(Rheumatrex，Immunex，R)lex PFS)，一种用于某些形式的关节炎、癌症和免疫疾病的药物；环孢菌素(Sandimmune，Neoral)，一种用于治疗某些自身免疫病和抑制器官移植患者的免疫系统的药物；促黄体激素释放激素激动剂(Lupron、 hladex)，用于治疗前列腺癌和子宫内膜异位症；肝素(Calciparine、Liquaemin)，一种抗凝药；以及消胆胺(Questran)和考来替泊(Colestid)，用于治疗高胆固醇。由癌症疗法引起的骨丢失是普遍认可的，称为癌症疗法诱发性骨丢失(CTIBL)。骨转移可在骨中产生空腔，这可用BMP-ALK3拮抗剂治疗来纠正。任选本文公开的BMP-ALK3拮抗剂，特别是可溶性ALK3可用于癌症患者。某些肿瘤 (例如前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、多发性骨髓瘤或引起甲状旁腺功能亢进的任何肿瘤)患者由于肿瘤诱发性骨丢失以及骨转移和治疗药物所致处于骨丢失的高风险中。即使在没有骨丢失或骨转移的证据的情况下，这类患者也可用BMP-ALK3拮抗剂治疗。还可监测患者的骨丢失或骨转移的迹象，并可在指示物表明风险增加的情况下，用BMP-ALK3拮抗剂治疗。一般采用DEXA扫描评价骨密度的改变，同时可使用骨重建的指示物评价骨转移的可能性。可监测血清标志物。骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)是一种存在于成骨细胞中的酶。患有骨转移和导致骨重建增加的其它病况的患者中，BSAP的血液水平升高。骨钙蛋白和前胶原肽也与骨形成和骨转移有关。在患有由前列腺癌引起的骨转移的患者中检出BSAP增加，在乳癌所致骨转移中增加的程度较低。在已转移至骨的前列腺癌中，骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)水平高，但在由膀胱癌、皮肤癌、肝癌或肺癌所致骨转移中，骨形态发生蛋白-7不高。I型羧端端肽(ICTP)是存在于骨吸收期间形成的胶原中的交联物。因为骨不断破坏和重建，ICTP可存在于整个机体中。然而，在骨转移部位，水平可显著高于正常骨的区域。在由前列腺癌、 肺癌和乳癌所致骨转移中存在高水平的ICTP。另一种胶原交联物，I型N端端肽(NTx)在骨更新期间随ICTP—起产生。在由许多不同类型的癌症(包括肺癌、前列腺癌和乳癌)引起的骨转移中，NTx的量增加。同样，NTx的水平随骨转移进程提高。因此，这种标志物既可用于检测转移，又可测定疾病的程度。吸收的其它标志物包括吡啶诺林(pyridinoline)和脱氧吡啶诺林。吸收标志物或骨转移标志物的任何增加都表明患者需要BMP-ALK3拮抗剂治疗。在另一个实施方案中，BMP-ALK3拮抗剂可用于患有慢性肾病-矿物质和骨异常 (CKD-MBD)(—种由肾病引起的有关骨骼、心血管和矿物质代谢病症的广泛综合征)的患者。CKD-MBD包括各种骨骼病理，常常称为肾性骨营养不良(ROD)，其是用BMP-ALK3拮抗剂治疗的一个优选实施方案。根据不同发病因素的相对作用，ROD表现为骨重建的不同病理形式(Hruska 等，2008, Chronic kidney disease mineral bone disorder (CKD-MBD)(慢性肾病-矿物质和骨异常(CKD-MBD))；载于Rosen等(编辑)Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism，第 7 片反，American Society for Bone and Mineral Research,Washington D. C.，第；343_349 页)。在所述范围内的一端是伴发尿毒症性骨营养不良和骨更新低下的R0D，其特征在于活动性重建部位少、骨形成深度抑制和骨吸收低下。在另一端端是伴发甲状旁腺功能亢进、骨更新高和纤维性骨炎的ROD。 考虑到BMP-ALK3拮抗剂同时发挥合成代谢和抗吸收作用，这些药物可用于在ROD病理谱内的患者。BMP-ALK3拮抗剂可与其它药剂一同给予。可通过给予单一共制剂、同时给予或在不同时间给予实现共同给药。BMP-ALK3拮抗剂如果与其它骨活性剂一起给予，可以是特别有利的。患者可获益于同时接受BMP-ALK3拮抗剂和服用钙补充剂、维生素D、适当运动和/ 或在一些情况下的其它药物。其它药物的实例包括二膦酸盐(阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐和利塞膦酸盐)、降钙素、雌激素、甲状旁腺激素和雷洛昔芬。二膦酸盐(阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐和利塞膦酸盐)、降钙素、雌激素和雷洛昔芬影响骨重建周期，被归类为抗吸收药物。骨重建包括两个截然不同的阶段骨吸收和骨形成。抗吸收药物减慢或终止骨重建周期的骨吸收部分，但不减慢该周期的骨形成部分。因此，以比骨吸收较大的速度持续新的形成，而且骨密度可随时间增加。特立帕肽，一种甲状旁腺激素形式，在骨重建周期中提高骨形成的速度。阿仑膦酸盐获准用于预防(5mg/天或一周一次35mg)和治疗(IOmg/天或一周一次 70mg)绝经后骨质疏松症。阿仑膦酸盐减少骨丢失，增加骨密度和降低脊柱、腕和髋骨折的风险。阿仑膦酸盐还获准用于治疗由于长期使用这些药物(即泼尼松和可的松)所致男性和女性的糖皮质激素诱发性骨质疏松症及用于治疗男性骨质疏松症。阿仑膦酸盐加维生素 D获准用于治疗绝经后女性的骨质疏松症(70mg —周一次加维生素D)，以及用于治疗以改善患有骨质疏松症的男性的骨质量。伊班膦酸盐获准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。 一月一次以丸剂服用(150mg)，伊班膦酸盐应在每个月的同一天服用。伊班膦酸盐减少骨丢失、增加骨密度和降低脊柱骨折风险。利塞膦酸盐获准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。 每日(5mg剂量)或每周(35mg剂量或35mg剂量与钙)服用，利塞膦酸盐减缓骨丢失，增加骨密度并降低脊柱和非脊柱骨折的风险。利塞膦酸盐还获准用于男性和女性以预防和/或治疗由于长期使用这些药物(即泼尼松或可的松)引起的糖皮质激素诱发性骨质疏松症。 降钙素是天然存在的参与钙调节和骨代谢的激素。在绝经期后5年以上的女性中，降钙素减缓骨丢失、增加脊柱骨密度，并可缓解骨折相关疼痛。降钙素降低脊柱骨折的风险。可以注射剂(每日50-100IU)或鼻腔喷雾剂(每日200IU)获得降钙素。雌激素疗法(ET)/激素疗法(HT)获准用于预防骨质疏松症。研究表明，ET减少骨丢失，提高脊柱和髋两者的骨密度，并降低绝经后女性的髋和脊柱骨折的风险。最常以递送约每日0.3mg的低剂量或约每日0. 625mg的标准剂量的丸剂或皮肤贴剂形式给予ET，甚至在70岁以后开始给予时也有效。当只服用雌激素时，可能增加女性发生子宫内膜癌的风险。为了排除这种风险，医疗保健人员将激素孕酮与雌激素(激素替代疗法或HT)联合开给有完整子宫的女性。ET/HT缓解绝经期症状，并显示对骨健康具有有益作用。副作用可包括阴道出血、乳房触痛、情绪障碍和胆囊疾病。雷洛昔芬，一天60mg，获准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。它来自一类针对提供雌激素的有益作用而无其潜在缺点开发的称为选择性雌激素受体调节剂(SERM) 的药物类别。雷洛昔芬提高骨质量，并降低脊柱骨折风险。尚未获得的数据表明，雷洛昔芬可降低髋骨折和其它非脊柱骨折的风险。特立帕肽，一种甲状旁腺激素形式，获准用于治疗处于高骨折风险的绝经后女性和男性的骨质疏松症。这种药物刺激新骨形成，并显著增加骨矿物质密度。在绝经后女性中，在脊柱、髋、足、肋和腕中注意到骨折减少。在男性中，在脊柱中注意到骨折减少，但没有足够的数据评价其它部位的骨折减少。特立帕肽以每日注射剂自我给药长达M个月。7.药物组合物
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在某些实施方案中，将本发明的BMP-ALK3拮抗剂(例如ALK3多肽)与药学上可接受的载体一起配制。例如，ALK3多肽可单独给予或作为药物制剂(治疗组合物)的组分给予。可以用于人或兽药的任何适宜的方式配制主题化合物用于给药。在某些实施方案中，本发明的治疗方法包括全身或者以植入物或装置局部给予组合物。当给药时，用于本发明的治疗组合物当然是无致热原的生理学上可接受的形式。还可任选包含在上述组合物中的ALK3拮抗剂以外的治疗上有用的物质，可与本发明方法的主题化合物(例如ALK3多肽)同时或序贯给予。通常可胃肠外给予ALK3拮抗剂。适于胃肠外给予的药物组合物可包含一种或多种ALK3多肽以及一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散体、混悬液或乳液或者无菌粉剂(所述粉剂可在临用前用无菌注射用溶液或分散体复溶)，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。可用于本发明药物组合物的合适水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和注射用有机酯(例如油酸乙酯)。可通过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过保持所需要的粒径，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。另外，组合物可以递送至靶组织部位(例如骨)的形式装入胶囊或注射。在某些实施方案中，本发明的组合物可包含基质，其能够将一种或多种治疗化合物(例如ALK3多肽)递送到靶组织部位(例如骨)，为发育组织提供结构，并且最好能够被吸收进体内。例如，基质可提供慢释的ALK3多肽。这类基质可以形成目前用于其它植入医学应用的材料。基质材料的选择取决于生物相容性、生物降解能力、机械性能、美容外观和界面性质。主题组合物的具体应用将界定适当的制剂。组合物可能的基质可以是生物可降解的和化学上确定的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它可能的材料是生物可降解的和生物学上明确限定的，例如骨或真皮胶原。其它基质由纯的蛋白质或胞外基质组分组成。其它可能的基质是非生物可降解的和化学上确定的，例如烧结羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。基质可由任何上述类型的材料的组合组成，例如聚乳酸和羟磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷可在组成方面改变，例如呈钙-铝酸盐-磷酸盐，并进行加工以改变孔径、颗粒大小、颗粒形状和生物降解能力。在某些实施方案中，本发明的方法可以例如以下形式口服给予胶囊剂、扁囊剂、 丸剂、片剂、锭剂(使用调味基料，一般为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、散剂、颗粒剂，或者作为水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂、或作为水包油或油包水乳剂、或作为酏剂或糖浆剂、或作为软锭剂(使用惰性基料，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，各自含有预定量的物质作为活性成分。药剂还可作为大丸剂、药糖剂或糊剂给予。在口服给药的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，可将一种或多种本发明的治疗化合物与一种或多种药学上可接受的载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下的任一种(1)填充剂或增充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和 /或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；C3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土； (9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。在使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软充填和硬充填明胶胶囊剂中，相似类型的固体组合物也可用作填充剂。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分以外，液体剂型可含有常用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、油(具体地说为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可包含辅料，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。除活性化合物以外，混悬剂可含有助悬剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和西黄蓍胶及其混合物。本发明的组合物还可含有辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过加入抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，来确保防止微生物的作用。组合物中还可能需要包含等渗剂(例如糖、氯化钠等)。另外，可通过加入延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)，使可注射药物形式的吸收延长。要理解的是，主治医师在考虑修正本发明的主题化合物(例如ALK3多肽)的作用的各种因素后，可确定剂量方案。各种因素包括但不限于需要形成的骨重的量、骨密度丢失的程度、骨损伤的部位、受损骨的状况、患者的年龄、性别和饮食、可能造成骨丢失的任何疾病的严重程度、给药时间和其它临床因素。任选剂量可随用于重构的基质类型和组合物中化合物的类型而改变。向最终组合物中加入其它已知的生长因子也可影响剂量。可通过定期评价骨生长和/或修复，例如X射线(包括DEXA)、组织形态学测定和四环素标记，来监测进程。在某些实施方案中，本发明还提供用于体内产生ALK3多肽的基因疗法。这类疗法可通过将ALK3多核苷酸序列引入受累于上文所列病症的细胞或组织，来达到其治疗效果。 可使用重组表达载体(例如嵌合病毒或胶体分散系统)实现ALK3多核苷酸序列的递送。优选的ALK3多核苷酸序列的治疗递送是使用靶向脂质体。可用于本文教导的基因疗法的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或优选RNA病毒(例如反转录病毒)。优选反转录病毒载体是鼠或禽反转录病毒的衍生物。可插入单一外源基因的反转录病毒载体的实例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒 (MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV) 0许多其它的反转录病毒载体可掺入多个基因。所有的这些载体可转移或整合选择标记的基因，使得可鉴定和产生转导细胞。可通过连接例如糖、糖脂或蛋白质，使反转录病毒载体具有靶标特异性。通过使用抗体来完成优选的打靶。本领域的技术人员应认识的是，可将特异性多核苷酸序列插入反转录病毒基因组或与病毒包膜连接，以供含有ALK3多核苷酸的反转录病毒载体的靶标特异性递送。在一个优选的实施方案中，载体靶定骨或软骨。或者，可通过常规磷酸钙转染，将组织培养细胞用编码反转录病毒结构基因gag、 pol和env的质粒直接转染。然后将这些细胞用含有目标基因的载体质粒转染。所得细胞释放反转录病毒载体到培养基中。ALK3多核苷酸的另一种靶定递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合体、纳米囊、微球、珠粒和脂质型系统，包括水包油乳液、微团、混合微团和脂质体。优选的本发明的胶体系统是脂质体。脂质体是可体外和体内用作递送载体的人工膜囊泡。RNA、 DNA和完整病毒体可包封在水性内部，并以生物活性形式递送至细胞(参见例如Fraley等， Trends Biochem. Sci. ,6 77,1981) 0使用脂质体载体的有效基因转移方法是本领域已知的，参见例如Marmino等，Biotechniques,6 :682，1988。脂质体的组成一般是磷脂的组合， 一般与类固醇(尤其是胆固醇)组合。也可以使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特性取决于PH、离子强度和二价阳离子的存在情况。可用于产生脂质体的脂质的实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。说明性的磷脂包括蛋黄磷脂酰胆碱(egg phosphatidylcholine)、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。根据例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性靶定脂质体也是可行的，并且是本领域已知的。实例现对本发明进行了大致描述，通过参照下列实施例可更容易地理解本发明，包括该实施例仅用于说明本发明的某些实施方案的目的，并无意限制本发明。实施例1. ALK3-FC融合蛋白的产生天然人ALK3的氨基酸序列和相应的核苷酸序列见图1、图2。本申请人设计了 ALK3-hFc融合蛋白，其中人ALK3的胞外域(天然残基M-152)(图3、图4)通过最小接头 (由氨基酸残基TGGG组成)在C端与人Fc结构域融合(图5、图6)，得到图7所示蛋白质。 考虑下列3个前导序列(i)天然MPQLYIYIRLLGAYLFIISRVQG(SEQ ID NO 8)(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA) :MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO 9)(iii)蜜蜂蜂毒肽(HBML) :MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO :10)hALK3 (24-152)-hFc (SEQ ID NO :11)的选定形式利用TPA前导序列，并具有图8所示未加工的氨基酸序列。编码该融合蛋白的有义核苷酸序列和相应的反义序列见图9。编码hALK3 (24-152) -hFc的备选有义核苷酸序列如下所示，其在1137位(下划线)上掺入不改变氨基酸序列的C — T取代。1ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGC41TGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCCAGAATCT81GGATAGTATGCTTCATGGCACTGGGATGAAATCAGACTCC121GACCAGAAAAAGTCAGAAAATGGAGTAACCTTAGCACCAG161AGGATACCTTGCCTTTTTTAAAGTGCTATTGCTCAGGGCA201CTGTCCAGATGATGCTATTAATAACACATGCATAACTAAT241GGACATTGCTTTGCCATCATAGAAGAAGATGACCAGGGAG281AAACCACATTAGCTTCAGGGTGTATGAAATATGAAGGATC321TGATTTTCAGTGCAAAGATTCTCCAAAAGCCCAGCTACGC361CGGACAATAGAATGTTGTCGGACCAATTTATGTAACCAGT401ATTTGCAACCCACACTGCCCCCTGTTGTCATAGGTCCGTT441TTTTGATGGCAGCATTCGAACCGGTGGTGGAACTCACACA481TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT
521CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT561GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC601GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG641TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG681GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC721CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT761ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT801CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA841CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGA881CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT921CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG961CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG1001ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGT1041GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC1081TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA1121AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 具有TPA前导序列并具有鼠Fc取代人Fc的hALK3 (M-152)-Fc的变体见图10。编码该变体的有义核苷酸序列和其相应的反义序列见图11。本申请人构建了在71位(天然 ALK3 E⑶序列中的70位)具有天冬酰胺的hALK3(M-152)-mFc的形式。该蛋白质在CHO细胞系中表达，N端测序显示具有N端封闭(N-terminal block)和GAQNLDSMLHGTGMK (SEQ ID NO 17)的单一较小序列的主要种类，N端封闭表明以天然谷氨酰胺(Q)残基开始，与SEQ ID NO 7的蛋白质一致。本申请人另外构建了具有天然ALK3序列的hALK3(M-152)-hFc蛋白质。包含鼠ALK3胞外域(鼠前体中的天然残基M-152)和鼠Fc结构域的另一种ALK3_Fc
变体，通过类似方法产生。该变体mALK3 (24-152) -mFc的氨基酸序列见下，其中ALK3结构
域用下划线表示
1MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAQNLDSMLHGTGMKSDLDQKKPENGVT51.LAPEDTLPFLKCYCSGHCPDDAINNTCITNGHCFA工工EEDDQGETTLTSG101CMKYEGSDFQCKDSPKAQLRRTIECCRTNLCNQYLQPTLPPVVIGPFFDG151SIRTGGGEPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLM201工SLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRV251VSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLP301PPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDG351SYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLGK(SEQID NO: 18)实施例2.与ALK3-FC的配体结合采用Biacore 方法测定ALK3_Fc融合蛋白对BMP/⑶F家族超过15个成员的结合亲和力。来源于HEK 293细胞的mALK3-mFc显示结合hBMP2和hBMP4的高亲和力(分别为Kd = 2. 43x 10_9和9. 47x10-,，以及结合若干其它配体(包括hBMP6和hBMP7)的中等亲和力。hALK3(M-152)-hFc显示类似的结合概况。准确地讲，来自HEK 293细胞的 hALK3 (24-152) -hFc 与 hBMP2 和 hBMP4 结合的 Kd 分别为 6. 53χ 1(Γ10 和 1. 02χ 1(Γ9， 而来自CHO细胞的hALK3 (24-152) -hFc与hBMP2和hBMP4结合的Kd分别为4. 53χ 10, 和7. 03x 10_1CI。在其它配体中，像mALK3(M-152)-mFc—样，来自两种细胞类型的 hALK3 (24-152)-hFc显示与hBMP6和hBMP7结合的中等亲和力。ALK3-FC对BMP2和BMP4的总体选择性值得注意。虽然无意受任何特定机制的束缚，但是本申请人根据这些结果假定，ALK3-FC体内主要通过结合BMP2和BMP4从而通过这些配体抑制信号转导，来发挥其作用。因此，预计抗BMP2和/或BMP4的抗体也可刺激骨形成。或者，可预期抗ALK3配体结合域的抗体更宽泛地抑制ALK3介导的信号转导。图18图示本文提出的3种方法的实例，其通过BMP2、BMP4和潜在的其它配体干扰信号转导，用于促进骨形成的目的。制备了整合了人ALK3胞外域(EOT)的截短变体的一系列的ALK3_Fc蛋白，并与 hALK3 (24-152)-hFc针对其配体结合亲和力进行了比较。使具有N端缺失6、12、27或31 个氨基酸；C端缺失6或12个氨基酸；以及双重截短的ALK3E⑶变体在HEK 293细胞中表达，并用Mab层析法(A蛋白柱)纯化。采用Biacore 方法筛选结合这些变体的BMP/⑶F/ TGF^配体超家族的成员。
权利要求
1.一种多肽，其包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽，其中通过大小排阻层析法测定，所述多肽相对于蛋白质污染物的纯度为至少95%。
3.权利要求1的多肽，其中所述多肽对BMP2或BMP4的解离常数不大于10-1
4.一种多肽，其包含与SEQ ID NO :7的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1的多肽，其中所述多肽是糖基化的。
6.权利要求1的多肽，其中所述多肽在动物中刺激骨形成或增加骨矿物质密度。
7.权利要求1的多肽，其中所述多肽通过在CHO细胞中表达而产生。
8.一种同二聚体，其包含两个权利要求1的多肽。
9.一种药物制剂，其包含权利要求1的多肽。
10.权利要求9的药物制剂，其中所述制剂基本上无致热原。
11.一种分离多核苷酸，其包含权利要求1的多肽的编码序列。
12.权利要求11的分离多核苷酸，其中所述分离多核苷酸包含SEQID N0:12的序列。
13.—种重组多核苷酸，其包含与权利要求11的多核苷酸有效连接的启动子序列。
14.一种细胞，其用权利要求11的重组多核苷酸转化。
15.权利要求14的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
16.权利要求15的细胞，其中所述细胞是CHO细胞或人细胞。
17.一种制备ALK3多肽的方法，其包括a)在适于表达可溶性ALK多肽的条件下培养细胞，其中所述细胞用权利要求11的重组多核苷酸转化；和b)回收如此表达的BMP-结合ALK3多肽。
18.一种用于促进骨生长、增加骨密度或提高骨强度的方法，所述方法包括将有效量的选自以下的BMP或ALK3拮抗剂给予受试者a)包含与SEQID NO 3有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含至少50个选自SEQID NO 3的连续氨基酸的多肽；c)与BMP2结合并抑制BMP2和ALK3之间的相互作用的抗体；d)与BMP4结合并抑制BMP4和ALK3之间的相互作用的抗体；和e)与ALK3结合并抑制ALK3和一种或多种ALK3的配体之间的相互作用的抗体。
19.权利要求18的方法，其中第(a)或(b)部分的多肽具有一个或多个下列特征 i)与ALK3配体结合的Kd为至少1(ΓΜ ；和 )抑制细胞中的ALK3信号转导。
20.权利要求19的方法，其中所述多肽是融合蛋白，其除包括ALK3多肽结构域以外还包括一个或多个多肽部分，所述多肽部分具有一种或多种以下性质提高体内稳定性、延长体内半寿期、增加摄取/给予、提高组织定位或分布、促进蛋白质复合体的形成和/或纯化。
21.权利要求20的方法，其中所述融合蛋白包括选自以下的多肽部分免疫球蛋白Fc 结构域和血清白蛋白。
22.权利要求18的方法，其中第(a)或(b)部分的多肽包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
23.一种用于治疗骨相关病症的方法，所述方法包括将有效量的BMP或ALK3拮抗剂给予有需要的受试者。
24.权利要求23的方法，其中所述BMP或ALK3拮抗剂选自a)包含与SEQID NO 3有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含至少50个选自SEQID NO 3的连续氨基酸的多肽；c)与BMP2结合并抑制BMP2和ALK3之间的相互作用的抗体；d)与BMP4结合并抑制BMP4和ALK3之间的相互作用的抗体；和e)与ALK3结合并抑制ALK3和一种或多种ALK3的配体之间的相互作用的抗体。
25.权利要求对的方法，其中第(a)或(b)部分的多肽具有一个或多个下列特征i)与ALK3配体结合的Kd为至少1(ΓΜ ；和 )抑制细胞中的ALK3信号转导。
26.权利要求25的方法，其中第(a)或(b)部分的所述多肽是融合蛋白，其除包括ALK3 多肽结构域以外还包括一个或多个多肽部分，所述多肽部分具有一种或多种以下性质提高体内稳定性、延长体内半寿期、增加摄取/给予、提高组织定位或分布、促进蛋白质复合体的形成和/或纯化。
27.权利要求沈的方法，其中所述融合蛋白包括选自以下的多肽部分免疫球蛋白Fc 结构域和血清白蛋白。
28.权利要求23的方法，其中第(a)或(b)部分的多肽包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
29.权利要求23的方法，其中所述骨相关病症选自原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。
30.权利要求23的方法，其中所述骨相关病症选自绝经后骨质疏松症、性腺机能减退性骨丢失、肿瘤诱发性骨丢失、癌症疗法诱发性骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤和佩吉特病。
31.权利要求23的方法，其中所述方法还包括给予第二骨活性剂。
32.权利要求31的方法，其中所述骨活性剂选自二膦酸盐、雌激素、选择性雌激素受体调节剂、甲状旁腺激素、降钙素、钙补充剂和维生素D补充剂。
33.一种多肽，所述多肽包含与选自以下的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列=SEQ ID NO :11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 和 41。
34.权利要求33的多肽，其中所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列有至少97%同一性=SEQ ID NO :11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 和 41。
35.权利要求33的多肽，其中所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列有至少98%同一性=SEQ ID NO :11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 和 41。
36.权利要求33的多肽，其中所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列有至少99%同一性=SEQ ID NO :11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 和 41。
37.权利要求33的多肽，其中所述氨基酸序列是选自以下的氨基酸序列SEQID NO 11、14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 和 41。
38.权利要求33的多肽，其中所述多肽由与选自以下的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列组成:SEQ ID NO :11、14、20、22、23、25、洸、28、四、30、31、33、；34、35、36、38、39,40 和 41。
39.权利要求33的多肽，其中所述多肽由与选自以下的氨基酸序列有至少97%同一性的氨基酸序列组成:SEQ ID NO :11、14、20、22、23、25、洸、28、四、30、31、33、；34、35、36、38、 39,40 和 41。
40.权利要求33的多肽，其中所述多肽由与选自以下的氨基酸序列有至少98%同一性的氨基酸序列组成:SEQ ID NO :11、14、20、22、23、25、洸、28、四、30、31、33、；34、35、36、38、 39,40 和 41。
41.权利要求33的多肽，其中所述多肽由与选自以下的氨基酸序列有至少99%同一性的氨基酸序列组成:SEQ ID NO :11、14、20、22、23、25、洸、28、29、30、31、33、；34、35、36、38、 39,40 和 41。
42.权利要求33的多肽，其中所述多肽由选自以下的氨基酸序列组成SEQID NO=IU 14、20、22、23、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、40 和 41。
43.权利要求33的多肽，其中所述多肽是糖基化的。
44.权利要求33的多肽，其中所述多肽在动物中刺激骨形成或增加骨矿物质密度。
45.权利要求33的多肽，其中所述多肽通过在CHO细胞中表达而产生。
46.一种同二聚体，其包含两个权利要求33的多肽。
47.一种药物制剂，其包含权利要求33的多肽或权利要求46的同二聚体和药学上可接受的赋形剂。
48.权利要求47的药物制剂，其中所述制剂基本上无致热原。
49.一种分离核酸，其在严格条件下与SEQ ID NO :12、15、19、21、24、27、32和37的任一种核酸的互补序列杂交。
50.一种细胞，其包含权利要求49的分离核酸序列。
51.权利要求50的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
52.一种多肽，其包含人ALK3胞外域的第一氨基酸序列和异源氨基酸序列，其中所述第一氨基酸序列由始于SEQ ID NO :1的25-31位中的任一个并且终止于SEQ ID NO :1的 140-152位中的任一个的序列组成。
53.权利要求52的多肽，其中所述异源氨基酸序列包含抗体的恒定结构域。
54.权利要求52的多肽，其中所述异源氨基酸序列包含IgG的结构域。
55.权利要求M的多肽，其中所述IgG是人IgGl。
56.一种用于促进骨生长、增加骨密度或提高骨强度的方法，所述方法包括将有效量的多肽给予受试者，所述多肽包含与SEQ ID NO :3的氨基酸8-117的氨基酸序列有至少95% 同一性的氨基酸序列。
57.权利要求56的方法，其中所述多肽具有一个或多个下列特征i)与ALK3配体结合的Kd为至少1(ΓΜ ；和 )抑制细胞中的ALK3信号转导。
58.权利要求56的方法，其中所述多肽基本上不与人BMP6结合。
59.权利要求56的方法，其中所述多肽基本上不与人BMP7结合。
60.权利要求56的方法，其中所述多肽是融合蛋白，其除包含ALK3多肽结构域以外还包含一个或多个多肽部分，所述多肽部分具有一种或多种以下性质提高体内稳定性、延长体内半寿期、增加摄取/给予、提高组织定位或分布、促进蛋白质复合体的形成和/或纯化。
61.权利要求60的方法，其中所述融合蛋白包含选自以下的多肽部分免疫球蛋白Fc 结构域和血清白蛋白。
62.权利要求56的方法，其中所述多肽包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基 糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
63.一种用于治疗骨相关病症的方法，所述方法包括将有效量的多肽给予有需要的受试者，所述多肽包含与SEQ ID NO :3的氨基酸8-117的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列。
64.权利要求63的方法，其中第(a)或(b)部分的多肽具有一个或多个下列特征i)与ALK3配体结合的Kd为至少1(ΓΜ ；和 )抑制细胞中的ALK3信号转导。
65.权利要求63的方法，其中所述多肽包含与SEQID NO 3的氨基酸8-117的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
66.权利要求63的方法，其中所述多肽是包括一个或多个多肽部分的融合蛋白，所述多肽部分具有一种或多种以下性质提高体内稳定性、延长体内半寿期、增加摄取/给予、 提高组织定位或分布、促进蛋白质复合体的形成和/或纯化。
67.权利要求66的方法，其中所述融合蛋白包括选自以下的多肽部分免疫球蛋白Fc 结构域和血清白蛋白。
68.权利要求63的方法，其中多肽包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
69.权利要求63的方法，其中所述骨相关病症选自原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。
70.权利要求63的方法，其中所述骨相关病症选自骨疼痛、绝经后骨质疏松症、性腺机能减退性骨丢失、肿瘤诱发性骨丢失、癌症疗法诱发性骨丢失、骨转移、多发性骨髓瘤和佩吉特病。
71.权利要求63的方法，其中所述方法还包括给予第二骨活性剂。
72.权利要求71的方法，其中所述骨活性剂选自二膦酸盐、雌激素、选择性雌激素受体调节剂、甲状旁腺激素、降钙素、钙补充剂和维生素D补充剂。
73.—种药物制剂，其包含(3)81^或々1^3拮抗剂；和(b)第二骨活性剂。
74.—种鉴定促进骨生长或增加骨密度的物质的方法，所述方法包括a)鉴定与BMP或ALK3拮抗剂多肽竞争结合ALK3多肽的配体结合域的试验物质；和b)评价所述物质对组织生长的作用。
75.BMP或ALK3拮抗剂多肽在制备用于治疗骨相关病症的药物中的用途。
76.一种用于预防骨相关病症的方法，所述方法包括将有效量的BMP或ALK3拮抗剂给予有需要的受试者。
全文摘要
在某些方面，本发明提供用于促进骨生长和增加骨密度和强度的组合物和方法。在某些实施方案中，本发明提供包括ALK3-Fc融合蛋白在内的ALK3多肽。
文档编号A61K38/18GK102548617SQ201080024908
公开日2012年7月4日 申请日期2010年3月30日 优先权日2009年3月30日
发明者J·西拉 申请人:阿塞勒隆制药公司