基因载体的制作方法

专利名称：：基因载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于基因转移和治疗应用的基因载体，并涉及产生所述基因载体的方法及其用途。_2]
背景技术：
：对于若干遗传性病症和获得性病症，来自正常供体的造血细胞移植(HCT)是治疗性治疗。然而，移植受限于匹配供体可获得性差和与同种异体手术有关的死亡率(大多与移植物抗宿主病-GvHD有关)。在某些病症(例如溶酶体贮积病(LSD))中，HCT的功效非常低。为了提高同种异体移植的安全性和功效，并鉴定用于缺乏匹配供体的患者的备选方案，需要基于基因纠正的自体造血干细胞(HSC)移植的基因治疗方法。作为同种异体HCT的备选方法，在患者自身的造血细胞中通过基因治疗可纠正遗传性遗传缺陷。然而，难以将相关基因的功能性拷贝递送至机体的全部受累细胞中。干细胞基因治疗的构思基于相对较少数目的干细胞的遗传修饰，所述干细胞通过进行自我更新分裂长期保留在机体内，并产生众多的经遗传纠正的子代，因此确保了在患者有生之年不断供应经纠正的细胞。造血干细胞(HSC)构成基因治疗的优良的靶标群，因为它们可容易而安全地获自骨髓(BM)或动员的外周血。可对分离的HSC进行遗传修饰，并作为自体移植物再输回给患者。长期益处需要移植极充足数目的基因修饰的HSC，其可使经调理的骨髓进行种群恢复，产生所有造血谱系经纠正的血细胞。自体同种异型HSC使得可对所有患者进行移植手术，并且避免了导致GvHD的免疫相容性问题。另外，一些疾病像原发性免疫缺陷需要纠正部分HSC及其子代。预处理(conditioning)方案(所谓的“非清髓性”或“微型(mini)”预处理方案)的强度降低，这产生对患者更好的耐受性和更少的副作用。简化的预处理方案与标准同种异体移植较不相容，因为在同种异体背景下，由于与宿主衍生的免疫细胞的免疫拮抗作用，所以混合供体嵌合状态通常是不稳定。HSC及其子代的有效的长期基因修饰需要允许纠正性DNA稳定整合到基因组而又不影响HSC功能的技术。最有效的递送系统是病毒载体。例如，造血祖细胞(HSPC)中溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶(在球状细胞性脑白质营养不良(GloboidLeukodystrophy,GLD)或克拉伯病(Krabbedisease)中缺乏)的基因转移和表达引起转导细胞凋亡和功能受损，妨碍用于治疗所述病症的基于HSPC的基因治疗方法的发展(见下文)。因此，用于基因治疗的未来的表达盒应类似于生理表达模式，并且避免可导致转导细胞毒性、清除甚至恶性转化的异位和/或非生理性转基因表达。这对于其生物学必须不被遗传干预扰乱的干细胞这种保证基因治疗的长期功效的关键靶细胞类型特别重要。总之，目前的造血基因治疗策略需要HSC的转导以保证造血系统的长期纠正，但可明显获益于调节的转基因表达盒，所述转基因表达盒在HSC中不会异位表达转基因产物，却只在作为遗传疾病的靶标的分化子代(例如SCID中的淋巴细胞、CGD中的粒细胞和GLD中的单核细胞/巨噬细胞)中“开启(switchon)”。实现这种造血基因治疗策略的一种方法是使用谱系特异性转录调控元件例如基因座的内源启动子以驱动载体中治疗基因的表达。然而，启动子常常散布在长距离的DNA内，而且表征不足，因此可能在载体构建体中不易以其整体重构。此外，基因转移载体中重构的组织特异性启动子的表达水平常常不足以实现表型纠正，最可能是因为半随机载体整合位点上染色质的不完全重构和/或不利影响。因此，迫切需要调节转基因的其它策略。发明陈沭按照本发明的一个方面，提供用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血祖细胞(HSPC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSPC中表达但并不防止或降低其在分化细胞中表达。按照本发明的另一个方面，提供用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血干细胞(HSC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSC中表达但并不防止或降低其在分化细胞中表达。换句话说，本发明提供适用于造血基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个以有效量存在于造血祖细胞或造血干细胞中的miRNA的miRNA序列靶标，并任选包含转基因。所谓有效量，我们意指内源miRNA的浓度足以降低或防止与相应的miRNA靶序列有效连接的转基因的表达。因此本发明利用在诸如HSPC和HSC等细胞中强表达但不在例如髓系和淋巴系的分化子代中表达的miRNA，这防止或降低可能的毒性转基因在敏感干细胞群中表达，冋时保持在患病子代中表达和治疗功效。miRNA与转基因“有效连接”。术语“有效连接”意指所述组分处于允许以其预定方式发挥其作用的关系。干细胞能够分化成许多细胞类型。能够分化成所有细胞类型的细胞称为全能细胞。在哺乳动物中，只有受精卵和早期胚细胞是全能细胞。干细胞是存在于大多数(如果不是全部的话)多细胞生物中的细胞。它们的特征在于通过细胞有丝分裂自我更新并分化成多种特化细胞类型的能力。哺乳动物干细胞的两大类型是自胚泡的内细胞团分离的胚胎干细胞和成体组织中存在的成体干细胞。在正在发育的胚胎中，干细胞可分化成所有的特化胚胎组织。在成体生物中，干细胞和祖细胞起机体修复系统、补充特化细胞但也保持再生器官(例如血液、皮肤或肠组织)正常更新的作用。造血干细胞(HSC)是产生全部血细胞类型的多能干细胞，血细胞包括髓系(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴系(T细胞、B细胞、NK细胞)。祖细胞具有分化成特定细胞类型的能力。然而，与干细胞不同，它们早已是非常特异性的它们被推动分化成其“目标”细胞。干细胞和祖细胞之间最重要的差别是干细胞可无限复制，而祖细胞只可分裂有限的次数。只能通过功能性体内测定法(即移植和证明其可在长时期内产生全血谱系)中，将HSPC与HSC严格区分开来。细胞表面标记例如c-Kit(⑶117)、Sca-I的检测和一组谱系标记的缺乏/低表达，结合最近披露的属于SLAM受体家族的一类分子(⑶150和⑶48)，可富集HSC和HSPC亚群，当用标准功能测定法测定时，达到50%的纯度(Kiel等)。分化细胞是与干细胞或祖细胞相比变得更加特化的细胞。分化发生在多细胞生物的发育期间，同时生物从单个受精卵变成组织和细胞类型的复杂系统。分化也是成体的普遍过程成体干细胞在组织修复期间和在正常细胞更新期间分裂并产生完全分化的子细胞。分化显著改变细胞的大小、形状、膜电位、代谢活动和对信号的响应性。这些变化大多数都是由于基因表达的高度受控修饰引起的。换句话说，分化细胞是具有特定结构并且由于涉及特定基因的活化和失活的发育过程而执行某些功能的细胞。在这一点上，分化细胞包括造血细胞谱系的分化细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞、T细胞、B细胞和NK细胞。例如，可通过检测在未分化细胞上不表达或表达较少的细胞表面分子，来将造血细胞谱系的分化细胞与HSC和HSPC区分开来。合适的谱系标记的实例为例如CDllb、Grl、CD19、Terll9和CD3。按照本发明的另一个方面，提供用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个与核苷酸序列有效连接的与选自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA相应的miRNA序列祀标。miR-126靶标在较原始的HSPC中和(在人中)在红细胞谱系(erythroidlineage)中最有效地阻断表达。miR-126可能特别适于依靠在髓系和淋巴系中进行稳健转基因表达的基因治疗应用。miR-130a靶标在较原始的HSPC中最有效地阻断表达(类似于miR-126)，miR-130a可能最特别适于依靠在髓系、淋巴系和红细胞谱系中进行稳健转基因表达的基因治疗应用。在人⑶34细胞中，miR-126可强于miR_130a，但是在分化子代中也可具有非特异性的活性。包含miR-130aT序列(优选2_4个拷贝)和“半个”miR_126T(优选2个拷贝)的组合祀标使操作窗(operatingwindow)最大化,所述操作窗由在HSPC中的阻抑和在髓样细胞子代中的表达之比确定。此外，当使用组合靶标时，两种独立的miRNA确保了转基因在HSPC中减量调节，而且干扰内源miRNA调节的风险降低，因此提高了靶序列的安全性和功效。miR-223祀标在骨髓定型祖细胞(myeloidcommittedprogenitor)中最有效地阻断表达和在较原始的HSPC中至少部分地阻断表达。与miR-126和miR_130a不同，miR-223靶标在包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样树突细胞在内的分化髓样细胞中完全并强烈阻断表达。miR-223靶标可能特别适于依赖在淋巴系或红细胞谱系中进行稳健转基因表达的基因治疗应用。miR-223靶标还可在人HSC中非常有效地阻断表达。优选miRNA序列祀标对应于mir_130a和mir-126。在一个实施方案中，基因载体包含控制载体的表达的核苷酸序列。换句话说，内源微小RNA在某些细胞类型(HSC^PHSPC)中阻止病毒的表达或增殖，但允许在其它细胞类型中表达或增殖。例如，mir-126、mir-130和mir-223在造血干细胞或祖细胞中防止基因载体或溶瘤病毒的表达。在一个实施方案中,基因载体包含作为转基因的核苷酸序列。在另一个实施方案中，基因转移载体呈非病毒基因转移载体的形式。在这个实施方案中，基因转移载体可包含含有与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列的表达载体或质粒，或者呈含有与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列的表达载体或质粒的形式。本文描述的表达载体包含含有能够被转录的序列的核酸区。因此，该定义包括编码mRNA、tRNA和rRNA的序列。可使用本发明的基因载体或基因转移载体将转基因递送至目标位点或目标细胞。可通过病毒或非病毒载体将本发明的载体递送到靶位点。载体是允许或有利于将实体从一种环境转移到另一种环境的工具。举例来说，用于重组DNA技术的一些载体允许将实体(例如DNA区段(例如异源DNA区段，例如异源cDNA区段))转移至靶细胞。任选一旦进入靶细胞，载体便可在细胞内起维持异源DNA的作用，或者可起DNA复制单元的作用。用于重组DNA技术的载体的实例包括质粒、染色体、人工染色体或病毒。非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。在此，转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶哺乳动物细胞的过程。典型的转染方法包括电穿孔、DNA生物射弹、脂质介导的转染、密集DNA介导的转染(compactedDNA-mediatedtransfection)、脂质体、免疫脂质体、脂转染(Iipofectin)、阳离子剂介导的、阳离子表面两亲分子(cationicfacialamphiphiles,CFA)(NatureBiotechnology199614；556)及其组合。在一个实施方案中，基因载体是病毒载体。病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。载体的其它实例包括离体递送系统，其包括但不限于DNA转染方法，例如电穿孔、DNA生物射弹、脂质介导的转染、密集DNA介导的转染。术语“载体颗粒”是指优选能够结合并进入靶细胞的经包装的反转录病毒载体。正如已对载体所做的论述一样，可根据野生型反转录病毒，对颗粒的组分进行修饰。例如，颗粒的蛋白质外壳中的Env蛋白可经遗传修饰以改变其靶向特异性或实现一些其它所需要的功能。优选病毒载体优先转导某一细胞类型或某些细胞类型。更优选病毒载体是靶向载体，也就是说具有与天然病毒相比已被改变的组织向性，使得载体靶向特定细胞。在一个优选的实施方案中，基因载体可得自慢病毒。在一个实施方案中，基因载体包含组织特异性启动子。优选组织特异性启动子选自CDllb和c-Fes及来源于细胞色素b-245重链(CYBB,gp91phox)基因座和TEK(Tie2)的启动子。TEK(Tie2)启动子可与miR-126靶序列结合，这种结合可供在肿瘤浸润性髓样细胞亚类中进行特异性转基因表达。在一个实施方案中，基因载体包含编码酶的转基因。优选酶选自溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶和gp91Phox0按照本发明，可用来递送免疫调节分子，例如干扰素-α。优选这些载体在骨髓移植后将免疫调节分子递送至肿瘤细胞。优选这些载体含有Tie2启动子加miR-126T序列。重要的是，Tie2启动子在造血干细胞中具有活性，而且已知免疫调节分子(例如干扰素-α)对HSC有毒性。因此，为了通过Tie2表达来特异性地递送生物活性分子至肿瘤浸润巨噬细胞而不干扰HSC功能，HSC特异性miRT的使用一如本专利申请所述一变得是必须的，而不是选项。已知Tie2启动子在HSC中比在我们的整个研究中使用的PGK启动子弱，我们预期在HSC中，126T/130aT序列完全阻止由Tie2启动子表达的转基因的毒性。按照本发明的另一个方面，提供一组用于产生病毒载体颗粒的DNA构建体，包括编码可包装的病毒载体基因组的DNA构建体，所述DNA构建体包含至少一个本发明的miRNA序列靶标，并任选包含转基因。所谓可包装的载体基因组，我们意指载体基因组处于其中可将其包装成病毒载体颗粒的环境下。这通常需要Gag-Pol和Env的存在。按照本发明的另一个方面，提供用于制备病毒载体颗粒的方法，所述方法包括将本发明的DNA构建体组导入宿主细胞，并得到病毒载体颗粒。在一个实施方案中，宿主细胞包含相应的miRNA。按照本发明的另一个方面，提供通过本发明的方法产生的病毒载体颗粒。按照本发明的另一个方面，提供包含本发明的基因载体或颗粒以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体的药物组合物。按照本发明的另一个方面，提供用本发明的基因载体或颗粒感染或转导的细胞。细胞可在体内或体外情况进行转导或感染。细胞可来源于动物(优选哺乳动物，例如人或小鼠)或形成动物(优选哺乳动物，例如人或小鼠)的组成部分。因此，应了解的是，本发明可用于提供转基因动物，例如用作疾病模型。在一个实施方案中，哺乳动物是非人类哺乳动物。在一个实施方案中，细胞是造血干细胞或造血祖细胞。按照本发明的另一个方面，提供至少两个不同的与选自mir_130a、mir-126和mir-223的miRNA相应的miRNA序列祀标的组合。在一个实施方案中，miRNA序列靶标同时、单独或序贯使用。按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于在造血干细胞或造血祖细胞中防止或降低转基因的表达。按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于治疗选自球形细胞脑白质营养不良、慢性肉芽肿病和重度联合免疫缺陷(SCID)的疾病。按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于提高与基因治疗相关的造血干细胞或造血祖细胞存活的机会。可通过这些细胞的基因的特异性脱靶表达来增加HSC或HSPC的存活机会。具体地讲，对HSC或HSPC有毒的转基因表达的脱靶可有益于这些细胞的存活。同样，在宿主中可引起不良免疫反应的转基因表达的脱靶，可导致细胞的存活机会增加。按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于提高基因治疗的安全性和/或功效。基因治疗安全性的提高包括在某些细胞类型(例如HSC和HSPC)中防止或降低转基因的不良表达或载体的表达。特定细胞类型的转基因或载体表达的脱靶可降低可能伴随基因治疗的不良反应或副作用。基因治疗功效的提高包括在所需要的细胞类型(例如分化造血细胞)中更有效地表达转基因，因为由通过微小RNA靶序列免于转基因毒性和不良免疫反应的基因修饰的未分化细胞更有效地产生这些细胞。具体地讲，如果可避免转基因的表达直到细胞分化，则涉及HSC或HSPC移植的基因治疗可更安全和更有效。9按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于防止造血干细胞或造血祖细胞的细胞凋亡，其中细胞凋亡是由转基因的表达引起的。按照本发明的另一个方面，提供本发明的基因载体、本发明的颗粒、本发明的药物组合物、本发明的细胞或本发明的组合用于监测造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段。mir-126,mir-223和mir_130a的存在表示HSC或HSPC。更准确地讲，mir-126表示原始HSPC，还在人中表示红细胞谱系的细胞。Mir-130a表示较原始的HSPC。Mir-223表示骨髓定型祖细胞和较原始的HSPC。Mir-223也表示分化髓样细胞，包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和髓样树突细胞。在一个实施方案中，基因载体用于造血细胞治疗。造血细胞治疗包括造血干细胞移植。按照本发明的另一个方面，提供与选自mir-130a、mir_126和mir-223的miRNA相应的miRNA序列祀标用于基因治疗。按照本发明的另一个方面，提供测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定细胞中miRNA的表达水平，其中miRNA对应于与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列，其中miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。例如，mir-130a和mir-126的表达表明细胞是HSPC或HSC，而miR-223的表达表明属于髓系，即粒细胞和单核细胞，包括其前体细胞和衍生细胞。按照本发明的另一个方面，提供测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定细胞中至少两种不同miRNA的表达水平，其中miRNA对应于与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列，其中miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达但不防止或降低其在分化细胞中表达；和对不同miRNA的表达水平进行比较。此外，可使用表达两种标记基因(每一种含有不同的微小RNA靶序列)的双向载体，同时和彼此独立地测定两种微小RNA的表达。例如，不同的微小RNA可与不同的标记(例如荧光标记)连接。不同颜色可表示代表不同分化阶段的微小RNA表达的不同混合物(例如绿色标记+miR-126T，红色标记+miR-223T。如果细胞为红色或黑色一>HSPC;如果细胞为黄色一>淋巴细胞；如果细胞为绿色分化髓系细胞)。按照本发明的另一个方面，提供测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定转基因在所述造血干细胞或所述造血祖细胞中的表达水平，其中转基因与miRNA序列靶标有效连接，由此相应的miRNA防止或降低转基因在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。此外，选自miR-126、miR_130a和miR-223的miRNA的报道载体(reportervector)可用于在目的是从诱导的多潜能细胞(iPS)或胚胎干细胞(ES)中获得造血谱系细胞的培养系统中鉴定造血干细胞和/或其直接前体。在本发明的一个实施方案中，用于本发明方法的miRNA包括选自mir_130a、mir-126和mir-223的miRNA。本发明的一#其它关键优势本发明教导可如何将适于基因治疗的基因载体设计成受HSC和HSPC的内源miRNA调节用于控制转基因表达从而实现载体的特异性表达概况。本发明提供这些载体的广泛应用，因为它们可有助于在HSC和HSPC中防止转基因毒性，因此有利于开发治疗各种疾病的基因治疗策略。所述载体特别适于涉及对HSC或HSPC有毒的转基因表达的基因治疗。本发明人提供对所选miRNA在多种造血细胞亚类(包括稀少的HSPC群)内的活性进行概况分析的新方法，因此向广泛采用但限于之前纯化的混合群落(bulkpopulation)的常规miRNA表达概况分析方法加入了新尺度。这种方法以HSPC用慢病毒miRNA报道载体转导为基础，所述报道载体用作miRNA活性的活的遗传指示物，可容易通过流式细胞术在单一细胞水平和在多细胞群中平行定量测量。采用这种方法，本发明人鉴定出在小鼠和人HSPC(包括富集最原始干细胞的亚类)中高度有功能的两种miRNA。在分化时，一种miRNA在早期祖细胞水平快速减量调节，而另一种则在粒细胞生成和单核细胞生成期间被进一步诱导，但是在淋巴细胞中和在巨核细胞/红细胞分化期间急速减量调节。此外，本发明人利用在HSPC中高表达的两种miRNA之一来克服阻碍通过基于慢病毒载体的造血干细胞基因疗法有效治疗鼠模型的球状细胞性脑白质营养不良(GLD)(—种由于溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶一GALC的活性缺陷而引起的溶酶体贮积症)的主要问题。与其它溶酶体酶不同，GALC在HSPC中的基因转移和表达引起由于作为酶表达结果的生物活性鞘脂的胞内含量失衡所致的转导细胞凋亡和功能受损。髓系和淋巴系的分化细胞不受GALC表达的影响，这就表明HSPC对酶毒性有特有的敏感性。用于报道载体的miRNA反应性序列允许调节治疗上相关的GALC转基因的表达概况、使转基因表达从其中表达关联miRNA的细胞(HSPC)中脱靶，同时允许在不受GALC表达毒性影响的分化子代中进行完全治疗性表达。用miRNA调节的GALC慢病毒载体转导的HSPC受到保护免于酶毒性，并且保持其在体外和体内两者的功能。初步结果表明这种方法在纠正小鼠模型疾病表现中具有治疗功效。优选使用下列miRNA靶序列以在人造血系统中实现受调节的转基因表达需要在髓系中表达的基因治疗应用(例如慢性肉芽肿病、溶酶体贮积症(例如克拉伯病)、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良等)126T/130aT(2+2个靶序列)一对在HSPC中的最大阻抑最优化；126T(2个靶序列)一对在髓样细胞子代中的最低背景活性最优化。需要在红细胞谱系中表达的基因治疗应用(例如地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病等)130aT(4个靶序列)或223T(2个或4个靶序列)。后一靶标在较原始的BFU-E和CFU-E中可能具有某种活性(<5χ)。需要在淋巴系中表达的基因治疗应用(例如RAG1/RAG2缺乏症、BTK缺乏症、X-SCID、ADA-SCID)223Τ(2个或4个靶序列)，可能与126T/130aT(2+2个靶序列)或126T(2个靶序列)组合)。为了被对HSC和HSPC而言是细胞内源的内源miRNA识别，可用miRNA靶序列对用于基因转移和治疗的转基因表达的载体(例如病毒载体，包括慢病毒载体)进行工程改造，从而在细胞亚类中调节转基因表达。此外，可使用miRNA靶序列的组合以获得具有高特异性细胞表达模式的载体。除非另有说明，否则本发明的实施将应用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些都属于本领域普通技术人员的能力范围内。文献中对这类技术进行了解释。参见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,MolecularCloningALaboratoryManual,第2版，第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.Μ.等(1995和定期增刊；CurrentProtocolsinMolecularBiology,%9、13和16章，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,JohnWiley&Sons；J.M.Polak和James0’D.McGee,1990,InSituHybridization!PrinciplesandPractice；0xfordUniversityPress;M.J.Gait(编辑)，1984,OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.I,EdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManual,EdHarlow(编辑)，DavidLane(编辑)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855.HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes编辑(2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9);以及LabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams和LindaRodgers编辑，2002，ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。这些整体原文的每一份都通过引用结合到本文中。附图描沭将参照的其优选实施方案，仅以举例方式对本发明作进一步说明，其中图I:双向miRNA调节的慢病毒报道载体的示意图。该图表示miRNA调节的双向载体(Bd.LV)的代表性结构，其含有绿色荧光蛋白(GFP)作为miRNA报道分子和人低(Ioe)亲和力神经生长因子受体(NGFR)的截短形式作为组成型表达的标准化分子(normalize!·)。尽管Bd.LV-ctr不含任何miRNA靶序列(miRT)，但Bd.LV-223T和Bd.LV-126T通过加入含有21bp的分别与miR-223或miR-126完全互补的4个串联重复来构建。图2:细胞系中miRNA报道分子Bd.LV的评价。a)在HEK293T、U937和通过用含有在遍在启动子控制下的pri-mir-126的LV转导异位表达miR-126的HEK293T细胞(HEK293T.LV.miR-126)中，对miR-223和miR-126表达水平(拷贝/pg)进行定量分析。b)用指定miRNA调节的Bd.LV转导的HEK-293T、U937、HUVEC和HEK293T.LV.miR-126细胞的代表性FACS分析。对细胞的GFP“miRNA报道分子“和NGFR“标准化分子”表达进行了分析。c)在蛋白质水平上和在RNA水平上，报道基因表达的miRNA介导的倍数阻抑(foldrepression)的计算公式。直方图表示miR-223和miR-126在细胞系中的活性，计算为蛋白质水平上的GFPFR值。菱形表示RNA水平上的GFPFR。图3miRNA报道分子BdLV的体内评价。谱系骨髓(BM)造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)用miR-223和miR-126的双向miRNA报道分子慢病毒载体(BdLV)转导，并移植入受者小鼠中。通过FACS分析稳定植入携带miRNA报道分子的细胞的小鼠外周血细胞。а)用于鉴定来源于鼠外周血的主要白细胞群的门控策略粒细胞(CDllb+，SSC高)、单核细胞(0)1化+，55(低)、8细胞(CD19+)和T细胞(CDllb_CD19b_)。b)鼠外周血亚类内GFP和NGFR表达的代表性FACS分析。c)来源于用转导有Bd.LV-ctr(η=5)、Bd.LV-223T(η=б)或Bd.LV-126T(n=4)的HSPC移植小鼠的外周血亚群内的GFPFR值(平均值+/-SD)。图4:(a)谱系_/ffi骨髓(BM)造血干细胞和造血祖细胞(HSPC)用双向miRNA报道分子慢病毒载体(BdLV)转导，并移植入经致死照射的小鼠中。BdLV共表达通过完全互补的miRNA靶(miRT)序列的4个串联重复使之对特异性miRNA有反应的去稳定GFP(d4GFP)报道分子和截短的NGFR标记基因(ANGFR)。移植后8_12周使小鼠安乐死，如所示通过免疫表型分析对多个BMHSPC亚群进行前瞻性鉴定(HSC:造血干细胞；MPP:多能祖细胞；GMLP:粒细胞-单核细胞-淋巴细胞祖细胞；GMP:粒细胞-单核细胞祖细胞；eMEP:早期巨核细胞-红细胞祖细胞；EP:红细胞前体)。(b)代表性FACS图表示从(a)中所述移植小鼠的BM中新鲜分离的HSPC亚群中，对照-BdLV(无miRT或133aT、肌肉特异性miRT)和miR-126(126T)、miR_130a(130aT)、miR_196b(196bT)、miR-10a(IOaT)、miR-223(223T)、miR-19a(19aT)、miR-93(93T)、miR-17_5p(17T)和let_7a(Let7aT)的报道分子BdLV的表达。每行表示上述分化阶段的HSPC中，指定BdLV的报道分子表达的代表性模式。每行右边的柱状图表示根据报道分子平均荧光强度计算的平均倍数抑制(FR)土sem(对照n=9;126Tn=10；130aTn=4；196bTn=4；10aT:除其中n=I因此统计数为n/a的HSC和MPPl以外，η=4；223Tη=6，其中5种具有eGFP报道分子；19aTn=3；93Tη=2；17Τη=3；let7aTη=1，3只小鼠的合并物)。使用各报道分子BdLV组的EP作为参比，通过单因素方差分析和Bonferroni事后检验校正进行HSPC亚群间miRNA活性的统计比较(***:ρ<O.OOl;**0.Ol>P>O.OOl;*p<O.05)。图5:(a)从移植小鼠分离的多个细胞群中，通过指定报道分子BdLV的平均倍数阻抑(FR)测定的8种miRNA的造血活性。谱系Μ亚类见图4;谱系+BM亚类ProBCD19+CD43.；CD43_B:CD19+CD43-；TLyCD3+;单核细胞CDllb+CD48+;粒细胞:CDllb+CD48l0；外周血粒细胞=CDllb+侧向角散射(sidescatter)111;单核细胞=CDllb+侧向角散射lQ；BLy:CD19+；TLy:CD3。(b)将含有4拷贝miR_130aT和2拷贝miR_126T(130a/126T;n=4只小鼠)的组合靶序列与4拷贝miR-126T(126T;n=10只小鼠)或4拷贝miR_130aT(130aT；η=4只小鼠)进行了比较。柱状图表示谱系标记阴性骨髓群(图4图例)中和外周血白细胞中通过这些miRT序列得到的倍数阻抑土sem。注意，在HSC中130a/126T达到比仅126T更好的阻抑，而PB白细胞的背景阻抑减少。图6:通过miRNA靶序列调节自杀基因的表达。(a)将与miR-142、miR-223、miR-126或miR-130a完全互补的miRT序列加入去稳定胸苷激酶(dTK)转录物中。对于(b)使用单向慢病毒自杀载体(各载体图的右半部)，而(c)中使用GFP标记与miRNA调节的TK偶联或NGFR标记与对照-TK偶联的双向自杀载体。(b)谱系-/低HSPC用指定慢病毒载体转导，并接种到+/_更昔洛韦(GCV)的半固体培养基中(LV-GFPn=2；CTRL-TKn=8；TK-142Tη=4;ΤΚ_223Τη=6;ΤΚ_126Τη=4;TK_130aT:η=2)。10天后，统计骨髓(CFU-GM、CFU-G,CFU-GM)和类红细胞(BFU-E、CFU-E)集落数。箱须图表示含有GCV的培养物中的集落数除以相应无GCV的对照培养物的集落计数(第10-90百分位数)。'无GCV'数据点表示接种差异(platingvariability)(各无GCV处理的培养物的集落计数除以所有无GCV处理的培养物的平均集落计数；n=26)。对GCV处理的LV-GFP组进行统计比较；ns，无显著不同;**，0·OOl<P<O.Ol:林*，p<O.001。(c)来源于CD45.1+小鼠的谱系_/低HSPC用TK对照载体(经NGFR标记)或miRNA调节的TK载体(经GFP标记；Exp#lTK.126Τ；Εχρ#2ΤΚ.142Τ)转导。以I:I比率将LV.NGFR/对照TK转导细胞和LV.GFP/TK-miRT转导细胞混合，并移植入⑶45.2+同类小鼠中，移植后第3天起，小鼠用GCV治疗(Exp#ln=6只小鼠；Exp#2n=5只小鼠)7-14天，或不治疗(Exp#ln=4；Exp#2:n=3)。代表性FACS图表示⑶45.1+供体细胞内的GFP/NGFR嵌合状态。图表表示对于在7-8个月时间内各种血细胞类型，GCV治疗(红色)和未治疗(黑色)小鼠血液中转导的供体衍生细胞内表达GFP的细胞的部分。注意，GCV组中显著较多的细胞为GFP+(***.p<O.001，两因素方差分析)，这就表明受到保护免于自杀和用GFP/TK.126T或GFP/TK.142T转导的HSC的选择性优势。因此，加到转基因的miR_126T序列克服了由高毒性转基因引起的HSPC毒性(甚至自遍在启动子表达时)，具有改善基于HSPC的基因治疗的安全性和功效的重大潜力。此外，这些结果正式证实了miR-126在长期植入性造血干细胞中有活性，正如功能性种群恢复测定法(functionalrepopulationassay)所证实的一样。图7:(a)为了呈现利用miR-126调节用于基因治疗的安全性，通过将阐述的LV显微注射入受精卵的卵周隙，来产生含有miR-126报道分子(Tg.126T)的转基因小鼠品系。年青的成熟转基因小鼠骨髓的FACS分析表明，GFP表达在Kit+Sca+谱系标记_(KSL)细胞(直方图中的蓝色图)中最低，而GFP表达在Kit+Sca_Lin_祖细胞(直方图中的黑色和红色图)开启。测定Tg.126T小鼠和对照GFP转基因小鼠的GFPMFI以计算指定HSPC亚群中miR-126报道分子的FR(平均值土sem，η=10只Tg.126Τ小鼠；林*ρ<O.001;**0.01>P>O.001，与EP相比)。(b)尽管携带miR-126的两个敲除等位基因的小鼠由于血管生成缺陷所致，表现出明显的胚胎致死性，但是培育我们的Tg.126T集落导致在反映亲代之一的后代中出现正常的每窝产仔数和预期的载体拷贝数(VCN)分布，这就表明了miR-126T序列自PGK启动子的适度表达不干扰发育期间天然miR-126靶标的调节。(c)来源于⑶45.2+Tgl26T小鼠和⑶45.I+野生型(WT)小鼠的BM细胞通过⑶117的阳性选择富集HSPC，并竞争性移植(II比率)到经致死照射的⑶45.2+受者(η=4)中。对移植小鼠定期采血，并测定各种外周血细胞谱系中的CD45.1/CD45.2嵌合状态(粒细胞=CDllb+侧向角散射ω;单核细胞=CDllb+侧向角散射；B细胞CD19+；T细胞CD3+)。这些数据表明对于安全利用miR-126调节有一个宽裕的治疗窗。图8(A)CD34+HSPC从人脐血(CB)中纯化，并用对照-BdLV(对照)或miR-126(126T)、miR-130a(130aT)或miR-223(223T)的miRNA报道分子BdLV转导(η=3个生物学重复/组)。在支持HSPC短期维持的条件下将细胞保持在液体培养物中，在⑶34+CD38T1SPC和⑶34+CD38+祖细胞(左起头两栏)中转导后2天，测定BdLV标记表达。然后细胞或在液体培养中分化6天(CD34—CD38+细胞；中间栏)或在半固体培养基中分化16天(⑶13+髓样细胞，⑶235+类红细胞)。显示代表性FACS图。底部的柱状图表示在相应亚群中定量测定的miR-126、miR-130a和miR-223活性(η=3;平均倍数阻抑+/-sem；**，0·001<P<O.01:_，p<O.001)。(B)脐血CD34+细胞用对照双向自杀载体或含有miR-223(TK-223T)或miR-126(TK-126T，另见图2)的miRNA靶序列的miRNA调节的双向自杀载体转导，并在前药GCV的存在或不存在下，在CFC测定法中以一式四份接种。接种后14天，统计GFP+类红细胞(CFU-E、BFU-E)或骨髓(CFU-G、CFU-M、CFU-GM)集落数，并归一化至'无GCV'培养的统计数。箱须图表示第10-90百分位数。GCV完全阻止CTR-TK转导的集落的生长。(C)将miR-126T和miR_130aT序列(分别为4+4和2+2个串联重复)的组合以及仅miR-126T的2个串联重复与分别使用miR_126T或miR_130aT的4个串联重复的标准miRT设计进行比较。人脐血细胞用相应的报道分子BdLV转导，转导后2天，在原始干细胞/祖细胞区室(⑶34+⑶38-)和祖细胞区室(⑶34+⑶38+)中，以及转导后10-14天在髓样细胞子代(⑶13+)和红细胞子代(⑶235+)中，测定报道分子的倍数阻抑。126T(4个靶标)、126T/130aT(4+4个靶标)和126T/130aT(2+2个靶标)在干细胞/祖细胞区室中同样充分阻抑。然而，126T/130aT(4+4个靶标)在髓样细胞子代中具有较高的背景抑制活性。(D)G-CSF诱导体外分化时，在原始区室中(如在C中)和后期骨髓分化阶段(中幼粒细胞⑶Ilb+/⑶16-;晚幼粒细胞⑶Ilb+/⑶16+/SSC低；粒细胞⑶Ilb+/⑶16+/SSC高)中126T(4个靶标)、126T/130aT(2+2靶标)和126T(2靶标)的抑制活性。培养物的May-Griinwald/Giemsa染色的细胞离心涂片(cytospin)样品上验证分化阶段。通过将CD34+/CD38-干细胞/多能细胞区室中相应miRT的倍数阻抑除以晚幼粒细胞中的倍数阻抑，来计算调节指数(右图)。通过126T(2个靶标)获得转基因表达在髓样细胞子代中的最佳“释放”，而在干细胞/祖细胞区室的阻抑(类似于130aT(4个靶标))与126T(4个靶标)和126T/130aT(2+2个靶标)相比略少。至于后2个靶序列，126T/130aT(2+2个靶标)优于126T(4个靶标)，因为它给出最大调节指数。此外，通过2个独立的miRNA确保了转基因减量调节，进一步降低了干扰内源miRNA调节的风险，因此提高了miRT的安全性和功效。图9:溶酶体酶在HSPC中的过量表达。在LV转导后，将在mHSPC(A)和hHSPC(B)中的酶表达水平归一化至野生型。与ARSA和IDUA相比，GALC表达显著较低。图10:在LV介导的GALC表达时鼠HSPC的功能受损。(A)对用GALC和对照LV转导的mHSPC的CFC测定。统计集落数(#)/板(Y左轴，柱)，并测定整合的LV拷贝数/细胞(VCN)(Y右轴，点)。与GFP.LV(η=10)和ARSA.LV(η=8)转导细胞相比，GALC.LV转导的-/-mHSPC(η=12次独立实验)产生显著较低的集落数。当mHSPC用mirl42TGALC.LV转导时(η=6)，未观察到这种损害。*ρ<0.001，集落数/板和VCN两者的单因素方差分析。给出了平均值土SD。用-/_和+/+mHSPC得到类似结果。(B)对转导的mHSPC测定GALC活性。在GALC.LV转导后，GALC-/-(从此为-/-)(η=5)和GALC+/+(从此为+/+)(η=5)mHSPC显示GALC活性提高至野生型水平(用GFP.LV转导的+/+mHSPC，η=5)的2倍。用mirl42调节的GALC.LV转导的mHSPC(mirl42T)(η=3)中未检测到活性提高。图11:在LV介导的GALC表达时人HSPC的功能受损。㈧对用GALC和对照LV转导的hHSPC的CFC测定。统计集落数(#)/板(Y左轴，柱)，测定整合的LV拷贝数/细胞(VCN)(Y右轴，点)。与对照细胞(η=5)相比，GALC.LV转导的n.d.(η=4)和GLDhHSPC(η=4)在集落形成中出现显著损害,这在下面的mirl42TGALC.LV转导(η=4)中未观察到。当与GFP/ARSA/GALCmirl42T.LV对照相比时，由GALC.LV转导的hHSPC获得的集落具有显著较低的载体含量。*集落数/板和VCN两者的单因素方差分析的P<0.001。给出了平均值土SD。(B)对转导的hHSPC测定的GALC活性。在GLDhHSPC(η=3)中，GALC.LV转导允许在n.d.水平上重建GALC活性，而n.d.hHSPC的转导(CB的η=4，BM的η=3)导致酶超过GFP.LV转导水平(η=3)的过量表达。在用mirl42调节的GALC.LV转导的hHSPC(mirl42T)(η=3)中未检测到活性提高。图12:在HSCT时twi小鼠的存活。(A)GFP.LV和GALC.LV的示意图。(B)接受15HSCT的twi小鼠的平均存活期。与未治疗对照(UT)(η=10)相比，移植有全BM(TBM)(η=12)或GFP.LV转导+1+mHSPC和未转导Scal-祖细胞(GFP.LV+l+Lin-&+l+Scal_，η=7)或GFP.LV转导+1+mHSPC和GFP.LV转导Scal-祖细胞(GFP.LV+l+Lin-&GFP.LV+1+Scal-，η=5)的twi小鼠，获得较长的存活期。与TBM或+Ι+Lin-和Scal-移植小鼠相比，接受GALC.LV转导-I-mHSPC和+Ι+Scal-祖细胞的小鼠(η=7)的生命期限显著较长。相反，用GALC.LV转导的-I_Lin-&-I-Scal-(n=13)移植不会导致生命期限延长。对照组移植有GFP.LV转导+l+HSPC(+l+Lin-)的小鼠(η=10);移植有GFP.LV转导+Ι+Scal-祖细胞的小鼠(η=8)。*单因素方差分析检验的P<O.01。(C)表示移植有GFP.LV转导的+Ι+mHSPC和Scal-祖细胞的twi小鼠的外周血中GFP+植入细胞百分比的代表图。图13FVB/twi小鼠中mHSPC的体内功能受损。按规定接受mHSPC移植的小鼠的平均存活期。与未治疗对照(UT)相比，移植有GFP.LV转导的+/+mHSPC的-/-小鼠(η=11)获得较长的存活期；相反，在致死照射后，移植有GALC.LV转导的-/-mHSPC的-/-(η=9)和+/_(°)(η=5)的小鼠无法存活。表2:移植后20天和120天(η=3/时间点)移植有所列出的mHSPC(用GALC.LV或GFP.LV转导)的-/-或+/-小鼠BM中检测的平均VCNSD0(。)+/_宿主.(§)使用+/+mHSPC得到类似结果。图14:表达GALC的鼠和人HSPC的细胞凋亡。(A-B)在基因转移后2天和5天，对-/-mHSPC(左)和hHSPC(右)(来源于n.d.CB和GLDBM)进行的TUNEL测定。报导了相对于有核细胞总数的％TUNEL+核。8个视野和100个细胞为统计条件。使用+/+mHSPC得到类似结果。(A)在转导后2天和5天，大部分GALC.LV转导的mHSPC和hHSPC均为TUNEL阳性。⑶在用指定LV转导后2天和(mHSPC)天，对mHSPC和hHSPC的核进行TUNEL测定(红色)和ToProCTPIII，蓝色)染色代表性照片(通过三激光共焦显微镜-Radiance2100，BioRad获得照片；从单一光学切片序贯获得荧光信号，并通过AdobePhotoshopCS软件分析；放大倍数IOOx)。(C)对mHSPC(上图)(来自-/-供体小鼠)和hHSPC(下图)(来自n.d.CB)进行的膜联蛋白V染色的细胞突光测定分析(Cytofluorimetricanalysis)。与GFP转导对照相比，在GALC.LV转导的mHSPC和hHSPC中凋亡细胞的部分较高。CMT=喜树碱(Camptotecin)治疗的阳性对照。用FACSCalibur2,BecktonDickinson进行数据采集。对至少10，000个事件进行了评分，数据用Flowjo8.5.3软件进行处理。给出了得自-/-mHSPC和n.d.CB(且GLDBM用于TUNEL)的数据，但是与-/-细胞相比，在+/+mHSPC的GALC转导后得到类似研究结果，以及在n.d.BM(TUNEL和膜联蛋白V)和在GLDBM(膜联蛋白V)hHSPC中与CB细胞相比，得到类似的研究结果。图15=IGFl处理防止表达GALC的HSPC凋亡。(A)对用或未用IGFI处理的GALC.LV和ARSA.LV转导的mHSPC进行的CFC测定。对集落数(#)/板(Y左轴，柱)进行统计，测定了整合的慢病毒载体拷贝数/细胞(VCN)(Y右轴，点)。与GALC.LV转导的未处理细胞(η=4次独立实验)相比，IGFI处理诱导较高集落数的生长。在抗凋亡处理时，GALC.LV转导细胞的VCN接近ARSA.LV转导对照细胞的VCN(对于CFC数和VCN单因素方差分析*=P<0.001，关于处理的GALC转导mHSPC与未处理GALC.LV转导细胞的比较；p>0.05，关于处理的GALC.LV转导mHSPC与ARSA.LV转导细胞的比较)。(B)自处理的mHSPC生长的集落还显示出大小增大(右照片，放大倍数5x)。(C)对用或未用IGFl处理的GALC.LV和ARSA.LV转导的mHSPC的TUNEL测定。8个视野和100个细胞为统计条件。大多数处理细胞为TUNEL阴性(单因素方差分析p<O.001，与未处理GALC.LV转导细胞相比；p>O.05，与ARSA.LV转导细胞相比)。(D)对来自-/-或+/+小鼠的转导mHSPC所测得的GALC活性。当与转导的未处理对照(η=6)相比时，IGFl处理不显著影响GALC表达水平(η=3)。给出了平均值SD。图16:转导细胞中组织蛋白酶D活化的分析。如所表明的，在基因转移后以不同间隔，对GFP.LV或GALC.LV转导的mHSPC和U937细胞的组织蛋白酶D的蛋白质印迹分析。活化形式相当于30kDa膜结合的同种型，用箭头表示。与GFP.LV转导细胞相比，在基因转移后的GALC.LV转导细胞中，未观察到组织蛋白酶D的活性形式明显蓄积。在培养7天(GFP7d)后，前体(48kDa，箭头)在GFP转导细胞中蓄积，而其蓄积在GALC(GALC5d)存在下较不明显，7天后前体和成熟形式两者最终消失。抗肌动蛋白用作蛋白质加样的对照。图17:不同细胞类型的基础GALC活性。归一化至野生型mHSPC水平的基础GALC活性。与mHSPC相比，初生野生型少突胶质细胞(η=4)和小胶质细胞(η=4)两者均具有较高的GALC活性。图18:在髓样细胞中对GALC从头表达的敏感性。转导后5天，TUNEL测定(相对于总有核细胞的％TUNEL+细胞，位于Y左轴，柱)、GALC活性测定(位于Y右轴，点)、可能时对(A)人单核细胞，(B)单核细胞人细胞系U，(C)鼠巨噬细胞和D)鼠小胶质细胞进行的专用染色的结果。在全部测定条件下，TUNEL染色表明发生较少细胞凋亡/不发生细胞凋亡(每种条件下统计>6个视野和>250个细胞)，尽管高效转导(在(C)中通过对巨噬细胞的抗HA染色评价)，并且在所有其它样品(ARSA.LV-或GFP.LV-转导细胞)中达到高于基础水平的持续GALC表达。给出了平均值土SD。(C和D)对GALC/GALC-HA.LV或GFP.LV转导巨噬细胞(C)和小胶质细胞⑶进行TUNEL测定的代表性照片。通过三激光共焦显微镜(Radiance2100,BioRad)获得照片。序贯获取单一光学切片的荧光信号，并通过AdobePhotoshopCS软件分析。放大倍数C中80x,D中IOOx0图19:淋巴细胞中对GALC从头表达的敏感性。转导后5天，对T和B淋巴细胞进行的TUNEL测定(相对于总有核细胞的％TUNEL+细胞，位于Y左轴，柱)、GALC活性测定(位于Y右轴，点)的结果。TUNEL染色表明发生较少细胞凋亡/不发生细胞凋亡(每种条件统计>6个视野和>250个细胞)，尽管高效转导(见高于基础水平的持续GALC表达)。给出了平均值土SD。图20:少突胶质细胞中对GALC从头表达的敏感性。㈧转导后5天进行的TUNEL测定(相对于总有核细胞的％TUNEL+细胞，位于Y左轴，柱)、GALC活性测定(位于Y右轴，点)。TUNEL染色表明发生较少细胞凋亡/不发生细胞凋亡(每种条件统计>6个视野和>250个细胞)，尽管高效转导(见高于基础水平的持续GALC表达)。给出了平均值土SD。(B)GALC.LV或GFP.LV转导少突胶质细胞的TUNEL测定的代表性照片。通过对非转导细胞(UT)的NG2和Gal-Cer染色来证实少突胶质细胞制备物的纯度，同时针对GALC.LV-转导细胞用F4/80对小胶质细胞染色；使用T0Pr0(TPIII)对核染色。通过三激光共焦显微镜(Radiance2100，BioRad)获得照片。序贯获取单一光学切片的荧光信号，并通过AdobePhotoshopCS软件分析。放大倍数40x。图21:通过miRNA126对GALC表达的调节。⑷GALC.miRNA126Tag.LV的示意图。(B-C)对用GALC.miRNA126Tag.LV(GALC.126miT)或用GALC.LV或GFP.miRNA126Tag.LV转导的-I-mHSPC进行的GALC活性测定和CFC测定。(B)根据+1+水平(第一栏)使活性归一化。用GALC.miRNA126Tag.LV转导的细胞以超生理水平过量表达GALC。(C)统计集落数(#)/板(Y左轴，柱)，并测定整合的慢病毒载体拷贝数/细胞(VCN)(Y右轴，点)。与GALC.LV转导细胞相比，通过miRNA126阻抑GALC表达允许较高集落数的生长(η=4次独立实验)。*ρ<O.01,单因素方差分析检验。图22=GALC表达的miRNA126调节阻止mHSPC凋亡。(A)对GALC.miRNA126Tag.LV或GALC.LV和GFP.miRNA126Tag.LV-转导的mHSPC进行的TUNEL测定。每种条件下统计彡8个视野和彡100个细胞。大多数GALC.miRNA126Tag.LV转导细胞呈TUNIEL阴性。(B)转导后5天，对GALC.miRNA126Tag.LV或GALC.LV转导的mHSPC-/-的核进行的TUNEL测定(红色)和ToProCTPIII，蓝色)染色代表性照片(通过三激光共焦显微镜-Radiance2100，BioRad获得照片；序贯获取单一光学切片的突光信号，并通过AdobePhotoshopCS软件分析；放大倍数40x)。图23=HSPC中从头GALC表达的毒性和通过miR-126调节拯救。使用指定LV(A)转导获自Galc-/-(-/-)和野生型(+/+)小鼠的鼠HSPC和人HSPC，以及分别得自正常供体的脐血(CB)和骨髓(BM)。测定转导鼠(上图)和人(下图)HSPC的体外培养子代中的GALC活性⑶和载体拷贝数(VCN)(C)(-/-和+/+HSPC的汇总数据见上图C)。(D)报导了在用指定LV转导结束时对鼠-/-(上图)和人(下图)HSPC进行的集落形成试验(clonogenicassay,CFC)得到的集落数(#)。(E)用指定LV转导后2天,对鼠-/-HSPC(上图)和来自正常供体的CB和BM的⑶34+细胞(下图)进行TUNEL测定。对转导细胞中细胞凋亡的频率进行评价TUNEL+细胞)。每个点表示独立的样品(B-E)。在E中，每个样品统计彡8个视野和彡100个细胞。*:p<0.05#p<0.01;#*p<0.001。(F)给出了对GFPLV转导HSPC和GALCLV转导HSPC的代表性TUNEL染色。放大倍数100X。图24=HSC基因治疗后GLD小鼠的生存期延长。将Galc-/-或+/+鼠HSPC用指定载体转导，并按照㈧的实验方案，静脉内移植到Trs小鼠中。给出转导细胞的平均存活期土SD和平均植入(η=4-26/组)，测定为在120天或死亡时在移植小鼠的BM中检测的％GFP+细胞或VCN(土SD)。(§)使用+/+mHSPC得到类似结果。第一行表示未治疗GLD小鼠的存活期(*=未照射；n.a.=不适用)。(B)将人原始单核细胞、B和T淋巴细胞和鼠小胶质细胞用指定载体转导。测定转导后>5天培养细胞的GALC活性(用与未转导细胞-UT的倍数表示)(中图)，并且在转导后2天进行TUNEL测定(用％TUNEL+细胞表示)(右图)。报道了得自GALC转导鼠和人HSPC的数据(来源于图5)和GFP转导小胶质细胞中的％TUNEL+细胞用于比较。每个点表示单独的样品，其中对彡6个视野和彡250个细胞进行统计。(C)如所示用GALCLV或GFPLV转导的小胶质细胞细胞的TUNEL染色以及针对小胶质细胞标记F4/80(GALC转导细胞)的染色或GFP的代表性照片。核用ToproIII(TPIII)标记。放大倍数100X。(D)用经GALC-126TLV转导的Galc-/-HSPC(n=26)或经GFPLV转导的Galc+/+HSPC(η=10)移植的Trs小鼠和未治疗患病对照(UT)(η=15)的Kaplan-Meier生存曲线。在成对比较的时序检验(logranktest)中，GALC-126T对比GFPp=O.002；GALC-126对比UTp<O.0001。(E)根据在死亡时间对全BM细胞测定的VCN，将GALC-126T移植小鼠分为2组。给出了在BM细胞中携带小于(平均值土SD=67±13天)或大于(平均值土SD=117±43天)5个LV拷贝的动物的存活期，在整群治疗小鼠的BM中测定的平均VCN为5。(F-I)对GALC-126T移植小鼠和对照小鼠脑切片的GALC活性(浅蓝色)进行了定性评价。给出了与野生型和未治疗Trs小鼠相比较，GALC-126T移植小鼠海马(F，G)和脑桥(H，I)的代表性切片。将GALC测定与小胶质细胞/巨噬细胞Ibal标记(F，G)和与造血标记⑶45(H，I)联合。在未治疗和GALC-126T移植Trs小鼠中存在活化造血细胞的明显浸润，后者表示在转导HSPC造血子代(G和I中的箭头表示GALC[蓝色]与棕色的Ibal[G]和CD45[I]共染色)内和在Ibal_，CD45—非造血细胞两者的GALC活性。(F，H)的放大倍数为20x,(G，I)的为40x。微小RNA(miRNA)遗传信息自DNA流向mRNA再流向蛋白质一直以来都是生物学的中心法则。换句话说，一直认为基因编码蛋白质，而蛋白质实现所有细胞功能，包括基因表达程序的调节。然而，在高等真核生物中仅有少数RNA转录物(2-3%)编码蛋白质，这对蛋白质是细胞功能的唯一效应物的中心法则提出了异议(Mercer等，2009)。实际上，目前有不断出现证据表明一类非编码的小RNA(称为“微小RNA”)在基因表达的调节中发挥重要作用。微小RNA(miRNA)是(Biffi等，2004；SadelainM.，2006；Sadelain等，2005；Gaziev等，2005；YesilipekMA.，2006;Abonour等，2000)的核苷酸长的非编码RNA，它通过引发称为RNA干扰(RNAi，见下文)的过程而在转录后水平负调节基因表达(BartelDP.，2004)。最早在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)发现了lin_4和let_7形式的微小RNA,研究表明它们调节幼虫发育的时机(Lee等，1993;Reinhart等,2000)。这个发现导致了对高等真核生物中控制基因表达的类似非编码RNA的寻找。所有生物均表达miRNA(其中许多是种间系统发育上保守的)的发现，被认为是生物学领域的革命。根据参比微小RNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/),在编写本发明时，已在人中鉴定出695种不同miRNA。微小RNA参与几乎所有生物学过程，包括发育、分化、增殖和细胞凋亡(Xiao和RajeWsky，2009)。它们还在诸如癌症、心力衰竭和代谢紊乱等疾病中起重要作用(Xiao等，2009；Divaka等，2008；Krutzfeldt等，2006)。微小RNA基因分散在除Y染色体以外的所有人染色体中。它们位于基因组的非编码区或蛋白质编码基因的内含子内。大约50%的miRNA以转录为多顺反子初级转录物的聚簇出现(Lagos-Quintana等,2003)。与蛋白质编码基因类似，miRNA通常从聚合酶-II启动子转录，产生所谓的初级miRNA转录物(pri-miRNA)。这种pri_miRNA然后通过一系列的内核分离(endonucleolyticcleavage)步骤加工,该步骤由属于RNA酶III型家族的两种酶Drosha和切酶(Dicer)进行。自pri-miRNA,长约60个核昔酸的莖环(^ISmirna前体(pre-mirna)),被由Drosha和DiGeorge综合征临界区基因(DGCR8)组成的特异性核复合体切离，所述核复合体在原始茎环碱基附近剪切两条链，留下5’磷酸和2bp长的3’突出端。然后，通过RAN-GTP和核输出蛋白将pre-mirna从核主动运输到胞质(Yi等，2003；Lund等，2004)。然后，切酶在不受Drosha切割限定的茎环末端实施双链切割，产生由成熟miRNA和双链体的相反链组成的19-24bp双链体，称为miRNA*(BartelDP.，2004)。与热动力学不对称规则一致，仅双链体的一条链选择性加载到RNA诱导沉默复合体(RISC)上，并作为成熟微小RNA蓄积。该链通常是其5’端与其互补链较不紧密配对的链，正如通过引入siRNA双链体各链5’端的单一核苷酸错配所证实的一样(Tomari等，2005)。然而，有一些支持双链体两条链以相似程度蓄积的miRNA(Schwarz等，2003)。微小RNA引发RNAi，与广泛用于实验基因敲减的小干扰RNA(siRNA)非常相像。miRNA和siRNA间的主要差异是其生物发生。一旦加载到RISC上，小RNA分子的指导链与优先存在于蛋白质编码基因3'非翻译区(3'UTR)的mRNA靶序列相互作用。研究表明，从miRNA的5'端起计第2_8个核苷酸(所谓的种子序列)是引发RNAi所必需的(Brennecke等，2005)。如果整个指导链序列与mRNA靶完全互补，对于siRNA和植物miRNA通常正是这种情况，则mRNA通过小RNA双链体的Argonaute(Ago)蛋白(也称为“切片机(slicer)”)参与到RNA诱导沉默复合体(RISC)中而被内核分离。DGRC(DiGeorge综合征临界区基因8)和TRBP(TAR(HIV)RNA结合蛋白2)是分别通过Drosha和切酶RNA酶III酶促进成熟miRNA生物发生的双链RNA结合蛋白。miRNA双链体的指导链掺入到通过不完全碱基配对识别特异性靶标和诱导转录后基因沉默的效应物复合体RISC中。对这种调节方式提出了若干机制miRNA可诱导翻译起始的阻抑、通过脱腺苷化标志靶标mRNA用于降解或将靶标隔离在胞质P体(P-body)中。另一方面，如果仅种子序列与靶标mRNA完全互补但保留具有不完全配对的碱基，则RNAi通过导致翻译阻抑的多种机制起作用(BartelDP.，2004；PillaiRS.，2005；BartelDP.，2009)。真核mRNA降解主要通过如下过程产生缩短mRNA3’端的聚A尾，5’端脱帽(de-capping)，接着5’_3’外切核酸酶消化，且miRNA在富集mRNA衰变途径的组分的分散胞质区域(所谓的P体)中蓄积(Lui等，2005)。可用于本发明的miRNA是在造血干细胞和/或祖细胞中表达但不在分化细胞中广泛表达的miRNA。优选的实例包括mir-130a、mir-126和mir-223。其它合适的微小RNA包括在胚胎干细胞和所谓的iPS细胞中表达的微小RNA。例如miR-302a、miR-373和miR-292在多潜能细胞(ES，iPS)中特异性表达，但不在成体类型干细胞或分化细胞中表达。let-7家族微小RNA在除多潜能细胞(ES，iPS)以外的所有细胞中表达。miR-124a在神经元中特异性表达。基因载体MiRNA可与合适的基因载体，即适于递送目标基因(转基因)的载体(例如病毒载体)一起使用。适于基因治疗的病毒载体是本领域众所周知的。可用于本发明的病毒载体的实例参见W02007/000668。已对来源于若干不同科的病毒进行修饰以产生用于基因递送的病毒载体。可用于本发明的病毒包括反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、单纯疱疫病毒、小RNA病毒和甲病毒。本发明优选使用反转录病毒，包括慢病毒。本发明可用于控制载体中所包括的转基因的表达。本发明还可用于控制载体的表达。例如，可被本发明的mir-RNA控制的载体为溶瘤病毒。造血干细胞移棺造血干细胞移植(HSCT)是来源于骨髓(在这种情况下称为骨髓移植)或血液的血液干细胞的移植。干细胞移植是血液学和肿瘤学领域的医学手术，最常为患有血液、骨髓疾病或某些癌症类型的人实施。由于干细胞生长因子GM-CSF和G-CSF的可得性，大多数造血干细胞移植手术目前使用自外周血而不是自骨髓采集的干细胞进行。采集外周血干细胞提供较大的移植物，不需要给供体进行全身麻醉来采集移植物，导致较短的植入时间，并可得到较低的长期复发率。造血干细胞移植仍然是一种具有许多可能的并发症的危险手术；其在传统上为患有危及生命的疾病的患者而保留。虽然不时在实验上用于非恶性和非血液适应症，例如严重致残的自身免疫病和心血管病，但致命并发症的风险似乎太高以至于得不到更广泛的认可。许多HSCT的接受者是不能受益于用化学治疗的长期治疗或已对化学治疗有抗性的多发性骨髓瘤或白血病患者。HSCT的候选人包括其中患者患有先天缺陷(例如重度联合免疫缺陷或伴有缺陷型干细胞的先天性中性粒细胞减少症)的儿科病例，以及患有再生障碍性贫血的儿童或成人(他们在出生后丧失干细胞)。用干细胞移植治疗的其它病况包括镰状细胞病、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、淋巴瘤、尤因肉瘤(Ewing'sSarcoma)、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤和霍奇金病(Hodgkin'sdisease)。最近已开发出需要较少剂量的预备性化疗和放射治疗的非清髓性即所谓的“微移植”手术。这允许HSCT在老年人和另外被认为太虚弱而承受不了常规治疗方案的其它患者中进行。本发明的目的在于通过提高其安全性和/或功效而拓宽这类治疗的治疗应用。疾疽本发明特别可用于基因治疗。具体地讲是涉及可能有毒的转基因的表达的治疗。可根据本发明治疗的疾病包括溶酶体贮积症(LSD)，例如球形细胞脑白质营养不良(GLD)。通过本发明可治疗的疾病的另一个实例是慢性肉芽肿病(CGD)。球形细胞脑白质营养不良(GLD)或克拉伯病是由GALC基因的突变引起的，其引起称为半乳糖神经酰胺酶的酶缺乏。未代谢的脂质的积累影响神经的保护性髓鞘(隔离许多神经的覆盖物)的生长，并引起运动技能严重退化。作为一组称为脑白质营养不良的病症的部分，克拉伯病由髓鞘的不完全生长和发育引起。GLD的基因治疗包括将GALC基因引入患者中。例如，可将GALC导入HSPC或HSC中，然后将之移植入患者中。本发明人发现在LV介导的GALC基因转移和表达后，鼠和人HSPC的毒性及体内、外功能受损。这种毒性可通过使用本发明的基因载体来克服。通过本发明的载体系统递送的一种或多种治疗基因可单独使用或与其它治疗或治疗的组成部分联用。例如，本发明的载体可用来递送一种或多种用于治疗W0-A-98/05635中所列病症的转基因。为了容易查阅，下面提供该疾病列表的部分癌症、炎症或炎性疾病、皮肤病症、发热、心血管作用(cardiovasculareffects)、出血、凝血和急性期反应、恶病质、食欲缺乏、急性感染、HIV感染、休克状态、移植物抗宿主反应、自身免疫病、再灌注损伤、脑膜炎、偏头痛和阿司匹林依赖性抗血栓形成；肿瘤生长、侵袭和扩散、血管生成、转移瘤、恶性肿瘤、腹水和恶性胸腔积液；脑缺血、缺血性心脏病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨质疏松症、哮喘、多发性硬化、神经变性、阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease)、动脉粥样硬化、中风、脉管炎、克罗恩病(Crohn'sdisease)和溃瘍性结肠炎；牙周炎、銀炎；银屑病、特应性皮炎、慢性溃疡、大疱性表皮松解；角膜溃疡、视网膜病和手术伤口愈合；鼻炎、变应性结膜炎、湿疹、过敏反应；再狭窄、充血性心力衰竭、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化或内皮硬化(endosclerosis)。另外，或在备选方法中，本发明的载体可用来递送一种或多种用于治疗W0-A-98/07859中所列病症的转基因。为了容易查阅，下面提供该列表的部分细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治疗免疫缺陷，包括被人免疫缺陷病毒感染；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫病，并防止移植排斥或诱导肿瘤免疫力)；调节造血作用，例如治疗骨髓病或淋巴病；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长，例如用于伤口愈合、治疗烧伤、溃疡和牙周病和神经变性；抑制或激活促卵泡激素(调节生育力)；趋化/趋化因子活性(例如用于将特定细胞类型动员到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如败血症性休克或克罗恩病)；作为抗微生物药；例如代谢或行为(behaviour)的调节剂；镇痛药；治疗特定营养缺乏症；用于治疗例如银屑病、用于人用或兽用药物。另外，或在备选方法中，本发明的反转录病毒载体可用于递送一种或多种用于治疗TO-A-98/09985中所列病症的转基因。为了容易查阅，下面提供该列表的部分巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性及因而的抗炎活性；抗免疫活性，即针对细胞和/或体液免疫应答(包括与炎症无关的反应)的抑制作用；抑制巨噬细胞和T细胞粘附胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及增量调节fas受体在T细胞中的表达；抑制不良免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风湿性关节炎、超敏反应相关炎症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫病、动脉粥样硬化相关炎症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗死、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征或其它心肺病、与消化性溃疡、溃疡性结肠炎和胃肠道的其它疾病相关的炎症、肝纤维化、肝硬化或其它肝病、甲状腺炎或其它腺病、肾小球性肾炎或其它肾病和泌尿科疾病、耳炎或其它耳鼻喉病、皮炎或其它皮肤病、牙周病或其它牙病、睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其它免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它免疫和/或炎症相关性妇科疾病、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症例如视网膜炎或囊样黄斑水肿、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、退行性眼底病变(degenerativefondusdisease)的免疫和炎性成分、眼外伤的炎性成分、由感染引起的眼炎、增殖性玻璃体视网膜病、急性缺血性视神经病变、例如青光眼滤过手术后的过度瘢痕形成、对眼植入物的免疫和/或炎症反应及其它免疫和炎症相关性眼科疾病、其中在中枢神经系统(CNS)或任何其它器官两者中免疫和/或炎症抑制可能有益的与自身免疫病或病况或病症有关的炎症、帕金森病(Parkinson'sdisease)、因帕金森病治疗引起的并发症和/或副作用、艾滋病相关痴呆综合症、HIV相关脑病、德维克病、小舞蹈病、阿尔茨海默病和CNS的其它变性疾病、病况或病症、中风的炎性成分、脊髓灰质炎后综合征、精神障碍的免疫和炎性成分、脊髓炎、脑炎、亚急性致硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、格-巴综合征(Guillaim-Barresyndrome)、小舞蹈病、重症肌无力、假脑瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病(Huntington'sdisease)、肌萎缩性侧索硬化、CNS压迫或CNS创伤或CNS感染的炎性成分、肌萎缩和营养不良的炎性成分、中枢神经系统和外周神经系统的免疫和炎症相关疾病、病况或病症、创伤后炎症、败血症性休克、感染性疾病、手术的炎症并发症或副作用、骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用、基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用(例如因病毒载体感染所致)或爱滋病相关炎症、用于阻抑或抑制体液和/或细胞免疫应答、通过减少单核细胞或淋巴细胞的量治疗或改善单核细胞或白细胞增殖性疾病(例如白血病)、在移植天然或人工细胞、组织和器官(例如角膜、骨髓、器官、晶状体、起博器、天然或人工皮肤组织)的情况下用于预防和/或治疗移植排斥。本发明还提供通过基因治疗治疗个体的药物组合物，其中组合物包含治疗有效量的本发明的载体或由所述载体产生或得到的病毒颗粒，所述载体包含一种或多种可递送治疗性和/或诊断性转基因。药物组合物可用于人或动物。医师通常可确定最适于个体受试者的实际剂量，该剂量将随具体个体的年龄、体重和反应而变化。组合物可任选包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅料。可根据预定的给药途径和标准药学实践进行药用载体、赋形剂或稀释剂的选择。药物组合物可包含以下作用剂作为载体、赋形剂或稀释剂或者除载体、赋形剂或稀释剂以外还包含以下作用剂任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂和可有助于或增加病毒进入靶位点的其它载体物质(例如脂质递送系统)。适当时，可通过以下的任一种或多种给予药物组合物吸入、呈栓剂或阴道剂的形式；局部施用，呈洗剂、溶液剂、乳膏剂、软膏剂或扑粉剂形式；通过使用皮肤贴剂；口服，含有诸如淀粉或乳糖等赋形剂的片剂形式、或呈单独或与赋形剂混合的胶囊剂或丸剂(ovule);或含有矫味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或混悬剂的形式；或它们可经诸如海绵体内、静脉内、肌内或皮下等胃肠外注射。对于胃肠外给予，组合物可能最好以含有其它物质的无菌水溶液的形式使用，所述其它物质为例如足够的盐或单糖使所述溶液与血液等渗。对于口腔或舌下给予，组合物可以可按常规方式配制的片剂或锭剂形式给予。通过本发明的载体系统对一种或多种治疗基因的递送可单独使用或与其它治疗或治疗的组成部分联用。可治疗的疾病包括但不限于癌症、神经疾病、遗传疾病、心脏病、中风、关节炎、病毒感染和免疫系统疾病。合适的治疗基因包括编码肿瘤阻抑蛋白、酶、前药激活酶、免疫调节分子、抗体、工程改造的免疫球蛋白样分子、融合蛋白、激素、膜蛋白、血管活性蛋白或肽、细胞因子、趋化因子、抗病毒蛋白、反义RNA和核酶的基因。实施例核苷酸序列黑体字与miRNA互补的靶序列。总体来说，我们使用被4_6个核苷酸的接头分隔开的4拷贝的miRNA靶标。然而，可使之最优化。miR-126UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGmiR_126T序列权利要求1.一种用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血祖细胞(HSPC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSPC中表达但不防止或降低其在分化细胞中表达。2.一种用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血干细胞(HSC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低所述核苷酸序列在HSC中表达但不防止或降低其在分化细胞中表达。3.一种用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个与核苷酸序列有效连接的与选自mir-130a、mir-126、mir-223、126/130aT(2/2组合)和126T(2个靶标)的miRNA相应的miRNA序列靶标。4.权利要求3的基因载体，其包含与mir-130a和mir_126相应的miRNA序列靶标。5.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述核苷酸序列控制载体的表达。6.权利要求1-5的基因载体，其中所述核苷酸序列是转基因。7.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述载体是病毒载体。8.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述载体可来源于慢病毒。9.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述载体包含组织特异性启动子。10.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述组织特异性启动子选自CDllb、c-Fes和CYBB和TEK。11.前述权利要求中任一项的基因载体，其中所述转基因编码酶。12.权利要求11的基因载体,其中所述酶选自溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶、gp91phox和干扰素-α。13.—组用于产生病毒载体颗粒的DNA构建体，包括编码可包装的病毒载体基因组的DNA构建体，所述DNA构建体包含至少一个权利要求1-5中任一项定义的miRNA序列靶标，并任选包含转基因。14.一种用于制备病毒载体颗粒的方法，所述方法包括将权利要求13的DNA构建体组导入宿主细胞，并得到病毒载体颗粒。15.权利要求14的方法，其中所述宿主细胞包含相应的miRNA。16.一种病毒载体颗粒，其通过权利要求14或15的方法制备。17.一种药物组合物，其包含权利要求1-12或16中任一项的基因载体或颗粒。18.一种细胞，所述细胞用权利要求1-12或16中任一项的基因载体或颗粒感染或转导。19.权利要求18的细胞，所述细胞是造血干细胞或造血祖细胞。20.至少两个不同的与选自以下的miRNA相应的miRNA序列祀标的组合mir_130a、mir-126、mir-223和126/130aT(2/2组合)和126T(2个靶标)。21.权利要求20的组合，其中所述miRNA序列靶标同时、单独或序贯使用。22.权利要求1-12中任一项的载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于在造血干细胞或造血祖细胞中防止或降低转基因表达的药物中的用途。23.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于治疗选自以下的疾病的药物中的用途球形细胞脑白质营养不良、慢性肉芽肿病、重度联合免疫缺陷(SCID)和实体瘤。24.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于提高与基因治疗相关的造血干细胞或造血祖细胞的存活机会的药物中的用途。25.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于提高基因治疗的安全性和/或功效的药物中的用途。26.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于防止造血干细胞或造血祖细胞的细胞凋亡的药物中的用途，其中所述细胞凋亡由转基因的表达引起。27.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合在制备用于监测造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的药物中的用途。28.权利要求22-27中任一项的用途，其中所述药物用于造血细胞治疗。29.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于防止或降低转基因在造血干细胞或造血祖细胞中表达。30.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于治疗选自以下的疾病球形细胞脑白质营养不良、慢性肉芽肿病、重度联合免疫缺陷(SCID)和实体瘤。31.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于提高与基因治疗相关的造血干细胞或造血祖细胞的存活机会。32.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于提高基因治疗的安全性和/或功效。33.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于防止造血干细胞或造血祖细胞的细胞凋亡，其中所述细胞凋亡由转基因的表达引起。34.权利要求1-12中任一项的基因载体、权利要求16的颗粒、权利要求17的药物组合物、权利要求18-19的细胞或权利要求20-21的组合，其用于监测造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段。35.权利要求29-34中任一项的基因载体，其用于造血干细胞治疗。36.与选自mir-130a、mir-126、mir-223、126/130aT(2/2组合)和126T(2个靶标)的miRNA相应的miRNA序列靶标在制备用于基因治疗的药物中的用途。37.用于基因治疗的与选自mir-130a、mir-126和mir-223的miRNA相应的miRNA序列靶标。38.测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定细胞中的miRNA的表达水平，其中所述miRNA对应于与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列，其中所述miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。39.测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定细胞中的至少两种不同miRNA的表达水平，其中所述miRNA对应于与核苷酸序列有效连接的miRNA靶序列，其中所述miRNA防止或降低所述核苷酸序列在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达；和对不同miRNA的表达水平进行比较。40.测定造血干细胞或造血祖细胞的分化阶段的方法，所述方法包括测定转基因在所述造血干细胞或所述造血祖细胞中的表达水平，其中所述转基因与miRNA序列靶标有效连接，由此相应的miRNA防止或降低所述转基因在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中的表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。41.权利要求38-40的方法，其中所述miRNA选自mir_130a、mir-126,mir-223,126/130aT(2/2组合)和126T(2个靶标)。全文摘要一种用于基因治疗的基因载体，所述基因载体包含至少一个在造血祖细胞(HSPC)或造血干细胞(HSC)中具有相应miRNA的与核苷酸序列有效连接的miRNA序列靶标，所述相应miRNA防止或降低该核苷酸序列在HSPC或HSC中表达，但不防止或降低其在分化细胞中表达。文档编号A61P35/00GK102596255SQ201080030337公开日2012年7月18日申请日期2010年4月30日优先权日2009年4月30日发明者A·比菲,B·R·金特纳,L·纳尔迪尼申请人:圣拉斐尔德尔蒙特塔博基金中心,泰莱托恩基金会