专利名称：5’-甲硫腺苷的神经保护特性的制作方法
技术领域：
本发明适用神经、精神疾病以及老化的治疗剂领域。具体地，其涉及小分子5’甲硫腺苷的神经保护效应。
背景技术：
老化、神经和精神疾病引起神经细胞的死亡和损伤。常见和相关的对神经系统的损伤主要包括神经变性、缺血、炎症、免疫应答、创伤和癌症。因为这些疾病，神经细胞在数分钟或数小时内死亡，或者以受损状态从这种最初的损伤中存活下来，所述受损状态引发神经变性，最终同样导致细胞死亡。考虑到神经系统在基本运动技能和感觉方面的重要性，人们有兴趣寻找保护神经系统的治疗性方法。神经保护旨在防护、恢复、治愈或再生神经系统及其细胞、结构和功能(Vajda et al.2002,J Clin Neurosci 9 :4_8)。神经保护的一个目标是防止或最小化对神经系统的初始损伤效应，或者防止或最小化引起轴突、神经元、突触和树突损伤的内源和外源毒性过程的后果。治疗策略一般基于单个被提出的损伤因子的调节。尽管这样的治疗在高度受限的动物模型中显示是有利的，但它们不大可能在更复杂的人类疾病中被证明有效，所述人类疾病涉及在遗传上不同的人群中更多变的损伤严重性(Faden and Stoica 2007, Arch Neurol. ；64 :794-800)。重要的是，由于推测的神经元死亡机制都是复杂而多变的，例如氧化应激、线粒体机能障碍、蛋白质聚集、凋亡和炎症(Youdim et al. 2005,TIPS 26 :27-35), 因此需要对多种损伤机制具有多潜力效应的单个化合物。目前研究的一些神经保护药物包括以下几类抗炎剂、N-甲基D-天冬氨酸 (NMDA)拮抗剂、α-氨基-3-羟基-5-甲基_4_异噁唑丙酸(AMPA)拮抗剂、地塞比诺 (dexanabinol)、钠通道阻断剂、促甲状腺激素释放激素(TRH)、生长因子、糖皮质激素、咖啡醇(caffeinol)、阿片样物质拮抗剂、凋亡抑制剂、自由基捕获剂/清除剂、红细胞生成素、 钙通道阻断剂、硫酸镁、抑制素。这些药剂限制次级生物化学损伤和细胞死亡的能力已在多种中风、头部损伤和脊髓损伤的动物模型中很好地确定，但是这样的神经保护治疗策略在人类损伤中的结果令人失望(Faden and Stoica 2007，Arch Neurol. ；64 :794-800)。因此，一直需要提供具有神经保护特性的药物，其优选地具有多潜力效应。5’ -甲硫腺苷(MTA)是在多胺精胺和亚精胺的合成过程中由S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)产生的亲脂含硫腺嘌呤核苷。MTA由于其较小的体积和亲水特性，是一种适于口服制剂的药物。MTA被描述为通过以下机制具有免疫调节活性抑制促炎基因和细胞因子(干扰素-Y、肿瘤坏死因子-α和诱导型一氧化氮合酶)的产生并增加抗炎细胞因子(白细胞介素-10)的产生；并且逆转脑自身免疫疾病；从而表明对多发性硬化和其他自身免疫疾病有益(Moreno et al.Diss. Abstr. Int.，C 2007，68 (1)，111 ；Ann Neurol 2006 ；60 :323-334)。 在这方面，W02006097547公开了 MTA用于预防和/或治疗自身免疫疾病，例如多发性硬化 (MS)，以及用于预防和/或治疗移植排斥。此外，US 4，454，122 (Bioresearch S. r. 1.)公开了 MTA用作抗炎、退烧和镇痛化合物。^t Kang φ (Zhongguo Shenjing Kexue Zazhi 1999,15(4),289-296 ；Yike Daxue Xuebao 1999，26 (5)，318-320)的两个研究中，已经提出MTA能够部分地抑制反应性星形细胞增多(astrogliosi^astrocytosis)。星形细胞增多是星形细胞由于邻近神经元的破坏 (一般是由于血糖过低或氧缺乏(组织缺氧))而发生的数目异常地增多。星形细胞增多是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)中的重要病理表现。EP 526866 (Bioresearch S. p. A.)公开了腺苷化合物适于用于治疗多种缺血病症，例如脑或心肌缺血的病症，或者用于任何类型的器官或组织的缺血。在Avila 等(Int J Biochem Cell Biol. 2004 ；36(11) :2125-30)的综述中，作者提出MTA能够以很多方式影响细胞过程，影响细胞的多种关键应答，包括调节基因表达、增殖、分化和凋亡。考虑到在肝脏损伤和癌症中的一些现象，他们提出MTA的治疗潜力。在全力探索MTA的神经保护潜力中，发明人惊讶地发现MTA确实可有效保护缺乏氧和葡萄糖的大脑皮质中的星形细胞和神经元；有效保护海马角(Cornu Ammonis) (CAl) 海马神经元在全脑缺血(glcAal ischemia)后不死亡；有效保护少突胶质细胞免于缺血后的兴奋性神经毒性和视神经组织损伤；有效保护遭受兴奋性神经毒性影响的混合的神经胶质-神经元培养物；有效减少营养不良轴突的数目并且有效防止髓磷脂和轴突损失。
发明内容
本发明涉及MTA、其可药用盐和/或前药作为活性成分在制备用于预防或治疗神经细胞死亡或损伤的药物中的用途。换言之，本发明涉及用于预防或治疗神经细胞死亡或损伤的MTA、其可药用盐和/或前药。类似地，本发明还涉及预防或治疗神经细胞死亡或损伤的方法，包括将有效量的MTA、其可药用盐和/或前药给予有需要的受试者。本发明还涉及MTA、其可药用盐和/或前药作为活性成分在制备神经保护药物中的用途。换言之，本发明还涉及用作神经保护药物的MTA、其可药用盐和/或前药。类似地， 本发明涉及神经保护方法，包括将有效量的MTA、其可药用盐和/或前药给予有需要的受试者ο本发明还涉及MTA、其可药用盐和/或前药作为活性成分在制备用于神经细胞再生的药物中的用途。换言之，本发明还涉及用于神经细胞再生的MTA、其可药用盐和/或前药。类似地，本发明还涉及神经细胞再生的方法，包括将有效量的MTA或其一种可药用盐和 /或前药给予有需要的受试者。本发明还涉及MTA、其可药用盐和/或前药作为活性成分在制备用于预防或治疗神经或精神疾病的药物中的用途。换言之，本发明还涉及用于预防或治疗神经或精神疾病的MTA、其可药用盐和/或前药。类似地，本发明还涉及预防或治疗神经或精神疾病的方法， 包括将有效量的MTA、其可药用盐和/或前药给予有需要的受试者。
图1 :MTA在来自大脑皮质的神经元和星形细胞的混合培养物中的毒性谱。MTA毒性谱显示所述化合物在来自大脑皮质的神经元和星形细胞的混合培养物中在测试的浓度下是无害的。(左)使用钙素-AM的活力测定。(右)乳酸脱氢酶(LDH)释放测定。在两种情况下，MTA在测定浓度下对神经元-星形细胞共培养物都是无毒的。图2 =MTA防止从大脑皮质得到的神经元和星形细胞的混合培养物中的模拟缺血。 在从大脑皮质得到的神经元和星形细胞的混合培养物中的氧-葡萄糖剥夺(OGD)-诱导的损伤和MTA的保护作用。使用20或50 μ M碘乙酸(iodoacetate，IAA)(分别为左图和右图) 测试两种缺血条件。在两种条件下，MTA都是高度保护性的。为了比较，还测试了 OR)-氨基-5-磷戊酸((2R) -amino-5-phosphonovaleric acid, APV)，一种 NMDA 受体拮抗剂。10 μ M 的 MTA 比 APV (50 μ Μ)保护性更强。* 或 #ρ < 0. 05 ；** 或 ##ρ < 0. 01。图3 局灶缺血后用MTA治疗大鼠。MTA不能防止中脑动脉(MCAO)梗塞90分钟后的大脑组织损伤。在缺血发作30分钟时开始用MTA治疗(腹膜内注射，每天两次)。再灌注第3天处死大鼠，切片并用氯化2，3，5-三苯基-2Η-四唑(TTC)染色以观察受损区域。 数值表示所述受损区域平均值士平均值标准误差(SEM)。图4 全脑缺血后用MTA治疗大鼠。MTA防止CAl海马神经元在10分钟全脑缺血后的细胞死亡。在缺血后30分钟用MTA治疗(腹膜内注射，每天两次)。再灌注第7天处死小鼠，切片并用Fluoro-jade染色以观察垂死细胞。数值表示以任意单位(AU)表示的荧光平均值士 SEM，P < 0. 01。图5 :MTA在少突胶质细胞中的毒性谱和防止兴奋性神经毒性损伤。MTA在培养的来自视神经的少突胶质细胞中的毒性谱(A)。(B)MTA防止少突胶质细胞受AMPA(10 μ M)引起的低强度兴奋性神经毒性损伤。但是，它不能防止少突胶质细胞在高AMPA剂量(100 μ Μ) 下的死亡。图6 =MTA防止视神经中的模拟缺血。AMPA/红藻氨酸和NMDA受体拮抗剂6_氰基-7-硝基-喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)以及APV单独地或者一起减轻了分离的视神经中 OGD-诱导的损伤(上图)。此外，MTA也是保护性的(下图)。*ρ < 0. 05 ；< 0. 01。图7 在纯神经元培养物中NMDA介导的神经毒性的时间过程。数据表示12个实验的平均值+标准误差。***与载体相比ρ <0.01。图8 在纯神经元培养物中NMDA-介导的神经毒性的浓度-应答曲线。数据表示 12个实验的平均值+标准误差。***与载体相比ρ < 0. 01。图9 在纯神经元培养物中NMDA-介导的胱天蛋白酶3的活性增加的时间过程。数据表示12个实验的平均值+标准误差。**与载体相比ρ < 0. 05。图10 :ΜΤΑ(100至500μΜ)在纯神经元培养物中对NMDA-介导的毒性没有作用。数据表示为12个实验的平均值+标准误差。ΜΚ(ΜΚ-801，10μΜ)*#与NMDA相比ρ <0.001。图11 :ΜΤΑ(100至500 μ Μ)在纯神经元培养物中对NMDA-介导的胱天蛋白酶3活性的增加没有作用。数据表示为12个实验的平均值+标准误差。ΜΚ(ΜΚ-801，10μΜ)***与载体和NMDA相比ρ < 0. 001。图12 =MTA(250 μ Μ)在混合的神经元-神经胶质培养物中对NMDA-介导的胱天蛋白酶3活性的增加的作用。数据表示为12个实验的平均值+标准误差。ΜΚ(ΜΚ-801， 10 μ Μ) 与载体和 NMDA 相比 P < 0. 001。
图13a 小脑器官型培养物中的神经炎症模型。A)通过共聚焦显微术得到的髓鞘碱性蛋白(MBP)(绿色)和神经丝亚基(NFL)(红色)的免疫染色。对照培养物显示髓鞘(绿色)经常与轴突对齐(a和d幅)。15μ g/ml脂多糖(LPQ处理之后的免疫染色显示仅有极少的有髓鞘神经丝(c和f幅)，而用5 μ g/ml LPS 处理的器官型培养物显示出更多被保留的髓鞘形成和更少的轴突膨大(b和e幅)。在g-i 幅中显示神经丝轻链(neurofilament light)染色。用15 μ g/ml LPS处理的小脑器官型培养物显示出轴突膨大(i幅中的箭号(arrow))和轴突横断(i图中的箭头(arrowhead))， 这在对照和用5 μ g/ml的LPS处理的器官型培养物中是没有的。处理M小时之后对器官型培养物染色。比例尺为5011111(￡1-(3幅中)、1(^111((14幅中)和20 μ m(在g-i幅中)。B) 通过ELISA测量的TNF- α浓度。LPS处理(5 μ g/ml和15 μ g/ml)诱导TNF- α在培养基中的释放，在3小时达到峰值。C)对CNPase、APP、iNOS和GAPDA的蛋白质印迹分析。15 μ g/ ml的LPS在处理M小时后诱导脱髓鞘作用(第一幅图上部)、轴突损伤(第二幅图上部) 和氧化应激(第三幅图上部中的iNOS)，并且GAPDH在1小时开始升高并持续至96小时。 5 μ g/ml诱导较小的脱髓鞘作用(第1幅底部)并且在12小时诱导轻微的轴突损伤(第2 幅图底部)。氧化应激(iNOS和DAPDH)在用15 μ g/ml处理的器官型培养物中显示相同的升高(第三幅底部和第四幅底部)。图13b 小鼠小脑器官型培养物中小胶质细胞的活化。A)用共聚焦显微术观察到的对MHCII的标记。在第2幅中，与未用LPS处理的对照(第1幅)相比，可以观察到更多MHCII阳性细胞。在第3幅中，可以观察到第2幅中的升高。B)该图显示用LPS处理如何诱导在处理后3小时的MHCII的活化。图14 =MTA在神经炎症模型中作为神经保护剂。A)通过共聚焦显微术得到的MBP(绿色)和NFL(红色)免疫染色。对照培养物显示髓鞘(绿色)经常与轴突对齐(a和d幅)。15yg/mlLPS处理后的免疫染色显示仅有极少的有髓鞘神经丝(b和e幅)，而用192μ M的MTA处理的器官型培养物显示出经常与轴突对齐的髓鞘(c和f幅)。在g-i幅中显示神经丝轻链染色。用15 μ g/ml LPS处理的小脑器官型培养物显示出轴突膨大(h幅中的箭号(arrow))和轴突横断(h幅中的箭头 (arrowhead))，其在对照和用MTA处理的器官型培养物(g幅和h幅)中没有。处理M小时后对器官型培养物染色。比例尺为50 μ m(在a-c幅中)、5 μ m(在d_f幅中)和20 μ m(在 g-i幅中)。B)通过ELISA测量的ILl-β浓度。LPS处理诱导在培养基中的释放，在3小时达到峰值。MTA处理在3小时诱导少量ILl-β释放。C)对CNPase和APP的蛋白质印迹分析。在神经炎症模型中，15 μ g/ml的LPS在处理M小时诱导脱髓鞘作用(第1幅上部) 和轴突损伤(第2幅上部)，而在用MTA处理的器官型培养物中没有(第1和第2幅底部)。图15 遭受慢性EAE并且在疾病发作后用MTA处理的C57B6小鼠的临床评分。第 1天第1天EAE评分为2或更高；安慰剂(黑色方块)，MTA 96 μ Mol/Kg(空白方块)。图16:安慰剂(黑色)或MTA(白色)处理的动物在脊髓的两个位置(颈和腰脊髓)的轴突密度的量化(如在方法部分所述)。图17.在用pre-SE MTA方案(A)、post-SE MTA方案(B)或载体(C)方案处理的成年大鼠中，毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态(SE)后30天海马NeuN免疫反应性的代表性实例。A，所述pre-SE MTA受试者显示出对齿状回和锥体细胞层中的神经元保护良好，而
7post-SE MTA小组中的大鼠显示出在齿状回中仅有轻微的细胞损失(B中箭号(arrow))。所述对照显示出在齿状回和CAl椎体细胞层区域有严重细胞损失(C)。图18. post-SE MTA对大鼠海马CAl区域的作用。用毛果芸香碱处理诱导成年大鼠90分钟的SE发作，用安定终止。SE终止之后立即每日进行MTA处理，共3天。MTA处理结束后观天将所述大鼠处死。对照大鼠接受Tris缓冲液而不是MTA。示出平均值士SEM。 发现在MTA组有朝向细胞数目增多的不显著趋势(p = 0. 057)。图19.帕金森病动物模型(用MPTP处理的C57B6小鼠)中MTA对多巴胺能神经元(TH细胞)的存活的作用。对照动物在其黑质中有正常密度的TH细胞。用MPTP处理的动物与对照相比TH细胞的数目减少40 %。相反地，在暴露于MPTP后用MTA (96 μ Μ)处理的动物与对照相比TH神经元数目有不显著的减少(10 % )，并且比MPTP动物的TH神经元数目显著增加。图20. MTA对神经元分化的作用。Α)用NGF (100ng/ml)或不同浓度的MTA处理4 天的PC12细胞。不同的处理观察到神经突发育的差异。B)用NGF(100ng/ml)或不同的MTA 浓度处理4天的PC12细胞的神经突的量化。结果表示为相对于NGF对照的分化的百分比。表21.使用Luminex技术对用NGF(100ng/ml)或不同浓度的MTA处理的PC12细胞中不同细胞内蛋白质的磷酸化百分比的定量。图22.暴露于硫酸铜(150 μ Μ)应激并且用NGF (100ng/ml)或不同浓度MTA处理 24小时的RN22细胞的细胞存活百分比(MTT测定)。图23.暴露于硫酸铜(150 μ Μ)应激并且用NGF (100ng/ml)或不同浓度的MTA处理不同时间的RN22细胞中ROS的水平的确定。图24.暴露于过氧化氢(100 μ Μ)应激并且用不同浓度的MTA处理M小时的RN22 细胞的细胞存活率百分比(MTT测定)。图25.确定暴露于过氧化氢(100 μ Μ)应激并且用不同浓度的MTA处理不同时间的RN22细胞中ROS的水平。
具体实施例方式本发明涉及ΜΤΑ、其可药用盐和/或前药作为活性成分在制备用于预防或治疗神经细胞死亡或损伤的药物中的用途。换言之，本发明涉及用于预防或治疗神经细胞死亡或损伤的ΜΤΑ、其可药用盐和/或前药。类似地，本发明涉及神经保护的方法，包括将有效量的 ΜΤΑ、其可药用盐和/或前药给予有需要的受试者。本发明还涉及ΜΤΑ、其可药用盐和/或前药作为活性成分在制备神经保护药物中的用途。换言之，本发明还涉及用作神经保护药物的ΜΤΑ、其可药用盐和/或前药。类似地， 本发明还涉及预防或治疗神经细胞死亡或损伤的方法，包括将有效量的ΜΤΑ、其可药用盐和 /或前药给予有需要的受试者。MTA,在本文中也被称作5’-甲硫腺苷，是可由例如Sigma公司提供的市售产品。或者，该化合物可通过本领域技术人员已知的方法获得，例如根据khlenk F. et al.，Arch. Biochem. Biophys.，1964，106 :95-100描述的方法从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)制备。MTA的 CAS登记号号为M57-80-9，其结构式为
权利要求
1. I.5’-甲硫腺苷(MTA)、其可药用盐和/或其前药作为活性成分在制备用于预防或治疗神经细胞死亡或损伤的药物中的用途。
2.MTA、其可药用盐和/或其前药作为活性成分在制备神经保护药物中的用途。
3.MTA、其可药用盐和/或其前药作为活性成分在制备用于神经细胞再生的药物中的用途。
4.MTA、其可药用盐和/或其前药，用于预防或治疗神经细胞死亡或损伤。
5.MTA、其可药用盐和/或其前药，用作神经保护药物。
6.MTA、其可药用盐和/或其前药，用于神经细胞再生。
7.一种预防或治疗神经细胞死亡或损伤的方法，包括将有效量的MTA或其可药用盐和 /或其前药之一给予有需要的受试者。
8.—种神经保护方法，包括将有效量的MTA或其可药用盐和/或其前药之一给予有需要的受试者。
9.一种再生神经细胞的方法，包括将有效量的MTA或其可药用盐和/或其前药之一给予有需要的受试者。
10.权利要求1-3任一项的MTA、其可药用盐和/或其前药的用途，或者根据权利要求 4-6任一项使用的MTA、其可药用盐和/或其前药，或者权利要求7-9任一项的方法，其中 MTA被给予患有神经或精神疾病的受试者。
11.权利要求1-3任一项的MTA、其可药用盐和/或其前药的用途，或者根据权利要求 4-6任一项使用的MTA、其可药用盐和/或其前药，或者权利要求7-9任一项的方法，其中 MTA被作为辅助或补充治疗剂给予患有神经或精神疾病的受试者。
12.权利要求1-3任一项的MTA、其可药用盐和/或其前药的用途，或者根据权利要求 4-6任一项使用的MTA、其可药用盐和/或其前药，或者权利要求7-9任一项的方法，其中 MTA被给予健康受试者。
13.权利要求1-3任一项的MTA、其可药用盐和/或其前药的用途，或者根据权利要求 4-6任一项使用的MTA、其可药用盐和/或其前药，或者权利要求7-9任一项的方法，其中 MTA被作为辅助或补充治疗剂给予接受一种或多种神经增强药物的受试者。
14.MTA、其可药用盐和/或其前药作为活性成分在制备用于预防或治疗选自以下神经或精神疾病的药物中的用途，所述神经或精神疾病选自视神经缺血、进行性多发性硬化症、 视神经脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、遗传性共济失调、亨廷顿病、路易体痴呆症、脊髓肌萎缩、癫痫、视神经炎、脑创伤、脑瘤、抑郁、双相型精神障碍、 精神分裂症、强迫观念和行为病、酗酒、药物滥用、脑病、脑炎、脑膜炎、慢性疲劳、纤维肌痛、 慢性疼痛、偏头痛和头痛。
15.MTA、其可药用盐和/或其前药用于预防或治疗选自以下的神经或精神疾病视神经缺血、进行性多发性硬化症、视神经脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、遗传性共济失调、亨廷顿病、路易体痴呆症、脊髓肌萎缩、癫痫、视神经炎、脑创伤、脑瘤、抑郁、双相型精神障碍、精神分裂症、强迫观念和行为病、酗酒、药物滥用、脑病、脑炎、脑膜炎、慢性疲劳、纤维肌痛、慢性疼痛、偏头痛和头痛。
16.一种预防或治疗神经疾病的方法，包括将有效量的MTA、其可药用盐和/或其前药给予有需要的受试者，其中所述神经或精神疾病选自选自视神经缺血、进行性多发性硬化症、视神经脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、遗传性共济失调、 亨廷顿病、路易体痴呆症、脊髓肌萎缩、癫痫、视神经炎、脑创伤、脑瘤、抑郁、双相型精神障碍、精神分裂症、强迫观念和行为病、酗酒、药物滥用、脑病、脑炎、脑膜炎、慢性疲劳、纤维肌痛、慢性疼痛、偏头痛和头痛。
全文摘要
本发明涉及将MTA、其可药用盐和/或前药作为活性成分在制备预防或治疗神经细胞死亡或损伤的药物、神经保护药物、再生神经细胞的药物和预防或治疗神经或精神疾病的药物中的用途。本发明还涉及预防或治疗神经细胞死亡或损伤的方法、神经保护方法、再生神经细胞的方法以及预防或治疗神经或精神疾病的方法。
文档编号A61P25/00GK102573854SQ201080035593
公开日2012年7月11日 申请日期2010年6月7日 优先权日2009年6月11日
发明者P·维洛斯拉达迪亚兹 申请人:普罗耶克托生物医学Cima有限公司