作为肿瘤生长的抑制剂的皮抑菌肽b2的制作方法

专利名称：作为肿瘤生长的抑制剂的皮抑菌肽b2的制作方法
作为肿瘤生长的抑制剂的皮抑菌肽B2本发明涉及皮抑菌肽B2用于抑制细胞的增殖和/或生长的用途。目前的癌症疗法基于放射疗法、外科手术(其有时非常无效)和/或使用阻断有丝分裂的抗癌药物。这些疗法常常是非常具有侵袭性的，这可能限制了其使用。另一种所考虑的治疗方式是免疫疗法，其在于施用将会刺激机体的免疫防御的物质。然而，患有癌症 (特别是转移性癌症)的患者并不总是对免疫疗法作出应答或者应答很差。尽管在世界上进行了大量研究，但目前还不存在有针对该病理学状态的通用疗法。除了肿瘤细胞的不受控制的增殖之外，肿瘤的持久发展总是与血管发生相关。因此，诱导血管发生的因子的阻抑或抑制应当导致肿瘤生长的消退，而不论肿瘤类型为何。现在，在癌症或增殖性疾病的治疗中，数个公司正在开发抗血管发生的策略，其例如要么基于致血管发生的因子(或其受体，当它们被鉴定出时)的抑制剂，要么通过经由使用内皮细胞作为血栓形成催化剂的锚定来诱导血管的微血栓形成，要么通过使用以并不总是经鉴定的机制来抑制血管发生的肽试剂。这些方法尚未达到明确的结果，并且看起来基于阻断单一血管发生途径的抑制剂引起加重的反弹效应。目前，这些结果致使这些公司提出了抑制剂混合物，其使得能够期望彻底地和同时地破坏血管和肿瘤细胞。因此，目前存在着对于新的血管发生抑制剂的需要，所述新的血管发生抑制剂因而抑制细胞的生长和/或增殖。发明人目前已证明，令人惊讶地，皮抑菌肽B2(其从双色叶泡蛙(Phyllomedusa bicolor)类别的南美蛙类的皮肤分泌物中提取，并且已知作为抗微生物剂)能够一方面抑制肿瘤细胞的增殖，和另一方面抑制血管发生。美国专利US 6，440，690描述了肽(尤其是皮抑菌肽)用于通过刺激宿主的免疫系统来治疗传染病或癌症的用途。更精确地，这些肽通过激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞和/或其他淋巴样细胞来刺激免疫系统。相反地，未暗示皮抑菌肽B2可以抑制细胞的生长和/或增殖。发明描述因此，本发明涉及分离的肽，其包含选自下列的氨基酸序列或由选自下列的氨基酸序列组成-皮抑菌肽B2的序列，皮抑菌肽B2的前体的序列；-与皮抑菌肽B2或皮抑菌肽B2的前体的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；和-这些序列的片段，条件是，所述分离的肽抑制细胞的生长和/或增殖，所述肽用于其在治疗或预防增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病中的应用，优选地用于抑制细胞的生长和/或增殖。本发明还涉及嵌合分子，其包含至少一个上面所定义的肽，其中所述肽连接至a)对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；b)酶，该酶能够将分子转变为对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；或c)载体分子。
另一方面，本发明涉及用于产生上面所定义的嵌合分子的方法，其包括a)通过化学途径合成上面所定义的肽；和b)将所述肽与选自下列的化合物相缀合i)对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；ii)酶，该酶能够将分子转变为对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物； 和iii)载体蛋白。本发明的另一个目标涉及核酸，其包含编码上面所定义的肽的序列，或由编码上面所定义的肽的序列组成；以及包含该核酸的载体，其中所述核酸与一个或多个允许所述肽表达的元件功能性地相连接，所述载体用于其在治疗或预防增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病中的应用，优选地用于抑制细胞的生长和/或增殖。本申请还描述了包含上面所定义的肽或上面所定义的嵌合分子的药物组合物，以及包含上面所定义的核酸或上面所定义的载体的药物组合物。这些组合物可以还包含对于治疗增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病来说有用的第二种治疗性化合物。皮抑菌肽B2“皮抑菌肽B2”或“腺苷调节肽”在本文中是指具有33个氨基酸的肽，其首次从双色叶泡蛙类别的南美蛙类的皮肤分泌物中分离得到(Daly等人，(1992)PrOC. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10960-10963)。该肽的氨基酸序列相应于序列 GLWSKIKEVGKEAAKAAAKAAGKAA LGAVSEAV(SEQ ID NO :1)。该肽以前体(前腺苷调节肽原)的形式表达，所述前体由81个氨基酸构成，并且其序列如下MAFLKKSLFLVLFLGLVSLSICEEEKRENEDEEEQEDDEQSEMKRGLWSKI KEVGKEAAKAAAKAAGKAALGAVSEAVGEQ(SEQ ID NO :2) (Amiche等人，(1994) J. Biol. Chem. 269 17847-17852)。已鉴定了相应于该前体的cDNA，并且显示在序列SEQ ID NO :3中。已知皮抑菌肽B2增加激动剂与腺苷Al的受体的结合(Daly等人，(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10960-10963 ；Moni 等人，(1995) Cell. Mol. Neurobiol. 15 465-493)。结构和药理学分析显示，它类似于皮抑菌肽(从亚马逊雨蛙中分离的广谱抗微生物肽)大家族(Amiche 等人，(1994) J. Biol. Chem.洸9 17847-17852 ;Charpentier 等人，((1998) J. Biol. Chem. 273 :14690-14697 ;Mor 等人，(1994) J. Biol. Chem. 269 31635-31641 ；Mor 等人，(1991) Biochemistry30 :8拟4_8830)。该肽的固相化学合成不提出任何特别的困难，因为它具有相对短的尺寸，并且其结构不被或很少被翻译后修饰所改变。 此外，由于其cDNA是可得的，因而通过在大肠杆菌(Escherichia coli)中的重组表达来产生它也是可能的。正如本领域技术人员所熟知的，在PM的剂量下，皮抑菌肽B2快速地杀死革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母、原生动物和丝状真菌。此外，它没有溶血活性。肽根据本发明的肽具有生物学活性。“生物学活性”在本文中尤其是指抑制血管发生和/或细胞增殖和/或肿瘤生长的活性。一旦它具有至少一种上面所提及的活性，根据本发明的肽就具有生物学活性。优选地，所述肽具有抑制细胞增殖和/或细胞生长(特别是肿瘤细胞或血管细胞)的活性。肽的抑制细胞增殖和/或肿瘤生长的活性可以容易地由本领域技术人员在体外或在体内进行评价，尤其是借助于下列测试-在体外，通过(i)在不存在血清的情况下，使所述肽与通过生长因子进行刺激的成纤维细胞类型的细胞(例如，NIH 3T3)相接触，(ii)添加通过放射性进行标记的胸苷，和 (iii)测量被所述细胞所掺入的放射性，例如通过液体闪烁；-在体外，通过使所述肽与在软琼脂中的肿瘤细胞(例如，PC-3)相接触，并且经由测量其直径来观测肿瘤细胞的生长；-在体内，通过给其中已经经由注射PC-3而诱导了肿瘤的裸鼠注射所述肽，并且经由测量肿瘤的体积和/或重量来观测肿瘤的生长。“分离的”肽在本文中是指从动物或微生物的生物体中分离的肽。然而，该分离的肽可以例如存在于药物组合物中或存在于试剂盒中。优选地，该肽存在于下面所描述的药物组合物之一中。该肽优选地以经纯化的形式存在。根据本发明的肽可以通过化学或生物学途径合成。特别地，它重组地产生。优选地，根据本发明的肽具有6-81、6-76、6-71、6-66、6-61、6-56、6-51、6-46、 6-41、6-36、6-33、6-30、6-28、6-26、6-24、6-22、6-20、6-18、6-16、6-14、6-12、6-10 个氨基酸的大小，优选地9、8或7个氨基酸的大小。最优选地，根据本发明的肽具有33个氨基酸的大小。特别地，所述肽可以包含选自下列的氨基酸序列或由下列的氨基酸序列组成序列 SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :2 ；与序列 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 具有至少 80% 同一性的氨基酸序列；和这些序列的片段，条件是，所述分离的肽抑制细胞的生长和/或增殖。 优选地，所述肽由选自序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成。所述肽还可以由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的片段组成。参考序列的“片段”在本文中是指由参考序列的连续氨基酸的链串构成的序列，其具有小于参考序列的大小。在本发明的情形下，所述片段可以例如具有6-76、6-71、6-66、 6-61、6-56、6-51、6-46、6-41、6-36、6-33、6-30、6-28、6-26、6-24、6-22、6-20、6-18、6-16、 6-14、6-12、6-10个氨基酸的大小，优选地9、8或7个氨基酸的大小。特别地，所述片段可以具有33个氨基酸的大小。优选地，这些片段源自皮抑菌肽B2或皮抑菌肽B2的前体的C-末端部分。此外，根据本发明的肽还包括这样的肽，其具有衍生自序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2，或者衍生自序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的片段的序列，这些衍生序列通过相对于序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2之一的序列同一性百分比来定义。这些衍生序列可以与参考序列相差一个或多个氨基酸的置换、缺失和/或插入，并且这是在这样的位置处从而这些修饰对于所述肽的生物学活性不显著地具有损害。所述置换尤其可以相应于保守置换，或者相应于天然氨基酸被非天然氨基酸或假氨基酸的置换。“与参考序列至少80% (例如)同一的氨基酸序列”是指与参考序列相同的序列， 除了对于参考序列的每个一百个氨基酸的部分，该序列可以包含至多二十个突变(置换、 缺失和/或插入)外。因此，对于大小为100个氨基酸的参考序列，80个氨基酸的片段和相对于参考序列而言包含20个置换的100个氨基酸的序列为与参考序列80%同一的序列的两个实例。同一性百分比通常通过使用序列分析软件(例如，Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,WI 53705的序列分析软件包)来确定。将待比较的氨基酸序列进行比对以获得同一性程度的最大值。为此，可能需要在序列中人工引入间隔(缺口)。比对可以手工地或自动地进行。 核苷酸序列的自动化比对算法是本领域技术人员熟知的，并且例如描述在Altschul等人， (1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389中，且通过诸如Blast软件的软件来施行。可分离出的一种算法为例如 Needleman-Wunsch 的算法(Needleman 和 Wunsch (1970) J Mol Biol. 48 443-53)。一旦实现了最佳算法，就通过记录相对于位置总数而言的所有这样的位置来建立同一性程度，对于所述位置，所比较的两个序列的氨基酸是相同的。因此，根据本发明的肽可以包含选自下列的序列或由选自下列的序列组成-与序列SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 至少 80%、85%、90%、95%或 100% 同一的序列的片段；和-与序列SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 至少 80%、85%、90%、95%或 100% 同一的序列。在一个特别的实施方案中，所述肽的序列仅由于保守置换的存在而不同于序列 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2或者序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的片段。保守置换是相同类别的氨基酸的置换，例如具有不带电荷的侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、 丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸)、具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)的置换。根据本发明，所述肽可以化学地或酶促地进行修饰以改善其稳定性和其生物利用率。此类化学或酶促修饰是本领域技术人员熟知的。非限制性地，可以例如提及下列修饰-肽的C-末端或N-末端的修饰，例如N-末端的脱氨基或酰化(优选地，乙酰化)， 或例如C-末端的酰胺化或酯化；-两个氨基酸之间的酰胺键的修饰，例如在氮或α-碳上的酰化(优选地，乙酰化)或烷基化；-手性的改变，例如天然氨基酸(L-对映异构体)被相应的D-对映异构体置换。 该修饰可以任选地伴随有侧链的倒转(从C-末端至N-末端)；-改变成氮杂肽，其中一个或多个α-碳被氮原子替代；和/或-改变成β肽，其中在主链的N-α侧或C-α侧添加一个或多个碳。如此，可以修饰所述肽的一个或多个赖氨酸(K)氨基酸，尤其是通过-酰胺化该修饰的实现简单，其中赖氨酸的正电荷被疏水基团(例如，乙酰基或苯乙酰基)取代；-胺化通过从伯胺R= (CH2) 4-ΝΗ3+开始形成仲酰胺，例如通过形成N-甲基、N-烯丙基或N-苄基基团；和-通过形成N-氧化物、N-亚硝基、N-二烷基磷酰基、N-氧硫基或N-糖苷基团。此外，可以还或备选地修饰所述肽的一个或多个苏氨酸(T)和/或丝氨酸(S)氨基酸，尤其是通过在苏氨酸和/或丝氨酸的侧链的OH基团上引入酯或醚基团。酯化(简单的操作)可以借助于羧酸、酸酐，通过桥接等来进行，以形成例如乙酸酯或苯甲酸酯。醚化 (其给出更稳定的化合物)可以借助于醇、卤化物等来进行，以形成例如甲基醚或0-糖苷。
此外，可以还或备选地例如通过酰胺化来修饰一个或多个谷氨酰胺(Q)氨基酸， 其中通过形成仲胺或叔胺，尤其是与甲基、乙基类型的基团(官能化的或非官能化的)形成仲胺或叔胺来进行酰胺化。此外，可以还或备选地修饰一个或多个谷氨酸(E)和/或天冬氨酸(D)氨基酸，例如-通过酯化，以形成甲基酯(取代或未取代的)、乙基酯、苄基酯、硫醇(活化酯)； 和-通过酰胺化，尤其是以形成N，N-二甲基、N-硝基酰苯胺、吡咯烷基基团。相反地，优选的是，不修饰参与所述肽的二级结构的脯氨酸氨基酸，此外还要知晓，氨基酸G、A和M通常不提供明显地令人感兴趣的修饰的可能性。嵌合分子本发明还涉及嵌合分子，其包含至少一个上面所定义的根据本发明的肽，其中所述肽连接至a)对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；b)酶，该酶能够将分子转变为对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；或c)载体分子。“嵌合分子”在本文中是指这样的分子，其包含与另一个分子相连接的根据本发明的肽或由与另一个分子相连接的根据本发明的肽组成。通过共价键将根据本发明的肽连接至所述另一个分子。所述键优选地相应于化学偶联。然而，当所述肽所连接至的分子为另一个多肽时，这两个肽可以以融合蛋白的形式存在。“载体分子”在本文中是指其上可以偶联(缀合)至少一个肽的任何分子。优选地，所述载体分子具有对于允许在其上偶联至少3个根据本发明的肽，优选地3-8个根据本发明的肽来说足够的大小。在本发明的范围内，对于肽而言，“偶联的”是指通过共价键(要么直接地，要么通过在所述肽和所述载体分子之间的间隔物化合物)而连接至载体分子这一事实。可接受的间隔物的实例包括乙二醇、哌嗪类型的化合物，或者氨基己酸或β-丙氨酸类型的氨基酸。 本领域技术人员知道在其上可以有利地偶联肽的此类载体分子。例如，目前将所述肽偶联至匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白 (OVA)、甲状腺球蛋白(THY)或MAP (多抗原肽)。在一个优选的实施方案中，所述载体分子相应于在以编号W02007/125210公开的 PCT申请中所描述的支持物。这样的支持物可以尤其选自线性肽或环肽、线性或环状的拟肽(N-取代的甘氨酸的寡聚物)、折叠聚物(foldamSre)(具有在溶液中采取明确的且可预见的紧凑构象的强烈倾向的寡聚物或多聚物)、线性多聚物或球形树枝状聚合物(由在多官能中央核心周围按照树状过程相互结合的单体构成的大分子)、糖或纳米颗粒。有利地， 所述支持物选自线性或环状的肽，或者线性或环状的拟肽。线性肽的使用使得能够容易地合成该支持物。有利地，在本发明中充当支持物的线性肽可以包含大于25%的赖氨酸比例。 更精确地，当在本发明中将线性肽用作支持物时，将根据本发明的肽优选地嫁接到赖氨酸上。在其中所述支持物为线性或环状的肽和其中将根据本发明的肽直接嫁接到所述肽上的情况下，所述支持性肽与根据本发明的肽之间的连接优选地在所述支持性肽的赖氨酸残基处，在该赖氨酸的α或ε位置的氨基基团处，优选地在ε位置的氨基基团(在侧链上) 处进行。因此，有利地，通过在该假肽基元的C-末端位置处的氨基酸的酸官能团COOH与赖氨酸残基的氨基基团(优选地，在该赖氨酸的ε位置处的氨基基团(在侧链上))之间的酰胺键来将根据本发明的肽直接嫁接到肽支持物上。有利地，根据本发明的肽的支持物选自由D构型的丙氨酸㈧残基和L构型的赖氨酸⑷残基交替地构成的环状六肽。根据本发明的嵌合分子还可以包含与对于治疗增殖性病症来说有用的酶或治疗性化合物相连接的至少一个根据本发明的肽。在一个优选的实施方案中，根据本发明的肽连接至细胞毒性化合物。可选地，根据本发明的肽可以连接至能够将前药转变为对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物的酶(参见，例如专利US 5 760 072和US 5 433 955)。可以例如将根据本发明的肽连接至在基质环境中存在的酶，例如基质金属蛋白酶家族的成员，尿激酶或纤溶酶。可以例如将根据本发明的肽连接至选自下列的治疗性化合物人膜联蛋白1的 N-末端区段、抗炎细胞因子(特别地，ILlO和IL13)、促炎细胞因子的膜受体的非激活性抑制剂、糖皮质激素、非类固醇抗炎药和氨甲蝶呤。可以将根据本发明的肽通过被对于癌细胞环境来说特异的一种酶或一组酶所识别和切割的连接区段而连接至治疗性化合物。更具体地，该酶可以选自细胞外基质的金属蛋白酶、尿激酶和对于膜细胞因子或其受体的细胞外区段的切割来说特异的蛋白酶。从而， 在癌细胞处连接区段的切割使得能够释放两种活性成分一方面，根据本发明的肽；和另一方面，治疗性化合物。可以将此类嵌合分子用作药物，更具体地，用于治疗或预防增殖性病症、眼损伤和 /或自身免疫疾病。优选地，将此类嵌合分子用于治疗或预防增殖性病症例如癌症。治疗用途本发明的肽具有抑制细胞增殖和/或细胞生长的特性。如此，这些肽和包含它们的嵌合分子对于治疗与细胞的增殖和生长相关的各种病理学状态来说是特别有用的。因此，本发明的一个方面涉及根据本发明的肽或嵌合分子，其用于其在治疗或预防增殖性病症、眼损伤和/或自身免疫疾病中的应用，特别地用于抑制细胞的生长和/或增殖。“增殖性病症”在本文中是指细胞的任何异常增殖，不论其是良性的还是恶性的 (癌性的)。本发明的肽在治疗和/或预防癌症的范围内是十分特别有用的。增殖性病症尤其包括肿瘤。本发明十分特别地涉及癌性肿瘤，不论其是实体的还是非实体的。本发明涉及治疗和/或预防实体瘤，例如黑素瘤，癌，肉瘤，横纹肌肉瘤，视网膜母细胞瘤，神经母细胞瘤，骨肉瘤，成胶质细胞瘤，(原发的或非原发的)乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、宫颈肿瘤、消化道肿瘤(尤其是结肠肿瘤)、泌尿系统肿瘤、肝肿瘤、胰腺肿瘤、骨肿瘤。还涉及非实体瘤，即尤其是白血病或淋巴瘤。依然关于癌性肿瘤，根据本发明的肽对于治疗肿瘤转移和/或对于预防其形成来说是特别有用的。在本发明也涉及的良性肿瘤中，可以提及血管瘤和肝细胞腺瘤。增殖性病症还包括除了肿瘤之外的其他病症，例如类风湿性多关节炎(RA)，其是一种与强烈的血管发生相关的炎性疾病；以及皮肤疾病例如银屑病。在该病理学状态中，观察到滑膜细胞的增殖，其是炎性血管翳的形成的基础。与该类型的病理学状态相关的机制类似于导致肿瘤生长的机制。“眼损伤”尤其包括视网膜的病理学状态，例如糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、肾静脉或动脉阻塞、青光眼。所述肽对于治疗可为修复性外科手术操作(例如角膜移植)的后果的眼损伤来说也可以是有用的。尤其存在有所谓“渗出性的”与年龄有关的黄斑变性形式。该类型的病理学状态导致视网膜下异常的血管形成。该混乱的血管增加在长期情况下可以损害黄斑并导致失明。关于糖尿病性视网膜病变，该病理学状态是变得异常(尤其具有周细胞的消失)的视网膜毛细血管的疾病。然后观察到血-视网膜屏障的破裂，这导致血管渗透性过高。这些改变将会引起视网膜局部缺血，其将会成为新血管发生的基础，所述新血管发生在更长的时期下导致失明。在这些类型的病理学状态中，发病机制基于混乱的血管网的发展。因此，抗血管发生的分子(例如根据本发明的肽)的使用是针对这些病理学状态的有效的治疗性治疗。根据本发明的肽具有抗血管发生的特性，它们对于治疗或预防自身免疫疾病来说是有用的(Griffioen 等人，(1999) Int J Cancer. 80 :315-9 ；Griffioen (2008) Cancer Immunol Immunother. 57 :1553-8)。“自身免疫疾病”尤其包括多发性硬化(MQ、炎症性肠病(IBD)(尤其是克罗恩病)和红斑狼疮。最后，根据本发明的肽和嵌合分子还可以用作流产化合物，以用于通过阻断子宫的血管发生和因此胚胎的植入来控制出生。可以在增殖的任何阶段治疗增殖性病症。“治疗”是指治愈性的处理(旨在至少减轻、减慢或终止病理学状态的发展)。“预防”是指预防性的处理(旨在减少病理学状态出现的风险)。根据本发明的肽和嵌合分子还可以与旨在治疗或预防相同疾病的第二种活性成分相联合地使用。在治疗和/或预防癌症的范围内，可以例如将所述肽与旨在去除肿瘤的外科手术、放射疗法、化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法相联合地使用。因此，本发明的目标还在于根据本发明的肽或嵌合分子，其与至少一种对于治疗增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病来说有用的治疗性化合物相联合地，用于它们在治疗和/或预防增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病中的应用。“对于治疗增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病来说有用的治疗性化合物”是指除了根据本发明的肽之外的其他任何活性成分，所述活性成分对于治疗和/或预防增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病来说是有用的。例如可能的是，将根据本发明的肽与旨在治疗这些疾病的已经拥有上市许可证的活性成分相联合。此类对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物尤其包括已被批准用于治疗各种癌症的下列化合物Abraxane、阿霉素(盐酸多柔比星)、Adrucil (氟尿嘧啶)、艾达乐(咪喹莫德)、阿仑珠单抗、力比泰(培美曲塞二钠)、5_氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞吡坦、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺斯(依西美坦)、阿仑恩(Arranon)(奈拉滨)、三氧化二砷、阿瓦斯丁(贝伐珠单抗)、阿扎胞苷、盐酸苯达莫司汀、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、百克沙(Bexxar)(托西莫单抗和I 131碘托西莫单抗)、硼替佐米、Campath(阿仑珠单抗)、开普拓(Camptosar)(盐酸伊立替康)、卡培他滨、卡钼、西妥昔单抗、顺钼、Clafen (环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex (氯法拉滨)、科罗拉(氯法拉滨)、环磷酰胺、阿糖胞苷、赛德萨-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达珂(Dacogen)(地西他滨)、达沙替尼、地西他滨、D印oCyt (脂质体阿糖胞苷)、D印oR)am(脂质体阿糖胞苷)、盐酸右雷佐生、多西他赛、多喜(Doxil)(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、氟优(Efudex)(氟尿嘧啶)、艾伦斯(Ellence) (盐酸表柔比星)、乐沙定(奥沙利钼)、Emend(阿瑞吡坦)、盐酸表柔比星、爱比妥(西妥昔单抗)、盐酸厄洛替尼、Evacet (盐酸多柔比星脂质体)、易维持(盐酸雷洛昔芬)、依西美坦、芙仕得(Faslodex)(氟维司群)、弗隆(来曲唑)、Fluoroplex(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉妥珠单抗奥佐米星、健择(盐酸吉西他滨)、格列卫(甲磺酸伊马替尼)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、和美新(盐酸托泊替康)、替伊莫单抗、甲磺酸伊马替尼、咪喹莫德、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸伊立替康、伊沙匹隆、IXempra(伊沙匹隆)、Keoxifene (盐酸雷洛昔芬)、凯望斯(Ifepi vance)(帕利夫明)、托西拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、Levulan(5-氨基乙酰丙酸)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、脂质体阿糖胞苷、Methazolas tone (替莫唑胺)、Mylosar (阿扎胞苷)、麦罗塔(Mylotarg)(吉妥珠单抗奥佐米星)、纳米颗粒紫杉醇(紫杉醇的经白蛋白稳定化的纳米颗粒制剂)、奈拉滨、 Neosar (环磷酰胺)、多吉美(托西索拉非尼)、尼洛替尼、诺瓦得士(柠檬酸他莫昔芬)、昂卡司帕(Oncaspar)(培门冬酶)、奥沙利钼、紫杉醇、紫杉醇的经白蛋白稳定化的纳米颗粒制剂、帕利夫明、帕尼单抗、Paraplat (卡钼)、伯尔定(卡钼)、培门冬酶、培美曲塞二钠、普拉汀诺(Platinol)-AQ(顺钼)、普拉汀诺(顺钼)、盐酸雷洛昔芬、Revlimid(来那度胺)、 美罗华(利妥昔单抗)、利妥昔单抗、硬化溶胶胸膜内气溶胶(Sclerosol Intrapleural Aerosol)(滑石)、托西索拉非尼、扑瑞赛(Sprycel)(达沙替尼)、无菌滑石粉剂(滑石)、 Meritalc (滑石)、苹果酸舒尼替尼、索坦(Sutent)(苹果酸舒尼替尼)、昔诺韦(沙利度胺)、柠檬酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、它赛瓦(盐酸厄洛替尼)、塔革雷汀 (Targretin)(贝沙罗汀)、达希纳(Tasigna)(尼洛替尼)、泰素(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)、泰道(Temodar)(替莫唑胺)、替莫唑胺、坦罗莫司、Thalomid(沙利度胺)、沙利度胺、Totect (盐酸右雷佐生)、盐酸托泊替康、驮瑞塞尔(Torisel)(坦罗莫司)、托西莫单抗和1131碘托西莫单抗、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、萃克森(Trisenox)(三氧化二砷)、泰克泊(Tykerb)(托西拉帕替尼)、维克替比(Vectibix)(帕尼单抗)、万珂(硼替佐米)、Vidaza(阿扎胞苷)、伏林司他、希罗达(卡培他滨)、泽娃灵(ZevalinM替伊莫单抗)、辛卡德(Zinecard)(盐酸右雷佐生)、唑来膦酸、hlinza(伏林司他)和择泰(唑来膦酸)。此外，本发明的目标还在于用于治疗或预防哺乳动物(更特别地，人)中的增殖性病症或眼损伤的方法，其包括施用治疗有效量的至少一种根据本发明的肽或至少一种根据本发明的嵌合分子，任选地与至少一种对于治疗增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病来说有用的治疗性化合物相联合地。所述哺乳动物优选地为患有或易患增殖性病症、眼损伤和 /或自身免疫疾病的哺乳动物。本发明还涉及治疗性组合物，其包含根据本发明的肽或嵌合分子，和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。核酸和载体在一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的肽或嵌合分子的使用或施用。
然而，也可以选择采用基因疗法，这通过使用或施用编码根据本发明的肽的核酸 (而不是肽)来进行。因而，涉及给患者施用编码目的肽的核酸，这在所述肽由其中转移了所述核酸的患者的细胞在体内表达这样的条件下进行。因此，本发明还涉及包含编码根据本发明的肽的序列或由编码根据本发明的肽的序列组成的核酸。此类核酸可以通过克隆编码皮抑菌肽B2或皮抑菌肽B2的前体的cDNA 的片段而容易地获得。更特别地，包含或编码根据本发明的肽的核酸由序列SEQ ID NO 3表不。编码根据本发明的肽的此类核酸可以尤其以DNA载体(例如质粒载体)的形式。 可以施用一种或多种载体，每种载体可以携带一个或多个编码至少一个根据本发明的肽的序列。在该载体中，将编码至少一个根据本发明的肽的序列与一个或多个允许其表达或其表达的调节的元件(例如尤其是，转录的启动子、激活子和/或终止子)功能性地相连接。根据一个优选的实施方案，使用载体，该载体所携带的序列编码具有序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的肽。根据一个更加优选的实施方案，使用携带具有序列SEQ ID NO 3的核酸的载体。可以通过本领域技术人员已知的任何技术来在体内引入DNA载体。特别地，可能的是，以裸形式在体内引入DNA载体，即不借助可促进该载体转染到细胞中的任何运载体或系统(EP 465529)。还可以采用基因枪，例如通过将DNA沉积在“金”颗粒的表面上并且发射这些颗粒以便DNA穿过患者的皮肤(Tang等人，(1992) Nature356 152-4)。使用液体凝胶的注射也可用于同时转染皮肤、肌肉、脂肪组织和乳腺组织(Furth等人，(199 Anal Biochem. 205 365-8)。其他可用的技术为显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、借助于纳米胶囊或脂质体的制剂这些技术。生物可降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒是特别有利的。在脂质体的情况下， 阳离子脂质的使用有助于带负电荷的核酸的包囊，并且促进与带负电荷的细胞膜的融合。备选地，所述载体可以以重组病毒的形式存在，所述重组病毒包含编码所述肽的核酸序列(插入在其基因组中)。所述病毒载体可以优选地选自腺病毒、逆转录病毒(特别是慢病毒)以及腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、痘苗病毒等。慢病毒载体例如由Firat等人， (2002) J Gene Med 4 :38-45 进行了描述。有利地，所述重组病毒是缺陷病毒。术语“缺陷病毒”是指不能在靶细胞内进行复制的病毒。通常，缺陷病毒的基因组至少缺乏对于所述病毒在被感染的细胞中进行复制来说必需的序列。可以要么消除这些区域，要么使其无功能，或者这些区域可以被其他序列 (特别是编码目的肽的核酸)取代。然而，优选地，所述缺陷病毒保留对于病毒颗粒的包囊来说必需的其基因组序列。基因的靶向施用例如在申请WO 95/28 494中进行了描述。肽和嵌合分子的产生在本发明中有用的多肽可以通过本领域技术人员熟知的任何方法来合成。此类方法尤其包括传统的化学合成(以固相或以液体均相)，从构成性氨基酸或其衍生物开始的酶促合成，以及由重组宿主细胞进行生物学产生的方法。通过化学途径的合成由于纯度、抗原特异性、没有不希望的副产物这些原因和由于其生产便利性而是特别有利的。然后，任选地，可以根据本领域技术人员熟知的任何方法来纯化所获得的肽。生产方法还可以包括一个或多个对肽进行化学或酶促修饰以改善其稳定性或其生物利用率的步骤，以及一个或多个将该肽与治疗性化合物相连接的步骤。通过化学途径的合成尤其包括Merrifield类型的合成和Fmoc固相肽合成方法(参见， 列如"Fmoc solid Phase peptide synthesis, a practical approach",由 W. C. Chan 禾口 P. D. White 发表，Oxford university press, 2000)。此外，本发明还涉及用于产生根据本发明的嵌合分子的方法，其包括a)合成根据本发明的肽，优选地通过化学途径，b)将所述肽与对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物、能够将分子转变为对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物的酶、或者载体蛋白相缀合。此外，所述用于产生根据本发明的嵌合分子的方法还包括将所获得的嵌合分子配制成药物组合物(例如在下面段落中所描述的组合物之一)的步骤。根据本发明的肽还可以通过由重组宿主细胞进行生物学产生的方法来获得。在这样的方法中，将包含编码根据本发明的肽的核酸的载体转移到宿主细胞中，所述宿主细胞在允许相应的肽进行表达的条件下进行培养。然后，可以回收和纯化所产生的肽。所使用的纯化方法是本领域技术人员已知的。可以通过独个地或相组合地使用的方法，例如分级、色谱方法、借助于特异性单克隆或多克隆抗体的免疫亲和技术等，从细胞裂解物和提取物开始，从培养基的上清液开始，来纯化所获得的重组肽。可以将目的核酸序列插入到表达载体中，在所述表达载体中将该目的核酸序列与一个或多个允许其表达或其表达的调节的元件(例如尤其是，转录的启动子、激活子和/或终止子)功能性地相连接。根据所使用的细胞宿主来选择控制核苷酸序列表达的信号(启动子、激活子、终止序列...)。为此，可以将根据本发明的核苷酸序列插入到在所选择的宿主内自主复制的载体，或者所选择的宿主的整合型载体中。此类载体根据本领域技术人员经常使用的方法来制备，并且可以通过标准方法(例如，电穿孔或磷酸钙沉淀)将所得到的克隆引入到合适的宿主中。包含根据本发明所定义的核苷酸序列的上面所描述的克隆载体和/或表达载体也是本发明的一部分。此外，本发明还旨在被这些表达载体瞬时地或稳定地转染的宿主细胞。这些细胞可以通过下述方式来获得在原核或真核宿主细胞中引入插入在上面所定义的载体中的核苷酸序列，然后在允许所转染的核苷酸序列的复制和/或表达的条件中培养所述细胞。宿主细胞的实例尤其包括人细胞例如HEK293、PER. C6，非人哺乳动物细胞例如 CH0, COS, MDCK,昆虫细胞例如SF9细胞，细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)，真菌和/ 或酵母菌株例如L40和Y90。药物组合物本申请还描述了药物组合物，其包含至少一种根据本发明的肽或嵌合分子作为活性成分。通常，此类组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。根据本发明的肽和嵌合分子可以相应于任何上面所描述的肽和嵌合分子。根据本发明的一个优选的实施方案，所述肽为具有序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的肽。“赋形剂”或“药学上可接受的运载体”是指在人或动物中不产生副反应(例如变应反应)的任何溶剂、分散介质、延缓吸收的试剂等。备选地，本发明还提供了药物组合物，其包含编码根据本发明的肽的核酸作为活性成分，所述核酸优选地与一个或多个允许该肽的表达或其表达的调节的元件功能性地相连接；以及一个或多个药学上可接受的赋形剂。优选的药物组合物包含编码具有序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的肽的核酸。本发明还提供了药物组合物，其在一种或多种药学上可接受的赋形剂存在下包含至少一种根据本发明的肽、嵌合分子或核酸，和至少一种对于治疗增殖性病症、眼损伤和/ 或自身免疫疾病来说有用的治疗性化合物。本发明的另一个实施方案包括基本上同时地施用分开的组合物，所述分开的组合物一方面包含至少一种根据本发明的肽、嵌合分子或核酸，和另一方面包含至少一种对于治疗增殖性病症、眼损伤和/或自身免疫疾病来说有用的治疗性化合物。施用还可以用分开的组合物顺次地来进行，所述分开的组合物一方面包含至少一种根据本发明的肽、嵌合分子或核酸，和另一方面包含至少一种对于治疗增殖性病症、眼损伤和/或自身免疫疾病来说有用的治疗性化合物。当然，剂量依赖于所考虑的活性物质、施用方式、治疗适应症、患者的年龄和其状态。优选地，肽的剂量为0. 1至250mg/kg/天，优选地1至100或0. 5至100mg/kg/天， 特别地0. 5至5mg/kg。肽的单位剂量优选地包含12. 5至200mg的肽。当所述药物组合物包含核酸时，还尤其根据施用方式、所靶向的病理学状态以及治疗持续时间来调整待施用的核酸(序列或载体)的剂量。通常，当使用重组病毒时，其以大约IO4至10Mpfu/ml，优选地IO6至101QpfU/ml的剂量的形式来进行配制和施用。术语 "pfu"(蚀斑形成单位)相应于病毒溶液的感染性，并且可以通过感染合适的细胞培养物和通常在48小时后测量被感染的细胞的蚀斑数目来测定。用于测定病毒溶液的Pfu滴度的技术已由文献充分地进行了描述。可以如此配制本发明的药物组合物，以便通过单一的途径或者通过不同的途径来向患者进行施用。根据本发明的药物组合物可以例如通过肠胃外途径，特别地通过静脉内、皮下或肌内途径，通过口服途径，通过吸入或者通过局部或眼应用来进行施用。当考虑通过肠胃外途径(更特别地，通过注射)进行施用时，包含所述活性成分的本发明的组合物以包装在用于缓慢输注的安瓿或瓶中的可注射溶液和悬浮液的形式存在。 注射可以尤其通过皮下、肌内或静脉内途径来进行。优选地，特别是在实体瘤的情况下，可以将药物组合物注射到肿瘤中。在通过口服途径进行施用的情况下，本发明的组合物以明胶胶囊(g6lule)、泡腾片剂、裸露的或包衣的片剂、囊剂、糖衣丸剂、可饮用的安瓿剂或溶液、微颗粒或延长释放形式的形式存在。
用于肠胃外施用的形式常规地通过将一种或多种活性成分与缓冲液、稳定剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂和悬浮剂相混合来获得。然后，按照已知的技术，将这些混合物进行灭菌，并随后包装成静脉内注射的形式。作为缓冲液，本领域技术人员将可以使用基于有机磷酸盐的缓冲液。悬浮剂的实例包括甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、阿拉伯胶和羧甲基纤维素钠。此外，根据本发明可用的稳定剂为亚硫酸钠和焦亚硫酸钠，而可以提及对羟基苯甲酸钠、抗坏血酸、甲酚和氯甲酚作为防腐剂。为了制备口服溶液或悬浮液，将活性成分溶解或悬浮在具有分散剂、湿润剂、悬浮剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮)、防腐剂(例如，羟苯甲酸甲酯或羟苯甲酸丙酯)、矫味剂或着色剂的合适的运载体中。为了制备微胶囊，将活性成分与合适的稀释剂、合适的稳定剂、有助于活性物质的延长释放的试剂或者任何其他类型的添加剂相组合以形成中央核，其然后被包覆以合适的聚合物(例如，水溶性树脂或在水中不溶的树脂)。为此，使用本领域技术人员已知的技术。然后，任选地将如此获得的微胶囊配制到合适的剂量单位中。还可以考虑通过眼途径的施用，特别是在治疗眼损伤的情况下。从而，本发明的药物组合物以用于在眼睛中局部施用的眼用组合物的形式存在， 例如作为眼药水或眼用乳膏。眼用组合物可以为包含蒸馏水的水溶液、生理盐水溶液，其中溶解有本发明的肽。 如果需要，可以将一定数目的添加剂掺入到眼用组合物中，例如缓冲试剂、确保与眼泪的等渗性的试剂、防腐剂、增稠剂、稳定剂、抗氧化剂、调节PH的试剂、螯合剂等。通过无菌操作来制备用于眼睛的滴剂，或者在制备的合适步骤中进行灭菌。可以通过将活性成分与常用的基质相混合，无菌地制备眼用乳膏。用于眼用乳膏的基质为例如凡士林、jelene 50或plastikise、聚乙二醇等。可以添加表面活性剂以增加亲水性。如果需要，可以添加上面所描述的添加剂，例如防腐剂。通常，对于局部眼应用，通过下述方式在成人中获得令人满意的效果在眼睛中施用一小滴包含0. 001至10%，优选地0. 01至(重量/体积)的本发明的化合物或其药物上可接受的盐的制剂，每天数次，优选地每天一至六次，并且每次每只眼睛优选地用一至四小滴；并且在使用眼用乳膏的情况下，施用包含0. 001至10%，优选地0. 01至(重量 /体积)的本发明的化合物或其药物上可接受的盐的制剂，优选地在眼睛中每天应用一至六次。根据本发明的肽、嵌合分子和核酸还可以配制成脂质体的形式。脂质体从分散在水性介质中并自发形成多层状的同心双层囊泡的磷脂开始来形成。这些囊泡通常具有25nm 至4 μ m的直径，并且可以进行声波处理，从而导致形成直径为200至5 00人的更小的单层囊泡，其在其核心中包含水性溶液。对于向确定的细胞或组织靶标施用药物来说，脂质体可以是特别有利的。为此，可以将脂质化学偶联至靶向性分子，例如靶向性肽(例如激素)或抗体。下面的实施例和附图举例说明了本发明，而不限制其范围。附图描述图IA显示了直方图，该直方图呈现了根据在治疗期间所使用的皮抑菌肽B2的浓度(以μ g/ml表示)而变化的前列腺腺癌细胞PC-3的数目(纵坐标所示的数X IO4) /孔。 ** =P < 0. 01，相对于对照(0)。*** :p < 0. 001，相对于对照(0)。图IB显示了直方图，该直方图呈现了根据在治疗期间所使用的皮抑菌肽B2的浓度(以μ g/ml表示)而变化的小鼠胚胎细胞CES的数目(纵坐标所示的数X IO4)/孔。％ P < 0. 05，相对于对照(0)。_ φ < 0. 001，相对于对照(0)。图IC显示了直方图，该直方图呈现了根据在治疗期间所使用的皮抑菌肽B2的浓度(以μ g/ml表示)而变化的前列腺增生细胞G1947的数目(纵坐标所示的数X IO4) / 孔。*:p < 0.05，相对于对照(O)0图2A显示了直方图，该直方图呈现了根据在治疗期间所使用的皮抑菌肽B2的浓度(以PM表示)而变化的人淋巴瘤细胞LB-EBV的数目(纵坐标所示的数X IO4) /孔。、 P < 0. 01，相对于对照(C)。_ φ < 0. 001，相对于对照(C)。图2Β显示了直方图，该直方图呈现了根据在治疗期间所使用的皮抑菌肽Β2的浓度(以μΜ表示)而变化的人淋巴瘤细胞Raji的数目(纵坐标所示的数X IO4)/孔。
P < 0.001，相对于对照(C)。图3Α显示了直方图，该直方图呈现了人腺癌细胞PC-3的集落数目/mm3，用5 μ M 皮抑菌肽Β2处理或未处理(C)。_ φ < 0. 001，相对于对照(C)。图:3Β显示了直方图，该直方图呈现了人癌细胞ΜΒΑ-ΜΒ231的集落数目/mm3，用 5μΜ皮抑菌肽B2处理或未处理(C)。_ :ρ < 0. 001，相对于对照(C)。图4Α显示了图，该图呈现了通过给无胸腺小鼠异种移植PC-3细胞而获得的肿瘤的肿瘤体积(以mm3表示)随时间的变化。小鼠用PBS ( ■)、泰素(·)或皮抑菌肽B2 ( ▼) 进行治疗，所述治疗在注射细胞后一周开始。箭头指明了用皮抑菌肽B2进行的治疗的不同剂量。图4B显示了图，该图呈现了在治疗四天后，通过给无胸腺小鼠异种移植PC-3细胞而获得的肿瘤的重量(以g表示)。小鼠用PBS ( ■)、泰素(▲)或皮抑菌肽B2 ( ▼)进行治疗，所述治疗在注射细胞后一周开始。图5A显示了直方图，该直方图呈现了根据在治疗期间所使用的皮抑菌肽B2的浓度(以μΜ表示)而变化的ABAE细胞的数目(以百分比表示)/孔。_:ρ<0.001，相对于对照(0)。图5Β显示了直方图，该直方图呈现了在FGF-2存在下由ABAE细胞形成的毛细血管的数目/视野，用5 μ M皮抑菌肽Β2处理或未处理(C)。0.001，相对于对照(C)。图6显示了直方图，该直方图呈现了在2. 5μΜ皮抑菌肽Β2不存在(C)或存在(D) 下温育M小时或72小时的、对于用膜联蛋白V进行标记和对于用碘化丙锭进行标记而言同时为阳性的PC-3细胞的百分比。图7显示了直方图，该直方图呈现了在2.5μΜ皮抑菌肽Β2不存在(C)或存在⑶ 下温育M小时或72小时的、对于用膜联蛋白V进行标记和对于用碘化丙锭进行标记而言同时为阴性的PC-3细胞的百分比。图8显示了直方图，该直方图呈现了在2. 5μΜ皮抑菌肽Β2不存在(C)或存在⑶ 下温育M小时或72小时的、对于用膜联蛋白V进行标记而言为阳性但对于用碘化丙锭进行标记而言同时为阴性的PC-3细胞的百分比。
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图9显示了直方图，该直方图呈现了在2. 5μΜ皮抑菌肽B2不存在(C)或存在⑶ 下温育M小时或72小时的、对于用膜联蛋白V进行标记而言为阴性但对于用碘化丙锭进行标记而言同时为阳性的PC-3细胞的百分比。

图10显示了用膜联蛋白V FITC和用碘化丙锭(PI)进行标记的未处理的PC-3细胞的流式细胞术点状印迹分析。图11显示了用膜联蛋白V FITC和用碘化丙锭(PI)进行标记的用2. 5μ M皮抑菌肽Β2处理24小时的PC-3细胞的流式细胞术点状印迹分析。
实施例下面的实施例证明了皮抑菌肽Β2抑制细胞增殖的能力，和因此在治疗增殖性病症中使用其的益处。实施例1 皮抑菌肽Β2抑制粘附性或非粘附性肿瘤细胞的生长，但对于非肿瘤细胞仅具有很小的效应。对于不同类型的细胞在体外评价了皮抑菌肽Β2的抗增殖活性腺癌细胞PC-3和人前列腺增生细胞G1947以及小鼠胚胎细胞(CEQ。将所述不同类型的细胞以IO4个细胞/ cm2接种在M孔平板中，在0. 5ml培养基(对于PC-3和G1947，补充有5%胎牛血清的RPMI ； 或者对于CES，补充有10%胎牛血清的DMEM)中。在M小时后，所述细胞用不同剂量的皮抑菌肽B2进行处理。然后，在细胞接种后第3和5天，重新进行该处理。在第6天，通过用结晶紫进行染色来估计细胞计数。所述细胞用PBS进行漂洗，通过用无水乙醇进行脱水而固定在塑料上，随后用在2%乙醇中的0.2%结晶紫溶液染色15分钟。在洗涤后，用 SDS溶液溶解所述细胞。在595nm下用分光光度计测量结晶紫的光密度(OD)。产生标准系列用于细胞的OD数的换算。皮抑菌肽B2能够以剂量依赖性方式抑制肿瘤细胞PC-3的增殖(图1)。从5 μ M 的皮抑菌肽Β2起，该抑制作用大于90%。在该浓度下，皮抑菌肽Β2的效应更确切地说是对于这些细胞的细胞毒效应的反映。这是因为，发明人观察到，对于这些浓度，这些细胞中的大多数在测试结束时从培养皿底部脱离。对于7. 5 μ M的皮抑菌肽Β2，在人增生细胞G1947 上观察到大约20%的轻微抑制。对于该所测试的最大剂量，在CES细胞上该抑制更加低微 (大约10% )。应当注意，与PC-3相反，在胚胎细胞和G1947的处理过程中未观察到任何的细胞脱落。还对于两个源自人B-淋巴瘤的非粘附性细胞系(Raji细胞系和LB-EBV细胞系) 的生长来测试了皮抑菌肽Β2。将所述细胞以IO4个细胞/孔接种在0.5ml补充有2. 5%经去补体的胎牛血清的RPMI培养基中。在接种后M小时，所述细胞用不同浓度的皮抑菌肽 B2进行处理。然后，在细胞接种后第3和5天，重新进行该处理。在第7天，如前面所描述的，通过用结晶紫进行染色来估计细胞计数。皮抑菌肽B2也以剂量依赖性方式抑制所研究的两个人淋巴瘤细胞系的增殖(图 2)。在10 μ M，皮抑菌肽Β2以大约95%抑制LB-EBV和Raji细胞的生长。实施例2 皮抑菌肽Β2抑制在软琼脂中体外培养的肿瘤细胞的生长。为了证实在具有PC-3细胞的塑料上观察到的细胞生长的抑制，发明人通过在琼脂中形成集落而测试了皮抑菌肽Β2对于PC-3细胞以不依赖于锚定的方式进行增殖的能力的效应。为了该测试，将所述细胞以2.5X103个细胞/cm2的密度(在包含0.35%琼脂和可变浓度的皮抑菌肽B2的完全培养基(补充有5%胎牛血清的RPMI)中稀释的)接种在包含Iml 0.6%凝固琼脂的12孔皿中。将相同可变浓度的皮抑菌肽B2也添加到在接种那天以及每周两次置于培养物上的完全培养基中。在被水蒸气饱和并包含7% CO2的培养箱中于37°C温育12天后，对具有大于50 μ m的直径的集落进行计数。每个测量以三次重复来实施，并且每个实验重复三次。在5 μ M的浓度下，皮抑菌肽Β2完全抑制在软琼脂上PC_3细胞的生长(图3A)。 在第5天，在用皮抑菌肽B2处理的孔中，没有任何细胞继续存在。该增殖抑制反映了在所使用的剂量下关于诱导细胞死亡的皮抑菌肽B2的效应或者细胞毒效应。这是因为，从其接种后第三天起，用该皮抑菌肽处理的细胞未显现出如未处理的细胞那样在相差显微镜下进行观察时为折射的。当用人乳腺癌细胞系MBA-MB231进行该实验时，观察到相似的结果(图3B)。实施例3 皮抑菌肽B2抑制在裸鼠模型中在体内的PC-3细胞的肿瘤生长。鉴于已经确定皮抑菌肽B2具有抑制PC-3和MDA-MB231细胞在琼脂上进行生长的能力，发明人测试了该肽对于通过给裸鼠注射PC-3所诱导的肿瘤的生长的效应。给数批的 10只裸鼠(裸/裸，Laboratoire IFFA CREDO)注射2 X IO6个PC-3细胞。在注射细胞后一周，将具有可触知的肿瘤的动物随机分配在每个笼中，以便通过在肿瘤中注射ΙΟΟμ 1 PBS 溶液(对照批)/天或者注射在PBS中稀释的皮抑菌肽Β2溶液来进行治疗。在治疗的第一周，以5mg/kg的浓度注射皮抑菌肽B2，随后将该剂量降至0. 5mg/kg (维持12天)。在某些经处理的动物中肿瘤生长恢复之后，以5mg/kg重新注射皮抑菌肽B2 —周，随后将剂量降至 ang/kg直至治疗结束。作为对照，也用泰素(Taxol) (紫杉醇，Bristol-Myers Squibb) 治疗一批小鼠，每周两次，以10mg/kg进行腹膜内注射。每周两次借助于游标卡尺来测量肿瘤的大小，直至在治疗开始后四天处死动物。在处死后，取出肿瘤并称重。结果呈现在图4A中，并且表明，相比于未处理的肿瘤的生长而言，皮抑菌肽B2诱导47%的肿瘤生长抑制。该抑制比用泰素⑧所观察到的仅为36%的抑制明显地更强。在处死动物后，取出肿瘤并称重。图4B显示了在对照动物和用皮抑菌肽B2或用泰素治疗的动物上取得的肿瘤的重量的差异。所获得的结果证实了通过在治疗过程中测量肿瘤体积而获得的那些结果，尤其是在3只用皮抑菌肽B2治疗的小鼠中肿瘤完全消失。实施例4 皮抑菌肽B2抑制在体外内皮细胞的生长和假毛细血管的形成。就其一方面抑制在塑料上牛主动脉内皮细胞(ABAE)的增殖和另一方面抑制在胶原凝胶中由这些相同细胞进行的假毛细血管形成的能力，评价了皮抑菌肽B2的血管抑制活性。为了增殖测试，将ABAE细胞以IO4个细胞/孔的密度接种在M孔平板中，在补充有 10%胎牛血清和5ng/mlFGF-2的DMEM培养基中。如为了前面所描述的增殖测试那样，在接种后M小时，所述细胞用不同剂量的皮抑菌肽B2进行处理。然后，在细胞接种后第3和5 天，重新进行该处理。在第7天，通过用结晶紫进行染色来估计细胞计数。发明人已证明，皮抑菌肽B2诱导ABAE细胞生长的剂量依赖性的和完全的抑制 (图5A)。如关于PC-3细胞那样，所获得的效应看起来与对于ABAE而言皮抑菌肽B2的细胞毒性或细胞死亡诱导作用有关，因为对于5和7. 5 μ M的剂量，发明人观察到死亡细胞的存在的增加(在处理过程中观察到的细胞脱落)。
通过使用Montessano测试来了解皮抑菌肽B2对于假毛细血管的形成的效应。该测试使得能够评价当ABAE细胞以单层接种在胶原I凝胶上时ABAE细胞向假毛细血管的分化。为了该测试，将ABAE细胞按照IO5个细胞/孔接种在M孔平板中于单层胶原I上，在补充有10%胎牛血清的DMEM培养基中。在接种后M小时，在可变浓度的皮抑菌肽B2不存在或存在下，向所述细胞添加20ng/ml FGF-2。在两天期间该处理重新进行，并且在M小时以后通过在相差显微镜下进行观察来评估假毛细血管网的形成，其中测量所形成的毛细血管的数目/观察视野(图5C和D)。图5B显示，在此使用的5 μ M的皮抑菌肽Β2强烈地抑制由FGF-2诱导的假毛细血管的形成。应当注意，与增殖测试相反，皮抑菌肽Β2对于单层的ABAE细胞不具有细胞毒效应。所给出的全部结果表明，皮抑菌肽Β2能够抑制血管发生的两个主要步骤内皮细胞的增殖以及分化。实施例5 皮抑菌肽Β2增加人腺癌细胞PC3中的凋亡和坏死。在PC3或ABAE的增殖测试期间，在皮抑菌肽Β2存在下，快速观察到的抑制效应以及经处理的细胞的无折射性让人猜想，与其说皮抑菌肽Β2阻止易感细胞的生长，还不如说其能够发挥细胞毒作用或诱导细胞死亡的作用。为了确定皮抑菌肽Β2是否能够诱导易感细胞的凋亡，发明人对于在塑料上培养的并用皮抑菌肽Β2处理或未处理的PC3细胞进行了膜联蛋白V和碘化丙锭双标记实验。在这些实验之后为经标记的细胞的流式细胞术分析。为此，在2. 5 μ M皮抑菌肽Β2不存在或存在下，将所述细胞接种在6孔平板中M 或72小时。然后，使所述细胞脱离，用冷的PBS洗涤，并且在黑暗中重悬浮在100 μ 1包含膜联蛋白V FITC的固定缓冲液(MACs，Miltenyi Biotec)中10分钟。在PBS中进行洗涤之后，通过在黑暗中在包含终浓度为1 μ g/ml的碘化丙锭(PI)的固定缓冲液中温育5分钟来重新标记所述细胞。在重新洗涤后，经由在流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson Labware)中通过来分析所述细胞(图10和图11)。用2. 5 μ M皮抑菌肽B2处理PC 3细胞M小时诱导双重标记上了膜联蛋白V和PI 的细胞的强烈增加(大约30% )，这表示细胞凋亡的增加(图6)。如果将所述细胞处理72 小时，该百分比不变化。相反地，未标记的细胞的百分比以相同的比例急剧下降(图7)。在处理M小时后，皮抑菌肽Β2还引起仅标记上了膜联蛋白V的细胞的百分比的5倍增加，由此这表明所述细胞进入早期凋亡(图8)。最后，皮抑菌肽Β2还诱导仅标记上了 PI的细胞的百分比的3倍增加，由此这表示与坏死同义的快速细胞死亡(图9)。在此再次地，在处理 24小时和72小时之间观察到很少改变。这些结果表明，皮抑菌肽Β2对于PC3的效应表现为从处理M小时起细胞死亡的强烈增加。
权利要求
1.分离的肽，其包含选自下列的氨基酸序列或由选自下列的氨基酸序列组成 -皮抑菌肽B2的序列，皮抑菌肽B2的前体的序列；-与皮抑菌肽B2或皮抑菌肽B2的前体的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；和 -这些序列的片段；条件是，所述分离的肽抑制细胞的生长和/或增殖，所述肽用于其在治疗或预防增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病中的应用。
2.根据权利要求1的用于所述应用的肽，所述肽包含选自下列的氨基酸序列或由选自下列的氨基酸序列组成-序列 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 ；-与序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2具有至少80%同一性的氨基酸序列；和 -这些序列的片段；条件是，所述分离的肽抑制细胞的生长和/或增殖。
3.根据权利要求1或2的用于所述应用的肽，所述肽由选自序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1至3中任一项的用于所述应用的肽，所述肽包含改善其稳定性和/ 或其生物利用率的化学修饰。
5.药物组合物，其包含有在权利要求1至4中任一项之中所定义的肽。
6.嵌合分子，其包含至少一个在权利要求1至4中任一项之中所定义的肽，其中所述肽连接至a)对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；b)酶，该酶能够将分子转变为对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；或c)载体分子。
7.药物组合物，其包含根据权利要求6的嵌合分子。
8.根据权利要求6的嵌合分子，所述嵌合分子用于其在治疗或预防增殖性病症、眼损伤和/或自身免疫疾病中的应用。
9.根据权利要求1至4中任一项的用于所述应用的肽或者根据权利要求8的用于所述应用的嵌合分子，其中所述增殖性病症选自实体瘤、白血病、肿瘤转移、良性肿瘤、血管瘤、 类风湿性多关节炎和肝细胞腺瘤。
10.用于产生在权利要求6中所定义的嵌合分子的方法，其包括a)通过化学途径合成在权利要求1至4之一中所定义的肽；和b)将所述肽与选自下列的化合物相缀合(i)对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；( )酶，该酶能够将分子转变为对于治疗增殖性病症来说有用的治疗性化合物；和 (iii)载体蛋白。
11.根据权利要求10的方法，其还包括将所述嵌合分子配制成药物组合物。
12.核酸，其包含编码在权利要求1至4之一中所定义的肽的序列或者由编码在权利要求1至4之一中所定义的肽的序列组成，所述核酸用于其在治疗或预防增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病中的应用。
13.包含根据权利要求12的核酸的载体，其中所述核酸与一个或多个允许所述肽表达的元件功能性地相连接，所述载体用于其在治疗或预防增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病中的应用。
14.根据权利要求12的用于所述应用的核酸或者根据权利要求13的用于所述应用的载体，其中所述增殖性病症选自实体瘤、白血病、肿瘤转移、良性肿瘤、血管瘤、类风湿性多关节炎和肝细胞腺瘤。
15.药物组合物，其包含在权利要求12中所定义的核酸或者在权利要求13中所定义的载体。
16.根据权利要求5、7或15的组合物，其还包含对于治疗增殖性病症、眼损伤或自身免疫疾病来说有用的第二种治疗性化合物。
全文摘要
本发明涉及相应于皮抑菌肽B2或其片段的肽用于治疗增殖性病症例如癌症或眼损伤的用途，以及包含此类肽的药物组合物。
文档编号A61P35/00GK102596222SQ201080036431
公开日2012年7月18日 申请日期2010年6月29日 优先权日2009年7月1日
发明者A·拉德雷姆, C·加朗特, J·A·A·范佐戈尔, J·库尔蒂, J·德尔布, M·阿密什, P·尼古拉, Y·阿马 申请人:国家科研中心, 巴黎东大, 皮埃尔与玛丽·居里-巴黎第六大学