专利名称：用于因子xa抑制剂的解毒剂的单位剂量制剂及其使用方法
技术领域：
本发明涉及逆转和/或中和因子Xa抑制剂的解毒剂的单位剂量制剂。特别地，解毒剂可以是因子Xa(fXa)衍生物，所述因子Xa(fXa)衍生物具有降低的固有促凝血活性或没有固有促凝血活性，但也能够结合和/或中和fXa抑制剂，由此作为靶向fXa的抗凝血剂的解毒剂。本发明还涉及使用特定剂量解毒剂的方法。
背景技术：
市场上在治疗或预防在不活动时或正接受医疗手术时易于形成血凝块的患者(例如，那些患有凝血病症的患者)的不期望血栓形成时需要抗凝血剂。然而，抗凝血疗法的一个重要限制是与治疗有关的出血风险，且在服用过量或如果需要紧急手术的情况下限制了迅速逆转抗凝血活性的能力。因此，极为期望针对所有形式的抗凝血疗法的特定且有效解毒剂。出于安全考虑，同样有利的是在研发新的抗凝血剂药物中获得抗凝血剂-解毒剂对。目前对于过度抗凝血可用的抗凝血剂-解毒剂对是肝素-鱼精蛋白和华法林(warfarin)-维生素K。新鲜的冷冻血衆和重组因子Vila(rfVIIa)也已用作遭受严重创伤或严重出血的患者在低分子量肝素治疗中的非特异性解毒剂。(Lauritzen,B.等人，Blood，2005，607A-608A)还报导了鱼精蛋白片段(美国专利第6，624，141号)和小的合成肽(美国专利第6，200, 955号)作为肝素或低分子量肝素解毒剂；和凝血酶突变蛋白质(美国专利第6，060，300号)作为凝血酶抑制剂的解毒剂。已报导将凝血酶原中间产物和衍生物作为水蛭素和合成凝血酶抑制剂的解毒剂(美国专利第5，817，309号和第6，086，871号)。抗凝血疗法的一种有希望的形式靶向因子Xa(fXa)，且实际上，目前在临床研发的不同阶段中有多种直接fXa抑制剂用于抗凝血疗法中。一种直接fXa抑制剂Xarelto (利伐沙班(rivaroxaban))已经被批准在欧盟和加拿大用于临床使用以预防矫形外科手术患者中的静脉血栓。这些中的多数是小分子。尽管这些新的fXa抑制剂展示有希望用于治疗，但仍需要特定且有效的解毒剂。在过度抗凝血或利用这些fXa抑制剂治疗的患者需要手术的情况下，可能需要一种试剂来实质上中和所施用的一种或多种fXa抑制剂并恢复正常止血。目前可用试剂(例如重组因子Vila(rfVIIa))是以机械方式进行限制且并非特定用于fXa抑制剂的逆转，且因此临床医生极为期望有改良的选择。在人类研究中，已经使用rfVIIa来逆转间接抗凝血酶III依赖性fXa抑制剂(例如磺达肝素(fondaparinux)和依达肝素(idraparinux))的作用(Bi jsterveld, NR 等人，Circulation, 2002,106 :2550-2554 ;Bi jsterveld, NR 等人，British J. ofHaematology) 2004 (124) :-658)。因子 Vlla(fVIIa)的作用机制是与组织因子一起作用以将血液循环中存在的因子X(fX)转化成fXa来恢复患者的正常止血。这种作用模式必然意味着为了中和活性位点定向的fXa抑制剂所可能达到的fXa的最高可能浓度受fX的循环血浆浓度限制。因此，使用rfVIIa来逆转直接fXa抑制剂的作用的潜力在机械上受限。由于fX的循环血浆浓度为150纳摩尔(“nM”)，所以通过这种模式所产生的fXa的最大量将为150nM。小分子fXa抑制剂(例如利伐沙班(rivaroxaban))的报告治疗浓度(大约 600nM, Kubitza D 等人，Eur. J. Clin. Pharmacol,2005,61 =873-880)高于由rfVIIa所生成 的fXa的可能量。因此，使用rfVIIa来逆转由fXa抑制剂所产生的治疗或超治疗水平的抗凝作用提供的效能水平不充分。如图4中所示，在中和因子Xa抑制剂贝曲西班(betrixaban)的抗凝血活性中使用rfVIIa具有有限的作用(如下文所阐述)。重组fVIIa展示50nM至IOOnM的剂量响应解毒活性，但所述作用在IOOnM至200nM之间趋于稳定，此表明其解毒作用除其浓度以外还受其他因素限制。在所有所测试的rfVIIa浓度中，贝曲西班仍展示fXa的剂量响应抑制，在250nM的浓度下高达约75%抑制。此观察结果与fVIIa的建议作用机制一致。此结果还被展示rfVIIa不能完全逆转磺达肝素对凝血酶生成和凝血酶原活化的参数的抑制作用的研究所支持。(Gerotiafas，GT 等人，Thrombosis & Haemostasis 2204(91) :531-537)。外源活性fXa不能以类似于rfVIIa的方式直接施用受试者。不像rfVIIa在缺少其辅因子组织因子的情况下具有极低促凝血活性那样，天然fXa是强效酶且具有造成血栓形成的潜在风险。因此，使用rfVIIa或活性fXa作为fXa抗凝血疗法的解毒剂有缺点。本发明的制剂和方法中使用的解毒剂阐述于美国专利申请公开案第2009-0098119号中。这一出版物及本文所提及的任何出版物、专利和专利申请案均以整体引用的方式并入本文中。尽管在前面提到的申请中披露了解毒剂，解毒剂的剂量给药是确保患者安全的一个关键因素。
发明内容
现在已发现，以一定剂量提供fXa蛋白质的经修饰衍生物的施用可用作靶向fXa的抗凝血剂的解毒剂。所述fXa蛋白质的经修饰衍生物并不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物，而是结合和/或实质上中和抗凝血剂，例如fXa抑制剂。可用作解毒剂的衍生物经修饰以降低或去除固有的促凝血和抗凝血活性，同时保留结合至抑制剂的能力。预计本发明的衍生物可包括修饰活性位点、或改变Gla结构域或自fXa去除整个Gla结构域、或其各种组合。由于已知活性位点经修饰的全长fXa是抗凝血剂，因此进一步预计修饰Gla结构域将降低或消除fXa衍生物对正常止血的抗凝血作用。在一个实施例中，本发明涉及一种单位剂量制剂，其包含药学上可接受的载体和包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或与SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽的双链多肽(two chain polypeptide),其量是约IOmg-约2g。在一些实施例中，所述量是约IOOmg-约
I.5g 或约 200mg-约 Ig 或约 400mg-约 900mg。在某些实施例中，多肽的量对于中和因子Xa抑制剂是约20%、50%、75%、90%、95%、99%或约100%有效的。
在另一实施例中，本发明涉及用于向正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的受试者施用的单位剂量制剂，所述制剂包含药学上可接受的载体和中和量的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或与SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽的双链多肽，所述中和量是在至少约30分钟内，使多肽的循环浓度与因子Xa抑制剂的循环浓度的摩尔比为至少约1:1。在一个实施例中，所述摩尔比涉及贝曲西班诱导的抗凝血。在其他实施例中摩尔比是约I:I或约2I和在再其他实施例中摩尔比是约4I或更高。 在一些实施例中，载体是盐水。在一些实施例中载体是无菌盐水。在其他实施例中，制剂具有每毫升盐水约0. 2-约IOmg多肽的浓度。在其他实施例中，浓度是每毫升盐水约2-约6mg多肽或每毫升盐水约2mg多肽。在某些实施例中，多肽是冻干的。在另一实施例中，本发明涉及一种在正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的受试者中，选择性结合和抑制外源施用的因子Xa抑制剂的方法，包括向所述受试者施用本发明的单位剂量制剂。在再另一实施例中，本发明涉及一种在正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的受试者中，防止、减少或停止出血的方法，包括向所述受试者施用本发明的单位剂量制剂。在再另一实施例中，本发明涉及一种在正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的患者中，校正fXa抑制剂依赖性药效或替代标志物的方法,包括向所述受试者施用本发明的单位剂量制剂。在本发明的方法中，所述制剂可以通过推注静脉注射或推注和输注的组合或通过皮下施用的方式施用。人类凝血因子的皮下剂量给药已经报告于文献中。参见McCarthy K等人，Thrombo. Haemost. ,2002,87 (5) ,824-30 ；Gerrard AJ 等人，Br. J. Haematol.，1992,81(4) :610-3 ；Miekka SI 等人，Haemophilia，1998，4 (4)，436-42。在某些实施例中，约10-约20%的制剂是作为推注施用的，而其余制剂输注一段时间直至出血已基本上停止。预计输注可以施用约6小时、或约6-约12小时、或约12-约24小时或48小时。在另一方面中，经修饰的因子Xa蛋白是与能够延长所述因子Xa衍生物的血浆半寿期(或循环半寿期)的试剂共同施用的。在又一方面中，解毒剂与一个部分偶联(conjugate)以延长其血衆半寿期。在另一方面中，本发明提供试剂盒，其包含用于抗凝血用途的fXa抑制剂和当需要实质上中和所述fXa抑制剂的抗凝血活性时使用的fXa抑制剂解毒剂(或因子Xa衍生物)。当所述解毒剂是以冻干形式提供使，所述试剂盒优选进一步包含一瓶无菌盐水。本发明进一步提供的是一种肽偶联物，其包含以共价或非共价方式连接至刚刚所阐述多肽的载体。所述载体可为脂质体、胶束(micelle)、药学上可接受的聚合物、或药学上可接受的载体。可以在整个说明书的其余部分发现本发明额外的实施例。附图简述图I示意性地展示表13中所示的人类因子X(SEQ ID NO. I)的结构域结构，如在Leytus 等人，Biochem.，1986，25，5098-5102 中所报告。SEQ ID NO. I 是由表 14 中所示的人类fX的核苷酸序列(SEQ ID NO. 2)编码的人类fX的氨基酸序列，如现有技术中所知。例如，经翻译的氨基酸序列报告于Leytus等人，Biochem. , 1986, 25, 5098-5102中且可在〈http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer, fcgi db = nuccore&id = 89142731>的基因库(GenBank)作为“NM_000504”中找到。此序列中的氨基酸编号是基于fX序列。人类fX前体(SEQ ID NO. I)含有pr印ro-前导序列(SEQ ID NO. I的氨基酸I至40)，随后是对应于fX轻链(LC)的序列(SEQ ID NO. I的氨基酸41至179)、对应于在fX分泌期间去除的RKR(SEQ ID NO. 16)三联体的序列(SEQ ID NO. I的氨基酸180至182)、和对应于fX重链的序列(SEQ ID NO. I的氨基酸183至488)，所述重链含有激活肽(AP) (SEQ ID NO. I的氨基酸183至234)和催化结构域(SEQ ID NO. I的氨基酸235至488)。图2(SEQ I D NO. 3)展示成熟人类因子X的氨基酸序列。此图中氨基酸编号是基于成熟fX序列，自fX轻链的N-末端开始。因子X在血浆中作为通过二硫键连接的双链分子循环。轻链(LC)具有139个氨基酸(SEQ ID NO. I的氨基酸41至179)残基且含有富Y-羧基谷氨酸(Gla)的结构域(SEQ ID NO. 3的氨基酸1_45)(包括短芳香族堆栈(AS)(SEQ ID NO. 3的氨基酸40-45))，之后是两个表皮生长因子(EGF)样结构域(EGF1 SEQ IDNO. 3的氨基酸46-84，EGF2 SEQ ID NO. 3氨基酸85-128)。重链(HC)具有306个氨基酸且含有52个氨基酸的激活肽(AP SEQ ID NO. 3的氨基酸143-194)，然后是催化结构域(SEQID NO. 3的氨基酸195-448)。胰凝乳蛋白酶编号中的H57-D102-S195的催化三元体等效物位于fX序列中的His236、Asp282、和Ser379处并加下划线(SEQID NO. 3的氨基酸236、282和 379)。图3示意性地展示图2中所示的成熟人类因子X的结构域结构。此图中的氨基酸编号是基于成熟fX序列。突出显示用于胰凝乳蛋白酶消化以去除含Gla-结构域的片段(SEQID NO. 3的氨基酸1-44)和用于fX激活以去除激活肽的切割位点。胰凝乳蛋白酶消化fXa产生缺少1-44氨基酸残基的无Gla结构域fXa(SEQ ID NO. 4)。图4展示在使用PPP制备的样品的凝血酶生成中在组织因子的存在下各种浓度的rfVIIa对fXa抑制剂贝曲西班(如下文所述)的抗凝血活性的影响(表示为相对荧光单位(RFU)分析)(如实施例2中所述)。数据显示，rfVIIa和组织因子的组合在高达250nM的浓度下不能完全中和fXa抑制剂贝曲西班的抗凝血活性。图5展示在含活性fXa和贝曲西班的纯化体系中Gla-结构域完整的无水-fXa逆转贝曲西班的fXa抑制作用(空心圆)，而与活性fXa相比，仅无水-fXa的促凝血活性可忽略(空心三角)。将fXa发色活性标准化成在无任何抑制剂的情况下的活性fXa (空心正方形)。此更充分地阐述于实施例4中。数据表明，无水-fXa对于fXa底物无活性，但仍保留fXa抑制剂结合能力。图6展示在使用PPP制备的样品的血浆凝血酶生成(表示为相对荧光单位(RFU))分析(如实施例2中所述)中，图5中具有完整Gla结构域的无水-fXa是有效抑制剂。其在约115nM时几乎完全抑制凝血酶生成。数据表明，Gla-结构域未修饰的无水-fXa并不适于用作fXa抑制剂解毒剂。图7展示在96孔板格式中活性fXa的凝血活性在胰凝乳蛋白酶消化之前和在胰凝乳蛋白酶消化15分钟和30分钟之后的比较。如此图中所示，凝血时间(0D405的变化)在fXa被胰凝乳蛋白酶消化15分钟之后明显延迟，且当fXa被消化30分钟时有长达20分钟的时间未观察到凝血。此结果还用于建立胰凝乳蛋白酶消化无水_fXa的条件，这是因为在消化期间可监测到无水-fXa没有活性。此更充分地阐述于实施例I中。图8展示去Gla的无水-fXa对因子Xa抑制剂贝曲西班的结合亲和力，如实施例4中所阐述。数据表明，通过胰凝乳蛋白酶消化无水_fXa而制备以去除含Gla-结构域的片段(残基1-44)的去Gla的无水-fXa能够以与天然fXa类似的亲和力结合贝曲西班(fXa Ki = 0. 12nM,去 Gla 的无水-fXa Kd = 0. 32nM)。
图9展示，在实施例2的使用PPP制备的样品的凝血酶生成分析中，通过添加浓度为680nM的解毒剂(去Gla的无水-fXa)逆转不同浓度贝曲西班的抗凝血活性。在浓度为680nM时，去Gla的无水-fXa能够得到实质上完全的fXa活性恢复。
图10展示，在使用PPP制备的样品的凝血延长分析中使用aPTT试剂在96孔板格式(如实施例3中所述)，通过不同浓度的解毒剂(去Gla的无水-fXa)逆转250nM贝曲西班的抗凝血活性。数据表明，当使用约608nM的解毒剂来中和250nM的fXa抑制剂贝曲西班时，凝血时间与对照贫血小板血浆的凝血时间相当。图11展示，在使用PPP制备的样品的凝血延长分析中使用aPTT试剂在96孔板格式中，563nM的解毒剂(去Gla的无水-fXa)对依诺肝素(enoxaparin) (0. 3125-1. 25U/mL)的抗凝血活性的影响，其表示为标准化之后的倍数变化。分析方案阐述于实施例3中。数据表明，添加563nM的解毒剂明显中和低分子量肝素依诺肝素的活性。图12展示在发色分析中解毒剂(去Gla的无水-fXa)对凝血酶(5nM)活性的作用和50nM阿加曲班(argatroban)( 一种特异性凝血酶抑制剂)对其的抑制作用。正如所预期，fXa抑制剂的解毒剂在高达538nM浓度下不会以可检测方式影响凝血酶活性或所述特异性抑制剂阿加曲班对其的抑制作用。此更充分地阐述于实施例14中。图13展不,在aPTT分析中使用标准凝血计时器(standard coagulation timer)通过改变解毒剂去Gla的无水-fXa的浓度对400nM贝曲西班抗凝血活性的影响。分析方案阐述于实施例3中。数据展示，fXa抑制剂的解毒剂实质上逆转了 400nM贝曲西班对fXa的抑制作用。据估计，在400nM贝曲西班的情况下,解毒剂的EC5tl为约656nM。图14展示CHO细胞中用于表达fXa三重突变体(SEQ ID NO. 12)的DNA构建体的图。将质粒DNA线性化并转染至CHO dhfr(-)细胞中。使用四氢叶酸酯(HT)缺乏的培养基加甲氨蝶呤(MTX)来选择细胞。通过ELISA来针对高蛋白质表达筛选稳定克隆。在无血清培养基中产生fXa三重突变体并通过离子交换与亲和柱的组合来纯化。图中的编号是基于编码人类fX SEQ ID NO. I的多核苷酸序列进行。例如，活性位点S419(SEQ ID NO. I)处的丙氨酸突变等效于成熟人类fX的S379(SEQ ID NO. 3)处的突变，如整个申请案且更具体地实施例7所讨论。图15展示分别使用识别人fX重链和轻链的单克隆抗体的纯化的r-解毒剂的SDS-PAGE 和 Western 印迹。图15A展示离子交换和亲和纯化纯化的r-解毒剂的Western印迹。当将连接轻链和重链的二硫键还原后，r-解毒剂重链迁移到类似于血浆源性fXa的预计分子量。与正常FXa相比，fXa突变体的Gla-结构域中缺失6_39aa使得r_解毒剂轻链的分子量条带较低。图15B和15C展示离子交换和亲和纯化后接大小排阻层析得到的纯化的r-解毒剂的 SDS-PAGE 和 Western 印迹。
图16展示经口单独施用贝曲西班(15mg/kg)、或经口施用贝曲西班(15mg/kg)然后静脉注射(300ug，IV)根据实施例I制得的血浆源性解毒剂(Pd-解毒剂)之后小鼠(n=7-10/组)中的贝曲西班血浆水平。pd-解毒剂是在I. 5小时的时间点之前5分钟时施用，并在经口施用贝曲西班之后I.5、2.0和4.0小时时取小鼠血液样品(0.5mL)。分析全血INR、贝曲西班和解毒剂血浆水平。将小鼠血浆中的贝曲西班水平(平均值土SEM)绘示为小鼠在15mg/kg(空心正方形)和15mg/kg接着解毒剂注射(空心圆)之后的时间的函数。在I. 5小时时间点(解毒剂注射后5分钟)解毒剂治疗组的PK-PD相关性汇总于表I中。根据INR测量值，单次注射解毒剂使功能性贝曲西班减少>50%。此更充分地阐述于实施例8中。图17展示利用经纯化r-解毒剂进行小鼠实验(n = 4-10/组)的结果。比较经口单独施用贝曲西班(15mg/kg)或经口施用贝曲西班(15mg/kg)然后静脉注射(300ug)r-解毒剂之后小鼠血衆中的贝曲西班水平(图17A)和全血INR(图17B)。标明各治疗组的平均值。如表2中所汇总，单次静脉注射r-解毒剂使得离体全血1殿有> 50%校正，此证明经由单次或多次注射或其它方案解毒剂有效中和fXa抑制剂。这些结果表明，本发明的fXa变体具有充当普适解毒剂在具有出血或其它医疗紧急状况的患者中逆转fXa抑制剂的抗凝血作用的潜力。此更充分地阐述于实施例8中。图18展示在96孔浊度变化凝血分析中r-解毒剂逆转依诺肝素的抑制作用。这些结果基本上类似于Pd-解毒剂(图11)，此表明两种fXa衍生物均具有相当的功能性解毒剂活性。508nM r-解毒剂实质上校正了( > 75% ) I. 25U/mL依诺肝素的抑制作用。分析方案呈现于实施例11中。图19展示r-解毒剂逆转低分子量肝素(LMWH)的抑制作用，如在人类血浆凝血分析中所测试。图18和19 二者均于实施例11中讨论。图20展示r-解毒剂逆转利伐沙班的抗凝血作用。此更充分地讨论于实施例12中。图21展示r-解毒剂的多核苷酸序列和经翻译多肽序列的排列。图22展示在单次静脉注射(I次注射)或两次注射(2次注射)r-解毒剂的情况下小鼠实验(n = 5/组，312ug/200ul r_解毒剂)的结果。对经口施用贝曲西班(15mg/kg)之后静脉注射运载体或r-解毒剂之后的血浆中的贝曲西班水平进行比较(图22A)(参见实施例8的详细阐述)。如图22A中所示，与运载体对照(对照I)相比，单次静脉注射r-解毒剂使血浆中的贝曲西班水平增加8倍以上，此表明解毒剂在体内有效结合贝曲西班的能力。与单次注射相比，第二次注射解毒剂又使贝曲西班水平增加不到2倍，此表明在小鼠血液中贝曲西班的数量有限且其抗凝血作用被解毒剂逆转。图22B表明，单次和双次注射解毒剂之后，所测量的INR随小鼠血浆中解毒剂/贝曲西班的比例的增加而降低。图23展示使用r-解毒剂逆转利伐沙班(A)、贝曲西班⑶和阿哌沙班(C)对fXa的抑制。使用Dynafit和Graphpad Prism软件进行曲线拟合和数据分析(实施例15)。图24展示人类血浆中r-解毒剂对利伐沙班的PT延长的逆转(实施例16)。图25展示阿哌沙班的PT延长而添加r-解毒剂逆转其抗凝血作用(实施例16)。图26展示r-解毒剂对依诺肝素抗凝血作用的逆转(实施例17)。图27展示大鼠中静脉施用r-解毒剂对利伐沙班诱导的抗凝血的剂量响应逆转(实施例18)。图28展示r-解毒剂给药到抗凝血化(anticoagulated)大鼠中时对利伐沙班游离(未结合)部分的剂量响应减少(实施例19)。图29A和B展示通过全血INR和PT比率测量的大鼠中IV施用r_解毒剂对利伐沙班诱导的抗凝血的持续逆转(实施例20)。 图30展示麻醉大鼠中依诺肝素的剂量范围 研究(实施例21)。图31展示通过活化的部分促凝血酶原激酶时间测量的大鼠中IV施用r-解毒剂和硫酸鱼精蛋白对依诺肝素诱导的抗凝血的持续逆转(实施例21)。图32展示施用r-解毒剂对贝曲西班诱导的抗凝血的持续逆转(实施例22)。图33展示Sprague-Dawley大鼠中Img静脉给药之后r_解毒剂的血衆浓度_时间概貌(实施例23)。图34展示恒河猴中IOmg静脉给药之后r_解毒剂的血浆浓度-时间概貌(实施例 24)。图35A和35B展示施用r_解毒剂中和利伐沙班活性的模拟时间进程曲线。在图35A中，400mg剂量的r-解毒剂(推注给药)逆转20mg剂量的利伐沙班，同时假设R-解毒剂的T1/2为3小时。在图35B中，使用900mg剂量的R-解毒剂(推注加6小时输注)逆转20mg剂量的利伐沙班，同时假设R-解毒剂的T1/2为I小时(实施例25)。图36A和36B展示r_解毒剂中和贝曲西班活性的模拟时间进程曲线。在图36A中，400mg剂量的r-解毒剂(推注给药)逆转SOmg剂量的贝曲西班，同时假设r_解毒剂的T172为3小时。在图36B中，使用900mg剂量的r_解毒剂(推注加6小时输注)逆转80mg剂量的贝曲西班，同时假设r-解毒剂的T1/2为I小时(实施例26)。图37展示r-解毒剂逆转利伐沙班抗凝血的效果(实施例27)。图38展示大鼠中施用r-解毒剂对依诺肝素抗凝血引起的血液损失的逆转(实施例28)。每一处理组中单个动物的血液损失如图41所示。图39展示大鼠中施用r-解毒剂对磺达肝素抗凝血引起的血液损失的逆转(实施例28)。每一处理组中单个动物的血液损失如图43所示。图40展示施用r-解毒剂对依诺肝素抗凝血引起的抗凝的逆转。以血浆抗_fXa单位测量抗凝血(实施例29)。图41展示大鼠中施用r-解毒剂对依诺肝素抗凝血引起的血液损失的剂量响应减轻(实施例28)。图42展示大鼠尾部横切模型(实施例28)中测量的血液损失与通过抗-fXa单位测量的依诺肝素浓度间的相关性(实施例29)。图42a展示由于依诺肝素浓度提高到超过I. 5U/ml (通过抗-fXa单位分析测量)在血液损失上的一个急剧增加。图42b展示血液损失与r-解毒剂浓度间的相关度分析，r2值为0. 799。图42c展示抗-fXa单位与r_解毒剂浓度间的相关度分析，r2值为0. 689。图43展示大鼠尾部横切模型中(实施例28)r_解毒剂而非鱼精蛋白对磺达肝素抗凝血造成的血液损失的逆转。图44展示通过抗-fXa活性分析测量的磺达肝素造成的抗凝血的逆转。
详细描述I.定义除非另有说明，否则本发明的实践将使用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，此在所属领域的技术人员的范围内。参见例如 Sambrook and Russell 编辑(2001)分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，第3版；Ausubel等人编辑(2007)最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)系列；酶学方法(Methods inEnzymology)系列(学术出版社公司(Academic Press, Inc.)，纽约(N. Y.)) ；MacPherson等人(1991)PCR I :实用方法(PCR I A Practical Approach)(牛津大学出版社(OxfordUniversity Press)的 IRL Press) ;MacPherson 等人(1995)PCR 2 :实用方法(PCR 2 A Practical Approach) ；Harlow and Lane 编辑(1999)抗体，实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual) ；Freshney (2005)动物细胞的培养基本技术手册(Culture ofAnimal Cells AManual ofBasic Technique)，第 5 版；Gait 编辑(1984)寡核苷酸的合成(Oligonucleotide Synthesis);美国专利第 4，683，195 号；Hames 和 Higgins 编辑(1984)核酸杂交(Nucleic AcidHybridization) ；Anderson(1999)核酸杂交(NucleicAcid Hybridization) ；Hames and Higgins编辑(1984)转录和翻译；固定化细胞和酶(Transcriptionand Translation immobilized Cells and Enzymes)(IRL Press (1986))；Perbal (1984)分子克隆实验指南(A Practical Guide至Molecular Cloning) ；Miller andCalos编辑(1987)哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for MammalianCells)(冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)) ;Makrides编辑(2003)哺乳动物细胞的基因转移和表达(Gene Transfer and Expression inMammalian Cells) ；Mayerand Walker编辑(1987)细胞核分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology)(学术出版社(Academic Press)，伦敦(London))；Herzenberg等人编辑(1996)韦尔的实验免疫学手册(Weir’s Handbook of ExperimentalImmunology);小鼠胚胎操作实验指南(Manipulating the Mouse Embryo A LaboratoryManual)，第3版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press) (2002))。所有包括范围在内的数值指定(例如，pH、温度、时间、浓度、和分子量)都是近似值，其以⑴或(-)o. I的增量变化。应了解，尽管不一定明确陈述，但是所有数值指定前面皆有术语“约”。还应该了解，尽管未必明确陈述，本文所述的试剂仅是例示性的且这些试剂的等效物已为此项技术习知。除非上下文另有明确说明，否则说明书和权利要求书中使用的单数形式“一个/一种(a，an)”和“所述的(the) ”包括复数意义。例如，术语“药学上可接受的载体”包括多种药学上可接受的载体，包括其混合物。本文所用术语“包含/包括”意欲指组合物和方法包括所列举要素，但并不排除其它要素。当使用“基本上由...组成”定义组合物和方法时，将意味着出于所想要的用途不包括对所述组合有任何本质意义的其它要素。因此，基本上由本文所定义的要素组成的组合物不会将来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲的盐水、防腐剂、和诸如此类)排除在外。“由...组成”将意味着排除其它成分的超过痕量的元素和用于施用本发明组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡术语中的每一者定义的实施例均在本发明 的范围内。诊断或治疗的“受试者”是细胞或哺乳动物，包括人类。诊断或治疗的非人类动物受试者包括，例如，鼠科动物(例如大鼠、小鼠)、犬科动物(canine)(例如狗)、兔科动物(例如家兔)、家畜、运动动物和宠物。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用且在其最广泛意义上是指两个或两个以上的亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。所述亚单位可通过肽键连接。在另一实施例中，所述亚单位可通过其它键(例如，酯、醚、氨基等)连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸且对蛋白质或肽序列中可包含的氨基酸的最大数量并无限制。本文所用术语“氨基酸”涉及天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，其包括甘氨酸和D与L光学异构体二者、氨基酸类似物和肽模拟物。天然存在的氨基酸的单个字母和三个字母缩写列示于下文中。如果肽链短，通常将三个或三个以上氨基酸的肽称为寡肽。如果肽链较长，则通常将所述肽称为多肽或蛋白质。
I-字母~ 3-字母氨基酸
~L-酪氨酸
GL-甘氨酸
FPheL-苯丙氨酸
MMetL-甲硫氨酸
~Al^L-丙氨酸
I-字母~ 3-字母氨基酸 SSerL-丝氨酸
L-异亮氨酸 ~L-亮氨酸
fTh^L-苏氨酸
vHL-缬氨酸
~L-脯氨酸
KLysL-赖氨酸
~HiiL-组氨酸
权利要求
1.ー种单位剂量制剂，包含药学上可接受的载体和约IOmg-约2g的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或与SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽的双链多肽。
2.权利要求I所述的单位剂量制剂，其具有约IOOmg-约I.5g的所述多肽。
3.权利要求2所述的单位剂量制剂，其具有约200mg-约Ig的所述多肽。
4.权利要求3所述的单位剂量制剂，其具有约400mg-约900mg的所述多肽。
5.任一前述权利要求所述的单位剂量制剂，其中所述多肽有效中和至少约20%的因子Xa抑制剂。
6.权利要求5所述的单位剂量制剂，其中所述抑制剂被中和至少约50%。
7.权利要求6所述的单位剂量制剂，其中所述抑制剂被中和至少约75%。
8.权利要求7所述的单位剂量制剂，其中所述抑制剂被中和至少约90%。
9.权利要求8所述的单位剂量制剂，其中所述抑制剂被中和至少约95%。
10.权利要求5所述的单位剂量制剂，其中所述因子Xa抑制剂选自下组磺达肝素、依达肝素、生物素化的依达肝素、依诺肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、组织因子途径抑制剂、DX-9065a、YM-60828、YM—150、阿哌沙班、利伐沙班、TAK-442、PD-348292、奥米沙班、依度沙班、LY517717、GSK913893、利伐沙班、低分子量肝素、贝曲西班或其药学上可接受的盐、和它们的组合。
11.权利要求10所述的单位剂量制剂，其中所述因子Xa抑制剂选自下组贝曲西班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和它们的组合。
12.权利要求11所述的单位剂量制剂，其中所述因子Xa抑制剂选自下组贝曲西班、利伐沙班、阿哌沙班、和低分子量肝素。
13.一种用于向正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的受试者施用的单位剂量制齐U，所述制剂包含药学上可接受的载体和中和量的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或与SEQID NO. 13具有至少80%同源性的多肽的双链多肽，所述中和量是在至少约30分钟内，使多肽的循环浓度与因子Xa抑制剂的循环浓度的摩尔比为至少约I : I。
14.权利要求13所述的单位剂量制剂，其中所述摩尔比是约I: I或约2 I或约4 I。
15.任一前述权利要求所述的单位剂量制剂，其中所述载体是盐水。
16.权利要求15所述的单位剂量制剂，其中所述制剂具有每毫升盐水约O.2-约IOmg多肽的浓度。
17.权利要求16所述的单位剂量制剂，其中所述制剂具有每毫升盐水约2-约6mg多肽的浓度。
18.权利要求17所述的单位剂量制剂，其中所述制剂具有每毫升盐水约2mg多肽的浓度。
19.任一前述权利要求所述的单位剂量制剂，其中所述多肽是冻干的。
20.ー种在正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的受试者中选择性结合和抑制外源施用的因子Xa抑制剂的方法，包括向所述受试者施用权利要求1-19中任ー项所述的单位剂量制剂。
21.ー种在正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的受试者中防止、減少或停止出血的方法，包括向所述受试者施用权利要求1-19中任一项所述的单位剂量制剂。
22.—种在正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的受试者中校正fXa抑制剂依赖性药效或替代标志物的方法，包括向所述受试者施用权利要求1-19中任一项所述的单位剂量制剂。
23.权利要求22所述的方法，其中所述药效或替代标志物选自下组INR、PT、aPTT、ACT、抗fXa单位、和凝血酶生成。
24.权利要求22或23所述的方法，其中所述校正是至少约20%或约50%或约75%或约90%或约95%。
25.权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述单位剂量制剂是通过推注静脉内施用的。
26.权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述单位剂量制剂是作为输注或推注加输注的组合施用的。
27.权利要求26所述的方法，其中所述制剂的约10%-约20%作为推注施用，而将其余制剂输注一段时间直至出血基本上停止。
28.权利要求26或27所述的方法，其中所述制剂施用约6小吋。
29.权利要求26或27所述的方法，其中所述制剂施用约6-约12小时。
30.权利要求26或27所述的方法，其中所述制剂施用约12-约24小时。
31.权利要求26或27所述的方法，其中所述制剂施用多至约48小吋。
全文摘要
本发明涉及针对靶向因子Xa的抗凝血剂的解毒剂的单位剂量制剂。本发明揭示的是在正经历使用因子Xa抑制剂的抗凝血疗法的患者中停止或阻止出血的方法。
文档编号A61K38/48GK102625712SQ201080040105
公开日2012年8月1日 申请日期2010年7月14日 优先权日2009年7月15日
发明者A.哈特查理拉哈, S.J.霍伦巴克, U.辛哈, 卢根民 申请人:博尔托拉制药公司