Actriib拮抗剂及其给药和用途的制作方法

专利名称：Actriib拮抗剂及其给药和用途的制作方法
ACTRI IB拮抗剂及其给药和用途相关申请本申请要求2009年9月9日提交的美国临时申请号61/276，287的权益，其教导通过引用以其整体结合到本文中。
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骨病，从骨质疏松症到骨折，代表着一类病理状态，对其有效的药剂很少。治疗反而集中在物理和行为干预，包括固定、运动和饮食改变。为了治疗各种骨病，具有促进骨生长和增加骨密度的治疗药物将会是有益的。骨生长和骨矿化取决于两种细胞类型即破骨细胞和成骨细胞的活性，虽然软骨细胞和脉管系统细胞也参与这些过程的重要方面。从发育来看，骨形成通过两种机制即软骨内骨化和膜内骨化而产生，其中前者负责纵向骨形成，后者负责局部结构扁骨的形成，例如颅骨。软骨内骨化需要软骨结构在生长面上相继形成和降解，所述生长面用作成骨细胞、破骨细胞、脉管系统形成和随后矿化的模板。在膜内骨化期间，骨在结缔组织上直接形成。两种过程都需要成骨细胞的浸润和随后的基质沉积。骨折和其它的骨结构破坏至少从表面上看通过类似于骨发生发育事件顺序的过程而愈合，包括软骨组织的形成和随后的矿化。骨折愈合过程可以两种方式产生。直接或 一期骨愈合在无骨痂形成的情况下发生。间接或二期骨愈合伴随骨痂前体期发生。骨折的一期愈合包括跨越紧紧固定的骨破坏重新形成机械连续性。在合适条件下，骨破坏周围的骨吸收细胞显示隧道效应性吸收反应(tunnelling resorptive response),建立穿透血管的途径，并且随后愈合。骨的二期愈合沿炎症、软骨痂形成、骨痂矿化和骨痂重建的过程进行。在炎症期，因损伤部位的骨膜和骨内膜血管破坏导致形成血肿和出血。炎性细胞侵入该区域。在软骨痂形成期，细胞产生新血管、成纤维细胞、胞内物质和支持细胞，在骨折碎片间的空间形成肉芽组织。由纤维组织或软骨组织(软骨痂)横跨骨破裂建立临床愈合。成骨细胞形成，并介导软骨痂矿化，软骨痂然后被板层骨替换，并进行正常的重建过程。除了骨折和骨结构的其它物理破坏以外，骨矿物质含量和骨质量的丢失可因各种条件引起，并可导致严重的医学问题。在个体生命期内，以相对可预测的方式发生骨质量的改变。直到30岁左右，男性和女性两者的骨通过软骨内生长面的线性生长和径向生长，生长至最大质量。约30岁(对于骨小梁，例如扁骨，例如椎骨和骨盆)和40岁(对骨皮质，例如存在于四肢中的长骨)后，男性和女性两者都发生缓慢的骨丢失。女性中，还会出现大量骨丢失的最后阶段，可能是由于绝经后雌激素缺乏引起的。在这个阶段，女性可丢失额外10%的来自骨皮质的骨质量，而且小梁区室可损失25%。进行性骨丢失是否导致病理病况(例如骨质疏松症)很大程度上取决于个体最初的骨质量和是否有恶化条件。骨丢失有时以正常骨重建过程失衡为特征。健康骨不断进行重建。重建始于由破骨细胞引起的骨吸收。然后被吸收的骨被新的骨组织替代，其特征在于由成骨细胞引起的胶原形成和随后的钙化。在健康个体中，吸收和形成的速率是平衡的。骨质疏松症是一种慢性进行性病况，以向吸收转变为标志，导致骨质量和骨矿化的总体下降。人的骨质疏松症之前是临床骨质减少(骨矿物质密度以大于I标准差但小于2. 5标准差低于青年成人骨的平均值)。全球范围内，约7500万人面临骨质疏松症的风险。因此，用于控制破骨细胞和成骨细胞活性之间的平衡的方法可用于促进骨折和其它骨损伤的愈合以及与骨质量和骨矿化丢失有关的诸如骨质疏松症等病症的治疗。至于骨质疏松症，雌激素、降钙素、骨钙蛋白与维生素K或高剂量的膳食钙均用作治疗性干预。骨质疏松症的其它治疗方法包括二膦酸盐、甲状旁腺激素、拟钙剂(calcimimetics)、他汀类、同化激素、镧盐和锶盐以及氟化钠。然而，这类治疗药常与不良副作用有关。因此，本公开内容的一个目的是提供用于促进骨生长和矿化的组合物和方法。发明概述 在某种程度上，本公开内容证实ActRIIb拮抗剂，包括基于ActRIIb的分子(例如包含ActRIIb胞外域的配体结合部分或其变体的分子，例如ActRIIb-Fc)和ActRIIb信号转导的其它拮抗剂，均可用于增加骨密度、促进骨生长和/或提高骨强度。具体地讲，本公开内容证实ActRIIb的可溶形式在体内促进骨密度、骨生长和骨强度提高。虽然促进骨生长或抑制骨丢失的大多数药剂起抗分解代谢剂(通常亦称为“分解代谢剂，，)(例如二膦酸盐)或合成代谢剂(例如甲状旁腺激素、PTH，适当给予时)的作用，可溶性ActRIIb蛋白显示既具有抗分解代谢作用又具有合成代谢作用的双重活性。因此，ActRIIb拮抗剂可用于增加骨密度和促进骨生长。抗ActRIIb抗体和靶向ActRIIb的小分子和适体以及降低ActRIIb表达的核酸也可用于治疗与低骨密度或低骨强度相关的病症(例如骨质疏松症)或在有需要的患者中促进骨生长，例如在患有骨折的患者中(这种分子也包括在本文所用术语“ActRIIb拮抗剂”中)。本公开内容还表明，ActRIIb拮抗剂有效预防和/或修复由多发性骨髓瘤和骨转移(例如乳癌、食管癌、结肠癌、前列腺癌或肺癌)引起的骨损伤，此外，ActRIIb拮抗剂减小多发性骨髓瘤的肿瘤负荷。ActRIIb拮抗剂还可用于治疗各种病症或病况，特别是肌肉和神经肌肉病症(例如肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和肌肉萎缩)、脂肪组织病症(例如肥胖症)、代谢紊乱(例如2型糖尿病)、神经变性病症和老年相关性肌肉消耗(muscle wasting)(肌肉衰减综合征(sarcopenia))、前列腺癌治疗和癌症恶病质。在具体的实施方案中，ActRIIb拮抗剂(例如可溶性ActRIIb多肽)在与ActRIIb活性有关的任何过程中可拮抗ActRIIb受体。任选可设计本发明的ActRIIb拮抗剂以优先拮抗ActRIIb受体的一种或多种配体，例如⑶F8(亦称肌肉生长抑制素0^05^&丨111))、0^11、激活素A、激活素B、激活素AB、Nodal和BMP7 (亦称0P-1)，并因此可用于治疗其它病症。ActRIIb拮抗剂的实例包括天然存在的ActRIIb多肽及其功能变体。在某些方面，本公开内容提供包含可溶性ActRIIb多肽的多肽。可将ActRIIb多肽配成包含ActRIIb多肽和药学上可接受的载体的药物制剂。任选ActRIIb多肽以小于I微摩尔或小于100、10或I纳摩尔的Kd与激活素结合。优选组合物相对于其它多肽成分为至少95%纯的，正如大小排阻层析法所评价的一样，更优选组合物为至少98%纯的。用于这种制剂的ActRIIb多肽可以是本文公开的任何ActRIIb多肽，例如具有以下氨基酸序列的多肽选自SEQ ID NOs :2、3、13、17或20的氨基酸序列，或者与选自SEQ ID NOs :2、3、13、17或20同一性的氨基酸序列有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的氨基酸序列。ActRIIb多肽可包括天然ActRIIb多肽的功能片段，例如包含选自SEQ ID NOs :1_3的序列或者缺乏C端10-15个氨基酸(“尾”)的SEQ ID NO 2序列的至少10、20或30个氨基酸的功能片段。ActRIIb多肽可由在严格条件下与SEQ ID NO :3或5的核酸杂交的核酸编码。与天然存在的ActRIIb多肽相比，ActRIIb多肽可在氨基酸序列中(例如在配体结合结构域中)包括一个或多个变化。经改变的ActRIIb多肽的实例参见WO 2006/012627，第59-60页，通过引用结合到本文中。例如，氨基酸序列中的变化，当在哺乳动物、昆虫或其它真核细胞产生时可改变多肽的糖基化，或者与天然存在的ActRIIb多肽相比可改变多肽的蛋白酶剪切。ActRIIb多肽可以是融合蛋白，其具有ActRIIb多肽(例如ActRIIb的配体结合部分或其变体)作为一个结构域和提供所需性质(例如药代动力学改进、更易纯化、靶向特定组织等)的一个或多个其它结构域。例如，融合蛋白的结构域可提高以下性质的一种或多种体内稳定性、体内半寿期、摄取/给予、组织定位或分布、蛋白质复合体的形成、融合蛋白的多聚化和/或纯化。二聚化或多聚化可提供升高的配体结合亲和力。ActRIIb融合蛋 白可包含免疫球蛋白Fe结构域(野生型或突变型)或血清白蛋白或提供所需性质(例如药代动力学改进，溶解度提高或稳定性提高)的其它多肽部分。ActRIIb-Fc融合蛋白通常可作为同二聚复合体产生。任选ActRIIb-Fc融合物包含位于Fe结构域和ActRIIb胞外结构域之间相对松散的接头。该松散接头可相当于ActRIIb胞外域C端(“尾”)的大致15个氨基酸松散区，或者可以是1、2、3、4或5个氨基酸或者相对缺乏二级结构的长度介于5和15、20、30、50个或更多个氨基酸之间的人工序列，或者两者的混合物。接头可富含甘氨酸和脯氨酸残基，并可含有例如苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列或苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列(例如163、164、563或564单一序列或重复序列)。融合蛋白可包含纯化亚序列，例如表位标签、FLAG标签、聚组氨酸序列和GST融合物。任选可溶性ActRIIb多肽包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。药物制剂还可包括一种或多种其它化合物例如用于治疗骨病的化合物。优选药物制剂基本上无致热原。一般而言，优选在哺乳动物细胞系中表达ActRIIb蛋白，所述哺乳动物细胞系适当介导ActRIIb蛋白的天然糖基化以减少患者不利免疫应答的可能性。已成功利用人和CHO细胞系，预期其它常见的哺乳动物表达系统将是有用的。在某些方面，本公开内容提供编码ActRIIb多肽的核酸。分离多核苷酸可包含ActRIIb多肽例如上述多肽的编码序列。例如，分离核酸可包含编码ActRIIb的胞外域(例如配体结合结构域)的序列和以下序列，其编码ActRIIb的部分或全部跨膜结构域和/或胞质结构域，但不编码位于跨膜结构域或胞质结构域内或者位于胞外域与跨膜结构域或胞质结构域之间的终止密码子。例如，分离多核苷酸可包含全长ActRIIb多核苷酸序列(例如SEQ ID NO 4或5)或部分截短形式，所述分离多核苷酸还包含在3’端前至少600个核苷酸或位于其它部位的转录终止密码子，使得多核苷酸的翻译产生任选与全长ActRIIb的截短部分融合的胞外域。优选的核酸序列是SEQ ID N0:18。本文公开的核酸可与用于表达的启动子有效连接，而且本公开内容提供用这种重组多核苷酸转化的细胞。优选细胞为哺乳动物细胞，例如CHO细胞。在某些方面，本公开内容提供用于制备ActRIIb多肽的方法。这类方法可包括在合适的细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中表达本文公开的任何核酸(例如SEQ IDNO 4,5或18)。这类方法可包括a)在适于表达ActRIIb多肽的条件下培养细胞，其中所述细胞用ActRIIb表达构建体转化；和b)回收如此表达的ActRIIb多肽。ActRIIb多肽可作为未加工流分、部分纯化流分或高度纯化流分回收。纯化可通过一系列的纯化步骤实现，包括例如任何顺序的以下1、2或3种或更多种方法A蛋白层析法、阴离子交换层析法(例如Q琼脂糖凝胶)、疏水相互作用层析法(例如苯基琼脂糖凝胶(phenylsepharose))、大小排阻层析法和阳离子交换层析法。在某些方面，本文公开的ActRIIb拮抗剂，例如ActRIIb多肽，可用于促进受试者的骨生长或增加受试者的骨密度的方法。在某些实施方案中，本公开内容提供用于在有需要的患者中治疗与低骨密度相关的病症或促进骨生长的方法。方法可包括给予有需要的受试者有效量的ActRIIb拮抗剂。在某些方面，本公开内容提供ActRIIb拮抗剂在制备用于治疗本文所述病症或病况的药物中的用途。
在某些方面，本公开内容提供用于鉴定刺激骨生长或提高骨矿化的物质的方法。方法包括a)鉴定与ActRIIb多肽的配体结合结构域结合的试验物质；和幻评价所述物质对骨生长或骨矿化的作用。在某些方面，本公开内容提供用ActRIIb-Fc融合蛋白给药患者的方法，其包括按保持ActRIIb-Fc融合蛋白的血清浓度为至少8 u g/mL的给药方案将ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。在某些方面，本公开内容提供用于与ActRIIb-Fc融合蛋白一起给药患者的化合物，其中按保持ActRIIb-Fc融合蛋白的血清浓度为至少8 ii g/mL的方案给予ActRIIb-Fc融合蛋白。本文和权利要求书中描述了其它示例性的化合物、用途和给药方案。附图简述专利或申请文件包括至少一张彩色绘制图。在提出请求并支付任何必要费用后，可由专利局提供附带彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复件。图I表示各种脊椎动物ActRIIb蛋白和人ActRIIA的多个序列比对。图2表示在皮下给予单剂量的ActRIIb-Fc的人患者中的药代动力学(PK)概况。图3表示皮下给予人患者单剂量的ActRIIb-Fc后15、29或57天时瘦体重的平均变化百分比。图4表示在皮下给予人患者单剂量的ActRIIb-Fc后15、29或57天时瘦体重增加彡0. 5kg(上图)或彡I. Okg(下图)的受试者的百分比。图5表示皮下给予人患者单剂量的ActRIIb-Fc后在不同时间点上脂肪代谢的血清生物标志物瘦蛋白的变化。图6表示皮下给予人患者单剂量的ActRIIb-Fc后在不同时间点上脂肪代谢的血清生物标志物脂连蛋白的变化。图7表示皮下给予人患者单剂量的ActRIIb-Fc后在不同时间点上骨形成的血清生物标志物骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)的平均变化百分比。图8表示皮下给予人患者单剂量的ActRIIb-Fc后在不同时间点上骨吸收的血清生物标志物C端I型胶原端肽(CTX)的平均变化百分比。图9表示皮下给予人患者单剂量的ActRIIb-Fc后在不同时间点上血清促卵泡激素(FSH)的平均变化百分比。


图10表示给予3mg/kg ActRIIb-Fc单次皮下给药的代表性人受试者大腿横截面的磁共振成像(MRI)扫描。上图表示大腿的MRI评价，中图表示第9天的基线，下图表示给药后第29天的结果。灰色表示肌肉，皮下脂肪为粉红色，肌内脂肪为绿色。图11表示与安慰剂相比，给予lmg/kg ActRIIb-Fc或3mg/kgActRIIb_Fc单次皮下给药的人受试者在第29天的大腿肌肉体积自基线的平均变化百分比。图12表示SEQ ID NO :1的ActRIIb的信号序列和胞外域(SEQIDN0 :1的残基
1-134)与由SEQ ID NO :2表示的ActRIIb的胞外域的比对。正如所示，信号序列长为19个氨基酸。因此，SEQ ID NO :1的X位上的氨基酸相当于SEQ ID N0:2中的X-19位。举例来说，SEQ ID NO :1中30位的氨基酸是SEQ ID NO :2中11位的氨基酸。可确定本文所述其它ActRIIb序列的类似关系。图13表示人ActRIIa和ActRIIb的比对。用方框标出的残基代表根据多个ActRIIb和ActRIIa晶体结构的复合分析被认为直接接触配体的氨基酸残基(即配体结合袋(ligand binding pocket))。图14表示在实施例5所述的多个递增剂量研究期间不同天数时血清ActRIIb-hFc的药代动力学概况。图15在上轴显示ActRIIb-hFc血清浓度，在下轴显示促卵泡激素(FSH)的变化百分比。图16表示通过DXA测定，由不同剂量的ActRIIb-hFc引起的总体瘦质量的变化百分比。发明详述I.综沭转化生长因子(TGF-P)超家族包含多种生长因子，其都具有共同的序列元件和结构基序。已知这些蛋白质在脊椎动物和无脊椎动物两者中对多种细胞类型发挥生 物作用。该超家族的成员在图式形成和组织特化的胚胎发育期间发挥重要功能，可影响各种分化过程，包括脂肪形成、肌发生、软骨发生、心脏发生、血细胞生成、神经发生、和上皮细胞分化。通过操控TGF-P家族成员的活性，常常可引起生物体的重大生理改变。例如Piedmontese和Belgian Blue牛品种在⑶F8 (亦称肌肉生长抑制素)基因中携带引起肌肉质量明显增加的功能缺失突变。Grobet等，Nat Genet. 1997，17 (I) -Jl-A0此外，在人中，⑶F8的无活性等位基因与肌肉质量增加和据报道的异常强度有关。Schuelke等，N EnglJMed 2004，350 :2682_8。激活素是属于TGF-P超家族的二聚多肽生长因子。有3种主要的激活素形式(A、B和AB)，其是两个密切相关的P亚基的同二聚体/异二聚体W J A、PbPb和PaPb)。人基因组还编码主要在肝中表达的激活素C和激活素E。在TGF-P超家族中，激活素是独特的多功能因子，可刺激卵巢和胎盘细胞的激素产生、支持神经元细胞存活、根据细胞类型正面或负面影响细胞周期进程，并且至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层分化(DePaolo等，1991，Proc Soc Ep Biol Med. 198 :500-512 ;Dyson 等，1997，Curr Biol. 7:81-84 ；ffoodruff,1998, Biochem Pharmacol. 55 :953-963)。此外，发现自经刺激的人单核细胞白血病细胞分离的红细胞分化因子(EDF)与激活素A相同(Murata等，1988，PNAS，85 :2434)。已经表明，激活素A在骨髓中起红细胞生成的天然正调节剂的作用。在若干组织中，激活素信号转导被其相关的异二聚体抑制素拮抗。例如在从垂体释放促卵泡激素(FSH)期间，激活素促进FSH分泌和合成，而抑制素阻止FSH分泌和合成。可调节激活素生物活性和/或与激活素结合的其它蛋白质包括促滤泡素抑制素(FS)、促滤泡素抑制素相关蛋白(FSRP)和a2-巨球蛋白。TGF-^家族信号受I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合体介导，所述受体在配体刺激后磷酸化并激活下游Smad蛋白(Massagu6, 2000, Nat. Rev. Mo I. CellBiol. I :169-178)。这些I型和II型受体是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸区的配体结合胞外域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的胞质结构域组成。I型受体是信号转导所必需的；11型受体是结合配体和表达I型受体所必需的。I型和II型激活素受体在配体结合后形成稳定的复合体，导致I型受体被II型受体磷酸化。两个相关的II型受体ActRIIa和ActRIIb已被鉴定为激活素的II型受体(Mathews 和 Vale, 1991，Cell 65 :973-982 ；Attisano 等，1992，Cell68 :97-108)。除激活 素以外，ActRIIa和ActRIIb可与若干其它的TGF-P家族蛋白质进行生化相互作用，包括 BMP7、Nodal、GDF8 和 GDFll (Yamashita 等，1995，J. Cell Biol. 130 :217-226 ；Lee 和McPherron,2001,Proc. Natl. Acad. Sci. 98 :9306-9311 ;Yeo 和 Whitman,2001,Mol. Cell 7 949-957 ;0h 等，2002，Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4 是激活素(特别是激活素 A)的主要I型受体，ALK-7也可用作激活素的受体，特别是激活素B的受体。如本文证实的一样，ActRIIb多肽(ActRIIb[20-134]-Fe)体内有效促进骨生长和增加骨密度，同时还增加肌肉质量。虽然不希望束缚于任何特殊机制，但预期ActRIIb对骨的作用主要是由激活素拮抗剂作用引起的。不论机制如何，从本文提供的数据来看显而易见，ActRIIb拮抗剂以与合成代谢/抗吸收综合作用一致的方式在人中增加骨密度，并且影响骨生物标志物。应当注意的是，骨是动态组织，其中生长或收缩以及密度增加或降低取决于产生骨和刺激矿化的因素(主要是成骨细胞)与破坏骨和使骨去矿化的因素(主要是破骨细胞)的平衡。可通过增加产生性因素、通过减少破坏性因素或者上述两者来提高骨生长和矿化。术语“促进骨生长”和“增加骨矿化”是指在骨中可观察到的物理变化，对于骨变化赖以发生的机制而言意图是中性的。除了促进骨生长外，本公开内容考虑在治疗或预防与ActRIIb或ActRIIb配体活性异常有关的疾病或病况中使用ActRIIb拮抗剂。例如，ActRIIb拮抗剂可用于治疗人或动物的病症或病况。这类病症或病况的实例包括但不限于代谢紊乱例如2型糖尿病、葡萄糖耐量减低(impaired glucose tolerance)、代谢综合征(例如X综合征)和由创伤(例如烧伤或氮失衡)诱导的胰岛素抵抗；脂肪组织病症(例如肥胖症)；肌肉和神经肌肉病症例如肌营养不良(包括杜兴肌营养不良)；肌萎缩性侧索硬化(ALS);肌肉萎缩；器官萎缩；虚弱；腕管综合征；充血性阻塞性肺病；以及肌肉衰减综合征、恶病质和其它肌肉消耗综合征。其它实例包括骨质疏松症，尤其在年长和/或绝经后女性中；糖皮质激素诱导的骨质疏松症；骨质减少；骨关节炎和骨质疏松症相关骨折。其它实例包括由长期糖皮质激素治疗所致的低骨质量、性腺早衰、雌激素阻抑、维生素D缺乏症、继发性甲状旁腺功能亢进症、营养缺乏和神经性厌食症。本公开内容提供使用ActRIIb多肽和其它ActRIIb拮抗剂以在人中促进骨生长和增加骨密度以及增加肌肉质量的方法。ActRIIb拮抗剂包括例如结合配体的ActRIIb多肽(例如ActRIIb-Fc)、与ActRIIb结合并破坏一种或多种配体(例如激活素或肌肉生长抑制素)结合的抗体、选择用于ActRIIb结合的非抗体蛋白(对于这类蛋白质以及设计和选择这类蛋白的方法的实例参见例如W0/2002/088171、W0/2006/055689和W0/2002/032925)、选择用于ActRIIb结合的常附在Fe结构域上的随机肽。具有ActRIIb结合活性的两种不同的蛋白质(或其它部分)，尤其分别阻断I型(例如可溶性I型激活素受体)和II型(例如可溶性II型激活素受体)结合部位的激活素结合剂，可连接在一起产生双功能结合分子。包括抑制ActRIIb信号转导轴的核酸适体、小分子和其它物质作为ActRIIb拮抗剂。在本发明的上下文中，以及在使用各个术语具体的上下文中，用于本说明书的术语一般具有其在本领域的一般含义。下文或本说明书其它部分论述了某 些术语，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用所述组合物和方法时，对从业人员提供额外的指导。术语任何用法的范围或含义从使用术语的具体上下文来看将是显而易见的。“约”和“大约”总的来讲应意指给定测量的性质或精确度，对所测定的量的可接受的误差度。示例性误差度通常在给定值或值的范围的20%、优选10%、更优选5%内。或者，特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可意指在给定值的数量级以内、优选5倍以内、更优选2倍以内的值。本文给出的数值的量是近似值，除非另有说明，否则意指在未明确表示时可推断该术语“约”或“大约”。本发明的方法可包括将序列彼此进行比较的步骤，包括将野生型序列与一个或多个突变型(序列变体)比较。这类比较通常包括多聚体序列的比对，例如应用本领域众所周知的序列比对程序和/或算法(例如BLAST、FASTA和MEGALIGN等)。技术人员可容易理解的是，在其中突变含有残基插入或缺失的这类比对中，序列比对可在不含插入残基或缺失残基的多聚体序列中引入“空位”(通常用破折号或“A”表示)。在所有其语法形式和拼法变化中，“同源的”是指具有“共同进化起源”的两种蛋白质之间的关系，包括来源于同一生物物种超家族的蛋白质以及来源于不同生物物种的同源蛋白质。这类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，正如其序列相似性所反映的一样，不论就百分比同一性而言，还是就特定残基或基序和保守位置的存在情况而论。在所有其语法形式中，术语“序列相似性”是指可能有或没有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或一致性程度。然而，在普通用法中，以及在本申请中，术语“同源的”当用副词(例如“高度地”)修饰时，可以是指序列相似性，并且可能与共同进化起源有关或无关。2. ActRIIb 多肽在某些方面，本发明涉及ActRIIb多肽。本文所用术语“ActRIIb”是指来自任何物种的激活素受体IIb型(ActRIIb)蛋白家族和通过诱变或其它修饰衍生自这类ActRIIb蛋白的变体。本文对ActRIIb的提及要理解为是提及任一种目前已鉴定的形式。ActRIIb家族的成员一般是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸区的配体结合胞外域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质结构域组成。术语“ActRIIb多肽”包括包含ActRIIb家族成员的任何天然存在的多肽及其保持有用活性的任何变体(包括突变型、片段、融合物和肽模拟形式)的多肽。参见例如TO/2006/012627 Jy^iSActRIIb多肽通过引用结合到本文中。例如，ActRIIb多肽包括来源于任何已知ActRIIb序列的具有以下序列的多肽，所述序列与ActRIIb多肽序列有至少约80%同一性、任选至少85%、90%、95%、97%、99%或更大同一性。例如，本发明的ActRIIb多肽可结合ActRIIb蛋白并抑制ActRIIb蛋白的功能。可针对在体内促进红血细胞形成的活性选择ActRIIb多肽。ActRIIb多肽的实例包括人ActRIIb前体多肽(SEQ ID NO 1)和可溶性人 ActRIIb 多肽(例如 SEQ ID NO:2、3、13、17 或 20)。人ActRIIb前体蛋白序列如下MTAPffVALALLffGSLffPG SGRGEAETRECIYYNANWELERT0QSGLERCEGEQDKRLHCYASWAgSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTY
EPPPTAPTlltvlaysllpigglslivllafwmyrhrkppyghvdihedpgppppsplvglkplqlleikarg
RFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLLQFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETMSRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEPGKPPG DTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIKDHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI (SEQ ID NO :1)信号肽用单条下划线表示；胞外域用黑体字表示，可能的N联糖基化位点用方框标出。人ActRIIb可溶性(胞外)的经加工的多肽序列如下GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT(SEQ ID NO 2)在一些情况下，可产生在N端带有“SGR... ”序列的蛋白质。胞外域的C端“尾”用下划线表示。“尾”缺失的序列(A 15序列)如下GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA(SEQ ID NO :3)在一些情况下，可产生在N端带有“SGR... ”序列的蛋白质。编码人ActRIIb前体蛋白的核酸序列如下(Genbank登录号NM_001106的核苷酸5-1543)ATGACGGCGCCCTGGGTGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGGCCCGGCTCTGGGCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGCGAAGGCGAGCAGGACAAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGGCCAACAGCTCTGGCACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCTAGATGACTTCAACTGCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGCGCTTCACTCATTTGCCAGAGGCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGACAGCCCCCACCCTGCTCACGGTGCTGGCCTACTCACTGCTGCCCATCGGGGGCCTTTCCCTCATCGTCCTGCTGGCCTTTTGGATGTACCGGCATCGCAAGCCCCCCTACGGTCATGTGGACATCCATGAGGACCCTGGGCCTCCACCACCATCCCCTCTGGTGGGCCTGAAGCCACTGCAGCTGCTGGAGATCAAGGCTCGGGGGCGCTTTGGCTGTGTCTGGAAGGCCCAGCTCATGAATGACTTTGTAGCTGTCAAGATCTTCCCACTCCAGGACAAGCAGTCGTGGCAGAGTGAACGGGAGATCTTCAGCACACCTGGCATGAAGCACGAGAACCTGCTACAGTTCATTGCTGCCGAGAAGCGAGGCTCCAACCTCGAAGTAGAGCTGTGGCTCATCACGGCCTTCCATGACAAGGGCTCCCTCACGGATTACCTCAAGGGGAACATCATCACATGGAACGAACTGTGTCATGTAGCAGAGACGATGTCACGAGGCCTCTCATACCTGCATGAGGATGTGCCCTGGTGCCGTGGCGAGGGCCACAAGCCGTCTATTGCCCACAGGGACTTTAAAAGTAAGAATGTATTGCTGAAGAGCGACCTCACAGCCGTGCTGGCTGACTTTGGCTTGGCTGTTCGATTTGAGCCAGGGAAACCTCCAGGGGACACCCACGGACAGGTAGGCACGAGACGGTACATGGCTCCTGAGGTGCTCGAGGGAGCCATCAACTTCCAGAGAGATGCCTTCCTGCGCATTGACATGTATGCCATGGGGTTGGTGCTGTGGGAGCTTGTGTCTCGCTGCAAGGCTGCAGACGGACCCGTGGATGAGTACATGCTGCCCTTTGAGGAAGAGATTGGCCAGCACCCTTCGTTGGAGGAGCTGCAGGAGGTGGTGGTGCACAAGAAGATGAGGCCCACCATTAAAGATCACTGGTTGAAACACCCGGGCCTGGCCCAGCTTTGTGTGACCATCGAGGAGTGCTGGGACCATGATGCAGAGGCTCGCTTGTCCGCGGGCTGTGTGGAGGAGCGGGTGTCCCTGATTCGGAGGTCGGTCAACGGCACTACCTCGGACTGTCTCGTTTCCCTGGTGACCTCTGTCACCAATGTGGACCTGCCCCCTAAAGAGTCAAGCATCTAA(SEQ ID NO :4)编码人ActRIIb可溶性(胞外)多肽的核酸序列如下TCTGGGCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGCGAAGGCGAGCAGGACAAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGGCCAACAGCTCTGGCACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCTAGATGACTTCMCTGCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCA CTGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGCGCTTCACTCATTTGCCAGAGGCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGACAGCCCCCACC(SEQ ID NO 5)在一个具体实施方案中，本发明涉及可溶性ActRIIb多肽。本文所述术语“可溶性ActRIIb多肽” 一般是指包含ActRIIb蛋白的胞外域的多肽。本文所用术语“可溶性ActRIIb多肽”包括任何天然存在的ActRIIb蛋白的胞外域及其任何变体(包括突变型、片段和肽模拟形式)。结合激活素的ActRIIb多肽是保持与激活素(包括例如激活素AA、AB、BB或包括C或E亚基的形式)结合的能力的多肽。任选结合激活素的ActRIIb多肽可以InM或更低的解离常数与激活素AA结合。ActRIIb蛋白的胞外域与激活素结合，并且在生理条件下一般是可溶的，因此可称为可溶的结合激活素的ActRIIb多肽。可溶的结合激活素的ActRIIb多肽的实例包括SEQ ID NOs :2、3、13、17或20所示可溶性多肽。SEQ ID NO:13称为ActRIIb (20-134)-hFc，在实施例对其作进一步描述。除ActRIIb蛋白的胞外域以夕卜，可溶性ActRIIb多肽的其它实例还包括信号序列，例如，蜜蜂蜂毒肽(melIitin)前导序列(SEQ ID NO : 14)、组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO 15)或天然ActRIIb前导序列(SEQ ID NO 16) o SEQ ID NO : 17所示ActRIIb-hFc多肽使用TPA前导序列。在某些实施方案中，本发明涉及ActRIIb变体多肽(例如可溶性ActRIIb多肽)。任选片段、功能变体和修饰形式具有与其相应的野生型ActRIIb多肽相似或相同的生物活性。例如，本发明的ActRIIb变体可结合ActRIIb配体(例如激活素A、激活素AB、激活素B、Nodal、⑶F8、⑶Fll或BMP7)并抑制ActRIIb配体的功能。任选ActRIIb多肽调节例如骨、软骨、肌肉或脂肪等组织的生长。ActRIIb多肽的实例包括人ActRIIb前体多肽(SEQ IDNO: I)和可溶性人 ActRIIb 多肽(例如 SEQ ID NOs :2、3、13、17 或 20)。除非另有说明，否则本文所述ActRIIb多肽中的氨基酸位置参照前体ActRIIb多肽(即SEQ ID NO :1)来设定。应当了解的是，根据本文提供的信息可容易地鉴定另一个ActRIIb多肽的相应位置。例如，前体ActRIIb多肽含有19个氨基酸的前导序列，其不包含在SEQ ID NO 2所示ActRIIb的可溶性胞外部分中。因此，SEQ ID NO 1的X位上的残基相当于SEQ ID NO 2的残基X-19。例如，SEQ ID NO 1的残基30相当于SEQ ID NO 2的残基11 (参见图12)。可确定本文所述其它ActRIIb序列的类似关系。本公开内容鉴定了 ActRIIb的功能活性部分和变体。申请人已查明，具有Hilden等人(Blood. 1994年4月15日；83(8) =2163-70)公开的序列(其在相当于SEQ ID NO 1的氨基酸64的位置上具有丙氨酸(A64))的Fe融合蛋白，对激活素和GDF-II具有相对低的亲和力。相比之下，在64位具有精氨酸(R64)的相同Fe融合蛋白对激活素和GDF-Il具有低纳摩尔至高微微摩尔范围的亲和力。因此，具有R64的序列在本公开内容中用作人ActRIIb的野生型参比序列。Attisano 等人(Cell. 1992 年 I 月 10 日；68(1) :97-108)表明，ActRIIb 胞夕卜域C端的脯氨酸结缺失降低受体对激活素的亲和力。与包含脯氨酸结区和完全近膜域的ActRIIb (20-134)-Fe 相比，含有 SEQ ID NO 1 的氨基酸 20-119 的 ActRIIb-Fc 融合蛋白“ActRIIb(20-119)-Fc”与⑶F-Il和激活素的结合减弱(参见美国公布号2009/0005308)。然而，与野生型相比，ActRIIb(20-129)-Fc蛋白保持类似但略微降低的活性，即使脯氨酸结区被破坏。因此，预期止于氨基酸134、133、132、131、130和129的ActRIIb胞外域全都有活性，而止于134或133的构建体可能有最大活性。类似地，预期残基129-134任一个的突变不会大幅度改变配体结合亲和力。P129和P130的突变不显著降低配体结合，支持这种预期。因此，ActRIIb-Fc融合蛋白早在氨基酸109(最后的半胱氨酸)便可终止，然而，预期止于109和119或介于109和119之间的形式的配体结合降低。氨基酸119是不太保守的，因此容易改变或截短。止于128或之后的形式保持配体结合活性。终于119和127或介于119和127之间的形式可具有中等结合能力。据报道，ActRIIb (25-118)-hFc有效用于抑制激活素和其它配体，并用于提高肌肉质量，因此，这类截短ActRIIb-hFc蛋白可用于本文所述方法(参见Zhou等，2010，Cell 142 :531-543)。这些形式的任一种都可合理地使用，这取决于临床或实验背景。在ActRIIb的N端，预期始于氨基酸29或之前的蛋白质可保持配体结合活性。氨基酸29表示起始半胱氨酸。在不显著影响配体结合的情况下，24位丙氨酸突变成天冬酰胺 引入N联糖基化序列。这就证实了完全容许信号切割肽和半胱氨酸交联区之间的区域(相当于氨基酸20-29)的突变。具体地讲，始于20、21、22、23和24位的构建体可保持活性，而同样预期始于25、26、27、28和29位的构建体保持活性。始于22、23、24或25的构建体可具有最大活性(参见美国公布号2009/0005308)。总之，ActRIIb的活性部分包含SEQ ID NO : I的氨基酸29_109，构建体可始于例如相当于氨基酸20-29的残基并止于相当于氨基酸109-134的位置。其它实例包括始于20-29或 21-29 位和止于 118-134、118-133、119-134、119-133 或 129-134、129-133 位的构建体。其它实例包括始于20-24 (或21-24、或22-25)位和止于109-134 (或109-133)、118-134 (或118-133)、119-134(或119-133)或129-134 (或129-133)位的构建体。还考虑了这些范围内的变体，特别是与SEQ ID勵2的相应部分有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的变体。美国公布号2009/0005308中提供了对ActRIIb的结构功能分析的大量分析，所述分析通过引用结合到本文中。很可能在结合袋中与配体接触的ActRIIb残基界定为SEQ IDNO I 的残基 Y31、N33、N35、L38-T41、E47、E50、Q53-K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78-N83、Y85、R87、A92和E94-F101。在这些位置上，预期可容许保守突变，尽管颇容许K74A突变，正如R40A、K55A、F82A和L79位点的突变一样。在非洲蟾蜍属(Xenopus)中R40为K，这就表明在这个位置上可容许碱性氨基酸。在牛ActRIIb中Q53为R，在非洲蟾蜍属ActRIIb中为K，因此在这个位置上可容许的氨基酸包括R、K、Q、N和H。除了这些残基以外，预期相对较好地容许修饰，前提条件是这类改变在整体上不破坏蛋白质的结构。当蛋白质结构受破坏时，是轻易可见的，因为蛋白质趋于表达低下，或在培养基中降解。因此，活性ActRIIb变体蛋白的通式是这样的通式，其包含氨基酸29-109，但任选始于20-24或22-25范围的位置且止于129-134范围的位置，并在配体结合袋中包含不多于1、2、5、10或15个保守氨基酸变化，且在配体结合袋的40、53、55、74、79和/或82位上包含零、一个或多个非保守改变。这类蛋白质可保留与SEQ ID NO :1的氨基酸29-109序列大于80%、90%、95%或99%的序列同一性。可特别好地容许变异性的结合袋以外的位点，包括胞外域的氨基端和羧基端(如上所述)，及SEQID NO : I的42-46和65-73位。在A64背景下，65位天冬酰胺改变成丙氨酸(N65A)实际上提高配体结合，因此预期N65A在R64背景下对配体结合没有不利作用。在A64背景下，这种改变可能消除N65上的糖基化，因此证实这个区的显著变化很可能是容许的。虽然不太容许R64A变化，但完全容许R64K，因此在64位上可容许另一种碱性残基(例如H)。
ActRIIb在几乎所有脊椎动物中是十分保守的，具有大段完全保守的胞外域。结合ActRIIb的许多配体也是高度保守的。因此，对不同脊椎动物生物进行ActRIIb序列的比较为可被改变的残基提供见识。因此，有活性的人ActRIIb变体可包含另一种脊椎动物ActRIIb序列相应位置上的一个或多个氨基酸，或者可包含类似于人或其它脊椎动物序列的残基。下列实例说明了界定活性ActRIIb变体的这种方法。人ActRIIb的L46在非洲蟾蜍属ActRI Ib中为缬氨酸，因此可改变该位置，任选可变成另一个疏水残基例如V、I或F，或非极性残基例如A。人ActRIIb的E52在非洲蟾蜍属ActRIIb中为K，表明这个位点可容许许多变化，包括极性残基，例如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y，以及可能的A。人ActRIIb的T93在非洲蟾蜍属ActRIIb中为K，表明在这个位置上容许宽广的结构变化，其中优选极性残基，例如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y。人ActRIIb的F108在非洲蟾蜍属ActRIIb中为Y，因此应容许Y或其它疏水基团，例如I、V或L。人ActRIIb的Elll在非洲蟾蜍属ActRIIb中为K，表明在该位置可容许带电荷的残基，包括D、R、K和H，以及Q和N。人ActRIIb的R112在非洲蟾蜍属ActRIIb中为K，表明在该位置上容许碱性残基，包括R和H。人ActRIIb第19位上的A是相对不太保守的，在啮齿动物ActRIIb以P出现，在非洲蟾蜍属ActRIIb以V出现，因此在该位置上应容许基本上任何氨基酸。 与ActRI Ib (R64) -Fe形式相比，加入另一个N联糖基化位点(N-X-S/T)延长ActRIIb-Fc融合蛋白的血清半寿期(参见美国公布号2009/0005308)。通过在24位引入天冬酰胺(A24N构建体)，产生赋予较长半寿期的NXT序列。SEQ ID NO : I的42-44 (NQS)和65-67 (NSS)中存在其它NX(T/S)序列，虽然后者在64位的R的情况下可能不被有效糖基化。一般可在图13界定的配体结合袋以外的位置上引入N-X-S/T序列。用于引入非内源N-X-S/T序列的特别合适的位点包括SEQ ID NO 1的氨基酸20_29、20-24、22_25、109-134、120-134或129-134。还可将N-X-S/T序列引入ActRIIb序列与Fe或其它融合物组分之间的接头中。可通过将N引入有关预先存在的S或T的正确位置上，或者通过将S或T引入预先存在的N的相应位置上而以最小的努力引入这类位点。因此，可产生N联糖基化位点的理想变化为A24N、R64N、S67N(可能与 N65A 变化组合)、E106N、R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112S和R112T。由于糖基化提供的保护，可将预计进行糖基化的任何S变成T而不产生免疫原性位点。同样，可将预计进行糖基化的任何T变成S。因此考虑了 S67T和S44T变化。同样，在A24N变体中，可采用S26T变化。因此，ActRIIb变体可包括一个或多个其它非内源性N联糖基化共有序列。可改变L79位以提供经改变的激活素-肌肉生长抑制素(OTF-Il)结合性质。与激活素结合相比，L79A或L79P更大程度地降低⑶F-Il结合。L79E或L79D保持⑶F-Il结合。引人注目的是，L79E和L79D变体的激活素结合大大降低。体内实验表明这些非激活素受体保持增加肌肉质量但对其它组织的作用降低的重要能力。这些数据证实获得对激活素的作用降低的多肽的需要性和可行性。所述变化可以各种方式组合。此外,本文所述诱变程序的结果表明ActRIIb中存在通常有益于保守的氨基酸位置。这些包括64位(碱性氨基酸)、80位(酸性或疏水氨基酸)、78位(疏水氨基酸，特别是色氨酸)、37位(酸性氨基酸，特别是天冬氨酸或谷氨酸)、56位(碱性氨基酸)、60位(疏水氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸)。因此，在本文公开的各个变体中，本公开内容提供可为保守的氨基酸的构架。对保守可为所需的其它位置如下52位(酸性氨基酸)、55位(碱性氨基酸)、81位(酸性)、98位(极性或带电荷、特别 是 E、D、R 或 K)。在某些实施方案中，可通过筛选由编码ActRIIb多肽的核酸(例如SEQ ID NOs 4和5)的相应片段重组产生的多肽，来获得ActRIIb多肽的分离片段。此外，片段可采用本领域已知技术(例如常规Merrifield固相f_Moc或t_Boc化学法)进行化学合成。可产生(经重组或通过化学合成)片段，并测定以鉴定可起例如ActRIIb蛋白或ActRIIb配体的拮抗剂(抑制剂)或激动剂(激活剂)作用的肽基片段。在某些实施方案中，ActRIIb多肽的功能变体具有与选自SEQ ID NOs :2、3、13、17或20的氨基酸序列有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些情况下，功能变体具有与选自SEQ ID NOs :2、3、13、17 或 20 的氨基酸序列有至少 80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明考虑通过修饰ActRIIb多肽的结构而制备功能变体以用于诸如提高治疗功效或稳定性(例如离体保存限期和体内蛋白水解降解抗性)等目的。还可通过例如氨基酸取代、缺失或添加产生修饰的ActRIIb多肽。例如，有理由预期亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸单独置换、天冬氨酸被谷氨酸单独置换、苏氨酸被丝氨酸的单独置换或者氨基酸被结构上相关的氨基酸(例如保守突变)的类似置换将不会对所得分子的生物活性有重大作用。保守置换是在其侧链上是相关的氨基酸家族内发生的置换。可通过评价变体ActRIIb多肽以类似于野生型ActRIIb多肽的方式在细胞中产生反应的能力，或者以类似于野生型的方式结合一种或多种配体(例如激活素、GDF-Il或肌肉生长抑制素)的能力，来容易地确定ActRIIb多肽的氨基酸序列的改变是否产生功能同源物。在某些具体实施方案中，本发明考虑在ActRIIb多肽的胞外域(亦称为配体结合结构域)产生突变使得变体(或突变型)ActRIIb多肽的配体结合活性(例如结合亲和力或结合特异性)发生改变。在某些情况下，这类变体ActRIIb多肽对特定配体的结合亲和力发生改变(升高或降低)。在其它情况下，变体ActRIIb多肽对其配体的结合特异性发生改变。例如，本公开内容提供与激活素相比优先结合⑶F8/⑶Fll的变体ActRIIb多肽。本公开内容还确立了用于降低脱靶作用的这类多肽的需要性，虽然对于治疗严重疾病可能不太需要这类选择性变体，所述严重疾病中的治疗效果可能需要在肌肉质量方面有非常大的增加，并且其中一定水平的脱靶作用是可接受的。例如，ActRIIb蛋白的氨基酸残基，例如E39、K55、Y60、K74、W78、D80和FlOl位于配体结合袋中，并介导与其配体(例如激活素和⑶F8)的结合。因此，本发明提供经改变的ActRIIb受体的配体结合结构域(例如⑶F8结合结构域)，其在那些氨基酸残基上包含一个或多个突变。任选与ActRIIb受体的野生型配体结合结构域相比，经改变的配体结合结构域对配体(例如GDF8)的选择性可提高。举例来说,这些突变提高经改变的配体结合结构域对GDF8优于激活素的选择性。任选经改变的配体结合结构域对激活素结合的Kd与对GDF8结合的Kd之比为野生型配体结合结构域的该比率的至少2、5、10倍，甚至100倍。任选经改变的配体结合结构域抑制激活素的IC5tl与抑制⑶F8的IC5tl之比为野生型配体结合结构域的至少2、5、10倍，甚至100倍。任选经改变的配体结合结构域抑制⑶F8的IC5tl为抑制激活素的IC5tl的至多1/2、1/5、1/10倍，1/100。
作为一个具体实例，可使ActRIIb的配体结合结构域的带正电荷的氨基酸残基Asp (D80)突变成不同的氨基酸残基，使得变体ActRIIb多肽优先与GDF8而不是激活素结合。优选将D80残基变成选自以下的氨基酸残基不带电荷的氨基酸残基、带负荷的氨基酸残基和疏水氨基酸残基。作为又一个具体实例，可将疏水残基L79变成酸性氨基酸天冬氨酸或谷氨酸，以大大降低激活素结合，同时却保持GDFll结合。正如本领域技术人员公认的一样，可在核酸水平下进行大部分所述突变、变体或修饰，或者，在某些情况下，可通过翻译后修饰或化学合成进行。这类技术是本领域众所周知的。在某些实施方案中，本发明考虑ActRIIb多肽的特定突变以改变多肽的糖基化。ActRIIb多肽中示例性的糖基化位点如SEQ ID N0:1所示。可选择这类突变从而引入或消除一个或多个糖基化位点，例如0联或N联糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点一般包含三肽序列天冬酰胺-X-苏氨酸(其中“X”是任何氨基酸)，其被合适的细胞糖基化酶特异性识别。还可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至野生型ActRIIb多肽序列上，或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代野生型ActRIIb多肽序列来进行改变(对于0联糖基化位点)。在糖基化识别位点第一或第三氨基酸位置的一个或两个上的多种氨基酸取代或缺失(和/或在第二位置上的氨基酸缺失)导致修饰三肽序列的非糖基化。在ActRIIb多肽上增加糖部分数目的另一种方法是通过将糖苷与ActRIIb多肽化学偶联或酶促偶联。根据所用偶联方式，可将一个或多个糖与以下基团连接(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基；(e)芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺酰胺基。这些方法披露于1987年9月11日公布的WO 87/05330及Aplin和Wriston(1981)CRC Crit. Rev. Biochem.，第 259-306 页，通过引用结合到本文中。ActRIIb多肽上存在的一个或多个糖部分的脱去可用化学方法和/或酶促方法完成。化学去糖基化可包括例如将ActRIIb多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物中。这种处理导致切割除连接糖(N-乙酰氨基葡萄糖或N-半乳糖胺)以外的大多数或所有糖，同时保持氨基酸序列完整。化学去糖基化进一步披露于Hakimuddin等(1987) Arch. Biochem. Biophys. 259 52和Edge等(1981) Anal. Biochem. 118 :131 JctRIIb多肽糖部分的酶促切割可通过使用以下文献披露的各种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现Thotakura等(1987)Meth. Enzymol. 138 350。适当时可根据所用的表达系统类型调整ActRIIb多肽的序列，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞均可引入可被肽的氨基酸序列影响的不同糖基化模式。总的来说，用于人的ActRIIb蛋白可在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系例如HEK293或CHO细胞系中表达，虽然预期其它哺乳动物表达细胞系也是有用的。本公开内容还考虑了产生变体、特别是数套ActRIIb多肽组合变体(任选包括截短变体)的方法；组合突变型库尤其可用于鉴定功能变体序列。筛选这类组合文库的目的可以是产生例如性质改变(例如药代动力学改变或配体结合改变)的ActRIIb多肽变体。下面提供各种筛选测定法，这类测定法可用来评价变体。例如，可针对结合ActRIIb多肽的能力、防止ActRIIb配体与ActRIIb多肽结合的能力筛选ActRIIb多肽变体。还可以在基于细胞的测定或体内测定中测定ActRIIb多肽或其变体的活性。例如，可以对ActRIIb多肽变体对在成骨细胞或前体中参与骨产生的基因的表达的作用进行评价。这可根据需要在一种或多种重组ActRIIb配体蛋白(例如BMP7)存在下进行，可以转染细胞以产生ActRIIb多肽和/或其变体，任选ActRIIb配体。同样，可将ActRIIb多肽给予小鼠或其它动物，并对一种或多种骨性质(例如密度或体积)进行评价。还可评价骨 折的愈合速度。类似地，可在肌肉细胞、脂肪细胞和神经元细胞中测试ActRIIb多肽或其变体对这类细胞生长的任何作用的活性，例如通过下述测定。这类测定是本领域众所周知和常规的。SMAD反应性报道基因可用于这类细胞系中以监测对下游信号转导的作用。可以制备相对于天然存在的ActRIIb多肽具有选择功效的组合衍生的变体。这类变体蛋白，当从重组DNA构建体表达时，可用于基因治疗方案。同样，诱变可产生与相应的野生型ActRIIb多肽相比胞内半寿期十分不同的变体。例如，对于蛋白水解降解或者导致天然ActRIIb多肽破坏或以其它方式失活的其它过程，可使经改变的蛋白质更稳定或更不稳定。可利用这类变体和编码所述变体的基因，以通过调节ActRIIb多肽的半寿期来改变ActRIIb多肽水平。例如，短的半寿期可产生更短暂的生物作用，并且当作为诱导型表达系统的部分时，可供更密切地控制细胞内的重组ActRIIb多肽水平。在某些实施方案中，除天然存在于ActRIIb多肽中的任何修饰以外，本发明的ActRIIb多肽还可包含翻译后修饰。这类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。因此，经修饰的ActRIIb多肽可含有非氨基酸成分，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸酯。可按照本文有关其它ActRIIb多肽变体方面所述，测试这类非氨基酸成分对ActRIIb多肽的功能性的作用。如果ActRIIb多肽在细胞中通过切割ActRIIb多肽的新生形式产生，则翻译后加工对于蛋白质的正确折叠和/或功能也可为重要的。不同的细胞(例如CH0、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)对于这类翻译后活性具有特定的细胞机构和特有机制，可选择不同的细胞以确保ActRIIb多肽的正确修饰和加工。在某些方面，ActRIIb多肽的功能变体或修饰形式包括具有ActRIIb多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域的融合蛋白。这类融合结构域的众所周知的实例包括但不限于聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重链恒定区(例如Fe)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可选择融合结构域以提供所需要的性质。例如，一些融合结构域特别可用于通过亲和层析法分离融合蛋白。为了亲和纯化的目的，使用用于亲和层析法的相关基质，例如谷胱甘肽缀合树脂、淀粉酶缀合树脂和镍缀合树脂或钴缀合树脂。这类基质的许多种可以“试剂盒”形式获得，例如PharmaciaGST纯化系统和可与(HIS6)融合配偶体一起使用的QIAexpress 系统(Qiagen)。作为另一个实例，可选择融合结构域以促进ActRIIb多肽的检测。这类检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如GFP)以及“表位标签”，其通常是短肽序列，可获得其特异性抗体。易获得其特异性单克隆抗体的众所周知的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在某些情况下，融合结构域具有例如因子Xa或凝血酶的蛋白酶切割位点，其允许相关蛋白酶部分消化融合蛋白，从而从中释放重组蛋白。然后，可通过随后的层析分离，从融合结构域分离出释放的蛋白质。在某些优选的实施方案中，ActRIIb多肽与体内稳定ActRIIb多肽的结构域(“稳定剂”结构域)融合。所谓“稳定 ”意指延长血清半寿期的任何方法，不论这是否是因为破坏减少、肾清除率降低或其它药代动力学作用。已知与免疫球蛋白的Fe部分的融合物赋予多种蛋白质所需要的药代动力学性质。同样，与人血清白蛋白的融合物可赋予所需要的性质。可选择的融合结构域的其它类型，包括多聚化(例如二聚化、四聚化)结构域和功能结构域(其赋予其它生物功能，例如进一步刺激肌肉生长)。作为一个具体实例，本发明提供包含与Fe结构域(例如SEQ ID NO 6)融合的胞外(例如结合GDF8的)结构域的融合蛋白作为GDF8拮抗剂。THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK优选Fe结构域在例如Asp-265、赖氨酸322和Asn_434等残基上具有一个或多个突变。在某些情况下，与野生型Fe结构域相比，具有这些突变的一个或多个(例如Asp-265突变)的突变型Fe结构域与Fe Y受体结合的能力降低。在其它情况下，与野生型Fe结构域相比，具有这些突变的一个或多个(例如Asn-434突变)的突变型Fe结构域与MHC I类相关Fe-受体(FcRN)结合的能力提高。要理解的是，融合蛋白的不同组分可以与所需功能性一致的任何方式排列。例如，可将ActRIIb多肽置于异源结构域的C端，或者，可将异源结构域置于ActRIIb多肽的C端。ActRIIb多肽结构域和异源结构域在融合蛋白中不一定邻接，在任一结构域的C端或N端或者在结构域之间可包括其它结构域或氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的ActRIIb多肽含有能够稳定ActRIIb多肽的一种或多种修饰。例如，这类修饰延长ActRIIb多肽的体外半寿期、延长Act-RIIb多肽的循环半寿期或降低ActRIIb多肽的蛋白水解降解。这类稳定修饰包括但不限于融合蛋白(包括例如包含ActRIIb多肽和稳定剂结构域的融合蛋白)、糖基化位点的修饰(包括例如将糖基化位点加至ActRIIb多肽上)和糖部分的修饰(包括例如从ActRIIb多肽中脱去糖部分)。在融合蛋白的情况下，ActRIIb多肽与稳定剂结构域(例如IgG分子(例如Fe结构域))融合。本文使用的术语“稳定剂结构域”不仅仅是指融合蛋白的情况下的融合结构域(例如Fe)，而且还包括非蛋白质修饰(例如糖部分)或非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇)。在某些实施方案中，本发明可获得ActRIIb多肽的分离和/或纯化形式，其与其它蛋白酶分离或者基本上不含其它蛋白质。ActRIIb多肽一般可通过由重组核酸表达而产生。在某些实施方案中，本发明的ActRIIb多肽(未修饰或修饰)可通过各种本领域已知技术产生。例如，这类ActRIIb多肽可采用标准蛋白质化学技术合成，所述技术为例如披露于以下文献的技术Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, SpringerVerlag, Berlin(1993)和 Grant G. A.(主编)，Synthetic Peptides A User' s Guide,ff. H. Freeman and Company, New York(1992) 此外，自动化肽合成仪是市售的(例如Advanced ChemTech Model 396 ；Milligen/Biosearch 9600)。或者，ActRIIb 多妝、其片段或变体可使用本领域众所周知的各种表达系统(例如大肠杆菌E. coli)、中国仓鼠卵巢细胞、COS细胞、杆状病毒)重组产生(另见下文)。在又一个实施方案中，可通过使用例如蛋白酶(例如胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或配对碱性氨基酸转化酶(PACE))，经消化天然存在的或重组产生的全长ActRIIb多肽，来产生修饰或未修饰的ActRIIb多肽。计算机分析(应用市售软件，例如MacVector, Omega, PCGene, MolecularSimulation, Inc.)可用于鉴定蛋白酶剪切位点。或者,可通过例如本领域已知标准技术，例如通过化学裂解(例如溴化氰、羟胺)，由天然存在的或重组产生的全长ActRIIb多肽产生这类ActRIIb多肽。3.编码ActRIIb多狀的核酸
在某些方面，本发明提供编码任何ActRIIb多肽(例如全长和可溶性ActRIIb多肽)(包括本文公开的片段、功能变体和融合蛋白)的分离核酸和/或重组核酸。例如，SEQID NO 4编码天然存在的人ActRIIb前体多肽，而SEQ ID NO 5编码ActRIIb的经加工的胞外域。主题核酸可为单链或双链。这类核酸可以是DNA或RNA分子。可将这些核酸用于例如制备ActRIIb多肽的方法或用作直接治疗药物(例如在基因疗法中)。在某些方面，编码ActRIIb多肽的主题核酸进一步理解为包括作为SEQ ID NO 4或5的变体的核酸。变体核苷酸序列包括因一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变体。在某些实施方案中，本发明提供与SEQ ID NOs :4、5或18有至少80%、85%、90%、95 %、97 %、98 %、99 %或100 %同一性的分离核酸序列或重组核酸序列。本领域普通技术人员应理解的是，与SEQ ID NOs :4、5或18互补的核酸序列和SEQ ID NOs :4、5或18的变体也在本发明的范围内。在其它实施方案中，本发明的核酸序列可被分离、重组和/或与异源核苷酸序列融合，或存在于DNA文库中。在其它实施方案中，本发明的核酸还包括核苷酸序列和由这类核酸编码的ActRIIb多肽，所述核酸在高严格条件下与SEQ ID NOs :4、5或18所指定的核苷酸序列、SEQID NOs :4、5或18的互补序列或前述任一种的片段杂交。如上所述，本领域的普通技术人员可容易理解的是，可以改变促进DNA杂交的适当严格性条件。本领域的普通技术人员应容易地理解的是，可以改变促进DNA杂交的适当严格性条件。例如，可在6. Ox氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下于约45°C进行杂交，接着2. Ox SSC于50°C洗涤。例如，可从约2. Ox SSC于50°C的低严格性到约0. 2x SSC于50°C的高严格性，选择洗涤步骤的盐浓度。另外，可从室温(约22°C)下的低严格性条件提高洗涤步骤的温度到约65°C下的高严格性条件。温度和盐两者均可改变，或者可保持温度恒定或盐浓度恒定，而改变另一个变量。在一个实施方案中，本发明提供在6x SSC于室温的低严格性条件下杂交接着2x SSC于室温洗涤的核酸。因遗传密码简并而不同于SEQ ID NOs :4、5或18所示核酸的分离核酸也在本发明的范围内。例如，多种氨基酸用不只一个三联体指定。限定同一氨基酸的密码子或同义密码子(例如CAU和CAC是组氨酸的同义密码子)，可导致不影响蛋白质的氨基酸序列的“沉默”突变。然而，预期在哺乳动物细胞中可存在确实引起主题蛋白质氨基酸序列改变的DNA序列多态性。本领域技术人员应理解的是，由于天然等位基因变化所致，在给定物种的个体之间，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(多至约3-5%的核苷酸)中可存在这些变化。任何和所有这类核苷酸变化和所得氨基酸多态性也在本发明的范围内。在某些实施方案中，在表达构建体中，本发明的重组核酸可与一个或多个调节核苷酸序列有效连接。调节核苷酸序列一般可适于用于表达的宿主细胞。本领域已知用于各种宿主细胞的合适表达载体和合适调节序列的许多类型。所述一个或多个调节核苷酸序列通常可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始序列和终止序列及增强子或激活物序列。本发明考虑本领域已知的组成型启动子或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或将不止一个启动子的元件组合的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞的附加体(例如质粒)上，或者表达构建体可被插入染色体中。在一个优选的实施方案中，表达载体含有选择标记基因以供转化宿主细胞的选择。选择标记基因是本领域众所周知的，并可随所采用的宿主细胞而改变。
在本发明的某些方面，在包含编码ActRIIb多肽并与至少一个调节序列有效连接的核苷酸序列的表达载体中提供主题核酸。调节序列是本领域公认的，并被选择来指导表达ActRIIb多肽。因此，术语调节序列包括启动子、增强子和其它表达调控元件。示例性的调节序列披露于 Goeddel ;Gene Expression Technology Methods in Enzymology,Academic Press, San Diego, CA (1990)。例如，当与DNA序列有效连接时控制DNA序列表达的各种表达调控序列的任一种，可用于这些载体以表达编码ActRIIb多肽的DNA序列。这类有用的表达调控序列包括例如SV40的早期启动子和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达受I7RNA聚合酶指导的17启动子、噬菌体\的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的调控区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶启动子(例如Pho5)、酵母a -交配因子启动子、杆状病毒系统的多角体(polyhedron)启动子和已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列及其各种组合。应当理解的是，表达载体的设计可取决于以下这类因素，例如待转化的宿主细胞的选择和/或欲表达的蛋白质类型。此夕卜，还应考虑载体拷贝数、控制该拷贝数的能力和由该载体编码的任何其它蛋白质例如抗生素标记的表达。可通过将克隆的基因或其部分连接到适于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中来产生本发明的重组核酸。用于产生重组ActRIIb多肽的表达载体包括质粒和其它载体。例如，合适的载体包括用于在原核细胞(例如大肠杆菌)中表达的以下类型的质粒pBR322衍生质粒、pEMBL衍生质粒、pEX衍生质粒、pBTac衍生质粒和pUC衍生质粒。一些哺乳动物表达载体既含有利于载体在细菌中繁殖的原核序列，又含有在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2_dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo 和 pHyg 衍生载体是适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体的一些用来源于细菌质粒(例如PBR322)的序列修饰，以利于在原核细胞和真核细胞两者中复制和进行药物抗性选择。或者，可使用诸如牛乳头瘤病毒(BPV-I)或埃巴病毒(pHEBo、pREP衍生物和p205)等病毒衍生物在真核细胞中瞬时表达蛋白质。其它病毒(包括反转录病毒)表达系统的实例可见下面基因疗法递送系统中的描述。用于质粒制备和宿主生物转化中的各种方法是本领域众所周知的。对于原核和真核细胞两者的其它合适的表达系统以及通用重组方法，参见Molecular CloningA Laboratory Manual,第 3 版，编辑 Sambrook,Fritsch 和 Maniatis (Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001) 在某些情况下,可能需要通过利用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。这类杆状病毒表达系统的实例包括PVL衍生载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生载体(例如pAcUWl)和pBlueBac衍生载体(例如含P -gal的pBlueBacIII)。在一个优选的实施方案中，可设计在CHO细胞中产生主题ActRIIb多肽的载体，例如 Pcmv-Script 载体(Stratagene, La Jolla, Calif.) > pcDNA4 载体(Invitrogen,Carlsbad, Calif.)和 pCI-neo 载体(Promega, Madison, Wise.)。显然，在培养基中繁殖的 细胞中，可使用主题基因构建体使主题ActRIIb多肽表达，例如以产生蛋白质(包括融合蛋白或变体蛋白质)以便纯化。本公开内容还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包括一种或多种主题ActRIIb多肽的编码序列(例如SEQ ID NO :4、5或18)。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，可在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如利用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达本发明的ActRIIb多肽。其它合适的宿主细胞为本领域技术人员所知。因此，本发明还涉及产生主题ActRIIb多肽的方法。例如，可将用编码ActRIIb多肽的表达载体转染的宿主细胞培养在允许ActRIIb多肽表达发生的合适条件下。可使ActRIIb多肽分泌并从细胞和含有ActRIIb多肽的培养基的混合物中分离出来。或者，可将ActRIIb多肽保持在胞质中或保持在膜部分中，然后收获、裂解细胞并分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其它副产品。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。可采用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术，包括离子交换层析法、凝胶过滤层析法、超滤法、电泳、使用对ActRIIb多肽的特定表位有特异性的抗体进行免疫亲和纯化以及用结合与ActRIIb多肽融合的结构域的物质进行亲和纯化(例如A蛋白柱可用来纯化ActRIIb-Fc融合物)，将主题ActRIIb多肽从细胞培养基、宿主细胞或两者中分离出来。在一个优选的实施方案中，ActRIIb多肽是含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。在一个优选的实施方案中，通过一系列的柱层析步骤达到纯化，所述步骤包括例如任何顺序的下列三种或更多种方法:A蛋白层析法、Q琼脂糖凝胶层析法、苯基琼脂糖凝胶层析法、大小排阻层析法和阳离子交换层析法。纯化可用病毒过滤和缓冲液更换来完成。任选纯化方案包括下列步骤将Tris缓冲盐溶液(pH 8. 0) (TBS)中的蛋白质加入MabSelect A蛋白柱(GE Healthcare)上、用 TBS(150mM NaCl，pH8. 0)和 TBS(50mM NaCl，pH8. 0)洗涤、用 0. ImM甘氨酸(PH3. 0)洗脱；可使洗脱液在TBS pH8. 0中流过Q琼脂糖凝胶柱，并用含有大概在200-250、210-250、220-250、210-230、215-225 或 225_235mM 之间的 NaCl 的 TBS 洗脱；可交换洗脱液入I. IM NH4SO4,50mM Tris pH8. 0中，用相同缓冲液洗涤，并用大概在200-250、210-250、220-250、210-230、215-225 或 225_235mM 之间的 NH4SO4 的磷酸缓冲盐溶液(pH7. 2或7. 4)洗脱。可对洗脱出的物质透析，进行病毒过滤，并用于最终制剂。在另一个实施方案中，编码纯化前导序列(例如重组ActRIIb多肽所需部分N端上的聚-(His)/肠激酶切割位点序列)的融合基因，可允许使用Ni2+金属树脂通过亲和层析法对表达的融合蛋白进行纯化。然后，纯化前导序列随后可通过肠激酶处理除去，得到纯化的 ActRIIb 多肽(例如参见 Hochuli 等(1987) J. Chromatography 411 :177 ;以及Janknecht 等，PNAS USA 88 :8972)。制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接按照常规技术进行，采用用于连接的平端或交错端，进行限制性内切酶消化以提供合适末端，适当时补平黏性末端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接，并进行酶促连接。在另一个实施方案中，融合基因可通过常规技术包括自动DNA合成仪合成。或者，可使用在两个连续基因片段之间产生互补突出端的锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述基因片段随后可退火得到嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in Molecular Biology,编辑 Ausubel 等，John Wiley & Sons :1992)。4.备选的激活素ActRIIb拮抗剂虽然可溶性ActRIIb多肽，特别是ActRIIb-Fc融合物是优选的拮抗剂，但是预期ActRIIb拮抗剂的其它类型是有用的，包括抑制ActRIIb产生的抗ActRIIb抗体、反义物、RNAi或核酶核酸和ActRIIb的其它抑制剂，特别是破坏ActRIIb结合的抑制剂。与ActRIIb多肽(例如可溶性ActRIIb多肽)有特异性反应并且与配体竞争结合ActRI Ib多肽或以别的方式抑制ActRI Ib介导的信号转导的抗体，可用作ActRI Ib多肽活性的拮抗剂。可通过标准方案，使用来源于ActRI Ib多肽的免疫原，制备抗蛋白质/抗肽抗血清或单克隆抗体(参见例如 Antibodies A Laboratory Manual, Harlow 和 Lane 编辑(ColdSpring Harbor Press : 1988))。哺乳动物,例如小鼠、仓鼠或兔可用免疫原形式的ActRIIb多肽、能够诱导抗体应答的抗原片段或融合蛋白免疫接种。赋以蛋白质或肽免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域众所周知的其它技术。可在佐剂存在下给予ActRIIb多肽的免疫原性部分。可通过检测血浆或血清中的抗体效价监测免疫接种的过程。可应用标准ELISA或其它免疫测定法用免疫原作为抗原评价抗体水平。在动物用ActRIIb多肽的抗原制备物进行免疫接种后，可获得抗血清，如有需要，可从血清中分离出多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，可从经免疫接种的动物中收获产抗体细胞(淋巴细胞)，并通过标准体细胞融合方法与永生化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合，得到杂交瘤细胞。这类技术是本领域众所周知的，包括例如最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术((1975) Nature, 256 :495-497);人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等(1983)Immunology Today,4 :72);以及产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer herapy, Alan R. Liss, Inc.第 77-96 页)。可按免疫化学法筛选杂交瘤细胞以产生与ActRIIb多肽特异性反应的抗体，并从包含这类杂交瘤细 胞的培养物中分离单克隆抗体。本文所用术语“抗体”旨在包括完整抗体，例如任何同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗体，并包括与选定抗原反应的免疫球蛋白的片段或结构域。可采用常规技术使抗体片段化，并针对效用和/或与特定目标表位的相互作用筛选片段。因此，该术语包括抗体分子的蛋白水解切割或重组制备的部分的区段，所述区段能够与某种蛋白质选择性反应。这类蛋白水解片段和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab' )2, Fab^、Fv和含有由肽接头连接的V[L]和/或V[H]结构域的单链抗体(scFv)。scFv可共价或非共价连接形成具有两个或更多个结合部位抗体。术语抗体还包括多克隆、单克隆或其它纯化的抗体和重组抗体制备物。术语“重组抗体”意指由采用分子生物学技术构建的核酸表达的抗体，或免疫球蛋白的抗原结合结构域，例如人源化抗体或由单链抗体产生的完全人抗体。单一结构域和单链抗体也包括在术语“重组抗体”中。在某些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体，而在某些实施方案中，本发明可获得产生新抗体的方法。例如，产生与ActRIIb多肽特异性结合的单克隆抗体的方法，可包括给予小鼠有效刺激可检测免疫应答的量的包含抗原多肽的免疫原性组合物，由小鼠得到产抗体细胞(例如得自脾的细胞)，并将产抗体细胞与骨髓瘤细胞融合，得到产抗体杂交瘤,测试产抗体杂交瘤以鉴定产生与抗原特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤。一旦得到所述杂交瘤，便可将杂交瘤在细胞培养物中增殖，任选在杂交瘤衍生细胞产生与抗原特异性结合的单克隆抗体的培养条件下增殖。可从细胞培养物中纯化出单克隆抗体。正如本领域通常理解的一样，用于提及抗体的形容词“与......特异性反应的”
意指抗体在目标抗原(例如ActRIIb多肽)与其它非目标抗原之间有足够选择性，使得所述抗体至少可用于在特定的生物样品类型中检测目标抗原的存在情况。在某些使用抗体的方法中，例如治疗应用，在结合中可能需要较高程度的特异性。单克隆抗体通常具有有效区分所需抗原和交叉反应多肽的较大趋势(与多克隆抗体相比)。影响抗体抗原相互作用的特异性的一个特征是抗体对抗原的亲和力。虽然可在不同亲和力范围内达到所需特异性，但是优选的抗体一般具有约10_6、10_7、10_8、10_9M或更低的亲和力(解离常数)。另外，用于筛选抗体以鉴定所需抗体的技术可影响所得抗体的性质。例如，如果抗体被用于在溶液中结合抗原，则可能需要测试溶液结合。可获得用于测定抗体和抗原之间相互作用以鉴定特别需要的抗体的各种不同技术。这类技术包括ELISA、表面等离振子共振结合测定法(例如Biacore 结合测定法,Biacore AB, Uppsala, Sweden)、夹心测定法(例如顺磁珠系统，IGEN International, Inc. , Gaithersburg, Maryland)、蛋白质印迹、免疫沉淀测定法和免疫组织化学法。作为ActRIIb拮抗剂的核酸化合物类别的实例包括反义核酸、RNAi构建体和催化性核酸构建体。核酸化合物可以是单链或双链的。双链化合物还可包括其中链的一条或另一条是单链的突出端区或非互补区。单链化合物可包括自我互补区，意指化合物形成具有双螺旋结构区的所谓“发夹”或“茎-环”结构。核酸化合物可包含以下核苷酸序列，其与由 不超过全长ActRIIb核酸序列或激活素。或Pe核酸序列的1000个、不超过500个、不超过250个、不超过100个、或不超过50个、35个、25个、22个、20个、18个或15个核苷酸组成的区域互补。互补区优选为至少8个核苷酸，任选约18-35个核苷酸。互补区可落入靶转录物的内含子、编码序列或非编码序列中，例如编码序列部分。核酸化合物的长度一般可为约8-约500个核苷酸或碱基对，任选长度可为约14-约50个核苷酸。核酸可以是DNA (特别对于用作反义物)、RNA或RNA: DNA杂合体。任一条链可包括DNA和RNA的混合物以及不容易归类为DNA或RNA的修饰形式。同样，双链化合物可以是DNA:DNA、DNA:RNA或RNA: RNA，任一条链还可包括DNA和RNA的混合物，以及不易归类为DNA或RNA的修饰形式。核酸化合物可包括各种修饰的任一种，包括骨架(天然核酸中的糖-磷酸酯部分，包括核苷酸间键)或碱基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一种或多种修饰。反义核酸化合物的长度可优选为约15-约30个核苷酸，并且通常含有一种或多种修饰以改进特性，例如在血清、细胞或化合物很可能被递送至的部位(例如在口服递送化合物的情况下为胃，而对吸入化合物而言为肺)中的稳定性。在RNAi构建体的情况下，与靶转录物互补的链一般是RNA或其修饰物。另一条链可以是RNA、DNA或任何其它变异物。双链或单链“发夹” RNAi构建体的双链体部分的长度一般可为18-40个核苷酸，任选长度为约21-23个核苷酸，只要它用作切酶底物即可。催化性核酸或酶促核酸(enzymatic nucleic acid)可以是核酶或DNA酶，并且还可含有修饰形式。当在生理条件下和在其中无义或有义对照几乎没有作用或者没有作用的浓度下与细胞接触时，核酸化合物可抑制靶标表达达约50^^75^^90%或更高。测试核酸化合物的作用的优选浓度为1、5和10微摩尔。也可测试核酸化合物对例如红血细胞水平的作用。在某些实施方案中，ActRIIb拮抗剂可以是拮抗激活素生物活性和/或与激活素结合的促滤泡素抑制素多肽。术语“促滤泡素抑制素多肽”包括包含促滤泡素抑制素的任何天然存在的多肽及其保持有用活性的任何变体(包括突变型、片段、融合物和肽模拟形式)的多肽，并且还包括促滤泡素抑制素的任何功能单体或多聚体。可根据之前涉及促滤 泡素抑制素和激活素相互作用的研究，鉴定保持激活素结合性质的促滤泡素抑制素多肽的变体。例如，W02008/030367公开了已表明对激活素结合很重要的特殊促滤泡素抑制素结构域(“FSD”)。如下面的SEQ ID NOs :9_11中所示，N端促滤泡素抑制素结构域("FSND"SEQID NO :9)、FSD2 (SEQ ID NO 10)和在较小程度上的FSDl (SEQ ID NO 11)表示促滤泡素抑制素内对激活素结合很重要的示例性结构域。此外，在有关ActRIIb多肽的上文中描述了制备和测试多肽文库的方法，这类方法还涉及制备和测试促滤泡素抑制素的变体。促滤泡素抑制素多肽包括由任何已知促滤泡素抑制素的序列衍生的多肽，其具有与促滤泡素抑制素多肽的序列有至少约80%同一性、任选至少85%、90%、95%、97%、99%或更大同一性的序列。促滤泡素抑制素多肽的实例包括成熟促滤泡素抑制素多肽或较短的同种型或例如W02005/025601中披露的人促滤泡素抑制素前体多肽(SEQ ID NO 7)的其它变体。人促滤泡素抑制素前体多肽同种型FST344如下MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCffLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSffTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDC SNITffKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACS sgvllevkhgscn SISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW (seq ID NO :7 ;NP_037541. I促滤泡素抑制素同种型FST344)信号肽用一条下划线表示；最后粗体字的27个残基表示相对于下列较短的促滤泡素抑制素同种型FST317 (NP_006341)的额外氨基酸。人促滤泡素抑制素前体多肽同种型FST317如下MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQAGNCffLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSffTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN(SEQ ID NO :8)
信号肽用一条下划线表示。N端促滤泡素抑制素结构域(FSND)序列如下GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCK(SEQID NO 9 ；FSND)FSDl和FSD2序列如下ETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCV (SEQ ID NO 10 ；FSD1)KTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVT(SEQ ID NO :11 ；FSD2)在其它实施方案中，用于本文的拮抗剂可以是拮抗激活素生物活性和/或与激活素结合的促滤泡素抑制素样相关基因(FLRG)和具有类似于ActRIIb-Fc的谱的其它配体。 术语“FLRG多肽”包括包含任何天然存在的FLRG多肽的多肽及保持有用活性的其任何变体(包括突变型、片段、融合物和肽模拟形式)的多肽。可采用测定FLRG和激活素相互作用的常规方法鉴定保持激活素结合性质的FLRG多肽的变体。参见例如US 6，537，966。此外，在有关ActRIIb多肽的上文中描述了制备和测试多肽文库的方法，这类方法还涉及制备和测试FLRG的变体。FLRG多肽包括衍生于任何已知FLRG的序列的多肽，其具有与FLRG多肽的序列有至少约80%同一性，任选至少85%、90%、95%、97%、99%或更大同一性的序列。人FLRG前体多肽如下MRPGAPGPLffPLPffGALAffAVGFVSSMGSGNPAPGGVCffLQQGQEATCSLVLQTDVTRAECCASGNIDTAWSNLTHPGNKINLLGFLGLVHCLPCKDSCDGVECGPGKACRMLGGRPRCECAPDCSGLPARLQVCGSDGATYRDECELRAARCRGHPDLSVMYRGRCRKSCEHVVCPRPQSCVVDQTGSAHCVVCRAAPCVPSSPGQELCGNNNVTYISSCHMRQATCFLGRSIGVRHAGSCAGTPEEPPGGESAEEEENFV(SEQID NO :12 ；NP_005851)信号肽用一条下划线表示。在某些实施方案中，促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽的功能变体或修饰形式包括具有促滤泡素抑制素多肽或FLRG多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域(例如有利于多肽的分离、检测、稳定或多聚化的结构域)的融合蛋白。有关ActRIIb多肽的上文中详细描述了合适的融合结构域。在一个实施方案中，拮抗剂是包含与Fe结构域融合的促滤泡素抑制素多肽的激活素结合部分的融合蛋白。在另一个实施方案中，拮抗剂是包含与Fe结构域融合的FLRG多肽的激活素结合部分的融合蛋白。文献中和申请人有关FLRG显示促滤泡素抑制素和FLRG对激活素A具有微微摩尔范围的亲和力，这就表明这些物质可以与ActRIIb-Fc类似的程度抑制激活素A信号转导。5.筛诜测定法在某些方面，本发明涉及ActRIIb多肽(例如可溶性ActRIIb多肽)和激活素或其它ActRIIb配体鉴定作为ActRIIb信号转导途径的激动剂或拮抗剂的化合物(物质)的用途。可对通过这种筛选法鉴定的化合物进行测试以在体外评价其调节骨生长或矿化或者刺激肌肉生长的能力。任选还可在动物模型中对这些化合物进行测试以在体内评价其调节组织生长的能力。有许多针对通过靶向ActRIIb多肽调节组织生长筛选治疗药物的方法。在某些实施方案中，可进行高通量化合物筛选以鉴定干扰ActRIIb介导的对骨或肌肉的作用的物质。在某些实施方案中，进行所述测定法以筛选和鉴定特异性抑制或降低ActRIIb多肽与激活素或另一配体结合的化合物。或者，所述测定法可用于鉴定促进ActRIIb多肽与激活素或另一配体结合的化合物。在又一个实施方案中，可通过其与ActRIIb多肽相互作用的能力来鉴定化合物。各种测定形式便可满足需要，然而根据本公开内容，本领域的普通技术人员可了解未在本文明确描述的测定形式。如本文所述，可通过任何组合化学方法产生本发明的试验化合物(物质)。或者，主题化合物可以是体内或体外合成的天然存在的生物分子。待测定其起组织生长调节剂作用的能力的化合物(物质)可通过例如细菌、酵母、植物或其它生物产生(例如天然产物)、以化学法产生(例如小分子，包括肽模拟物)或以重组法产生。本发明考虑的试验化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素和核酸分子。在一个具体的实施方案中，试验物质是有机小分子，分子量小于约2，000道尔顿。本发明的试验化合物可以单一的分散实体提供，或者以较复杂的文库提供，例如通过组合化学制备的文库。这些文库可包含例如醇、烷基齒化物、胺、酰胺、酯、醛、醚和有机化合物的其它类别。向试验系统中提供的试验化合物可呈分离形式或作为化合物的 混合物，尤其在最初的筛选步骤中。任选化合物可任选用其它化合物衍生化并具有利于化合物分离的衍生化基团。衍生化基团的非限制实例包括生物素、荧光素、洋地黄毒苷(digoxygenin)、绿色突光蛋白、同位素、聚组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S转移酶(GST)、可光活化的交联剂或其任何组合。在测试化合物文库和天然提取物的许多药物筛选程序中，需要高通量测定法以便在给定时间内使研究的化合物的数目最大化。在无细胞系统(例如可用纯化的或半纯化的蛋白质衍生)中进行的测定法，常常优选作为“初步”筛选，因为可产生无细胞系统以允许快速显现和相对容易地检测由试验化合物介导的分子靶标中的改变。此外，在体外系统中一般可忽略试验化合物的细胞毒性或生物利用度的作用，测定法反而主要集中在药物对分子靶标的作用上，如可表现在ActRIIb多肽和激活素之间结合亲和力的改变。仅举例来说，在本发明的示例性筛选测定法中，将目标化合物与通常能够与激活素结合的分离和纯化的ActRIIb多肽接触。然后向化合物和ActRIIb多肽的混合物中加入含有ActRIIb配体的组合物。ActRIIb/激活素复合体的检测和定量测定提供用于测定化合物抑制(或增强)ActRIIb多肽和激活素之间形成复合体的功效的手段。可通过从使用试验化合物的不同浓度所得到的数据绘制剂量反应曲线，来评价化合物的功效。此外，还可进行对照测定，以提供比较基线。例如，在对照测定中，将分离和纯化的激活素加入含有ActRIIb多肽的组合物中，在缺乏试验化合物时，定量测定ActRIIb/激活素复合体的形成。应理解的是，一般可以改变可使反应物混合的顺序，并且可以同时混合。此外，可使用细胞提取物和裂解物替换经纯化的蛋白质以提供合适的无细胞测定系统。可通过各种技术，检测ACTRIIb多肽和激活素之间的复合体形成。例如，可使用例如可检测标记的蛋白质,例如放射性标记(例如32P、35S、14C或3H)、荧光标记(例如FITC)或酶标记的ACTRIIb多肽或激活素，通过免疫测定或通过层析检测，定量测定复合体形成的调节。在某些实施方案中，本发明考虑在直接或间接测定ActRIIb多肽与其结合蛋白间的相互作用的程度中，采用荧光偏振测定法和荧光共振能量转移(FRET)测定法。另外，其它检测方式，例如基于光波导(PCT公布号WO 96/26432和美国专利号5，677，196)、表面等离振子共振(SPR)、表面电荷传感器和表面力传感器的检测方式都适于本发明的许多实施方案。此外,本发明考虑采用相互作用陷讲测定法(interaction trap assay),亦称“双杂合测定法(two hybrid assay) ”,鉴定干扰或增强ActRIIb多肽与其结合蛋白间的相互作用的物质。参见例如美国专利号5，283，317 ;Zervos等(1993) Cell 72 :223-232 ；Madura等(1993)J Biol Chem 268 :12046-12054 ；Bartel 等(1993)Biotechniques 14 :920-924 ；以及Iwabuchi等(1993)Oncogene 8:1693-1696)。在一个具体的实施方案中，本发明考虑采用反相双杂交系统(reverse two hybrid system)鉴定离解ActRIIb多肽与其结合蛋白间的相互作用的化合物(例如小分子或肽)。参见例如Vidal和Legrain, (1999)NucleicAcids Res 27 :919-29 ;Vidal 和 Legrain，(1999) Trends Biotechnol 17 :374-81 ;以及美国专利号 5，525，490,5, 955，280 和 5，965，368。在某些实施方案中，通过其与本发明的ACTRIIb或激活素多肽相互作用的能力来鉴定主题化合物。化合物和ACTRIIb或激活素多肽间的相互作用可以是共价的或非共价的。例如，可采用体外生化方法在蛋白质水平上鉴定这类相互作用，包括光致交联、放射性 同位素标记配体结合和亲和层析法(Jakoby WB等，1974, Methods in Enzymology 46:1)。在某些情况下，可在基于机制的测定法中筛选化合物，例如检测与激活素或ActRIIb多肽结合的化合物的测定法。这可包括固相或液相结合事件。或者，可将编码激活素或ActRIIb多肽的基因与报道系统(例如￠-半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白)转染至细胞，优选通过高通量筛选针对文库进行筛选或用文库的各个成员进行筛选。可采用基于其它机制的结合测定法，例如检测自由能变化的结合测定法。结合测定法可用固定于孔、珠粒或芯片或被固定化抗体俘获或被毛细管电泳分离的靶标进行。一般可采用比色法或荧光法或表面等离振子共振检测结合的化合物。在某些方面，本发明提供用于调节(刺激或抑制)骨形成和增加骨质量的方法和物质。因此，可在体外或体内在完整细胞或组织中测定所鉴定的任何化合物，以证实其调节骨或软骨生长的能力。本领域已知的各种方法可用于此目的。例如，可在基于细胞的测定法中，通过测定Msx2的诱导或骨原细胞分化成成骨细胞，来测定ActRIIb或激活素多肽或试验化合物对骨或软骨生长的作用(参见例如Daluiski 等，Nat Genet. 2001,27(1) :84-8 ；Hino 等，Front Biosci. 2004,9 :1520-9)。基于细胞的测定法的另一个实例包括分析间充质祖细胞和成骨细胞中主题ActRIIb或激活素多肽和试验化合物的成骨活性。举例来说，可构建表达激活素或ActRIIb多肽的重组腺病毒以感染多能间充质祖细胞C3H10T1/2细胞、前成骨细胞C2C12细胞和成骨细胞TE-85细胞。然后通过测定碱性磷酸酶、骨钙蛋白和基质矿化的诱导，来测定成骨活性(参见例如Cheng 等，J bone Joint Surg Am. 2003,85-A(8) :1544-52)。本发明还考虑测定骨或软骨生长的体内测定法。例如，Namkung-Matthai等，Bone, 28 =80-86(2001)公开了大鼠骨质疏松模型，其中研究了骨折后早期期间的骨修复。Kubo 等，Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68 197-202 (1999)也公开了大鼠骨质疏松模型，其中研究了骨折后晚期期间的骨修复。Andersson等，J. Endocrinol. 170 529-537披露了小鼠骨质疏松症模型，其中小鼠卵巢被切除，这引起小鼠丧失大量的骨矿物质含量和骨矿物质密度，其中骨小梁失去大约50%的骨矿物质密度。可通过给予诸如甲状旁腺激素等因子，提高切除卵巢小鼠的骨密度。在某些方面，本发明采用本领域已知的骨折愈合测定法。这些测定法包括骨折技术、组织学分析和生物力学分析，可参见例如美国专利号6，521，750，其通过引用其有关引起骨折以及测定骨折程度的实验方案和修复方法的公开内容以其整体结合。在某些方面，本发明提供例如通过拮抗ActRIIb多肽和/或ActRIIb配体的功能而刺激肌肉生长和增加肌肉质量的方法和物质。因此，可在体外或体内在完整细胞或组织中测定所鉴定的任何化合物，以证实其调节肌肉生长的能力。本领域已知的各种方法均可用于此目的。例如，进行本发明的方法，使得降低或抑制经由 通过与ActRIIb配体(例如⑶F8)结合而激活的ActRIIb蛋白的信号转导。应认识到，与其中经由ActRIIb蛋白的信号转导不受如此影响的相应生物(或生物群)的肌肉质量相比，生物中肌肉组织的生长可导致生物肌肉质量增加。例如，可通过测定与肌源细胞增殖有关的Pax-3和Myf-5的基因表达，以及与肌肉分化有关的MyoD的基因表达，来确定ActRIIb多肽或试验化合物对肌肉细胞生长/增殖的作用(例如Amthor等，Dev Biol. 2002，251 :241-57)。已知GDF8减量调节Pax-3和Myf-5的基因表达，并防止MyoD的基因表达。预期ActRIIb多肽或试验化合物拮抗⑶F8的这种活性。基于细胞的测定法的另一个实例包括在ActRIIb多肽或试验化合物存在下测定成肌细胞(例如C (2) C (12)成肌细胞)的增殖(例如Thomas等，J Biol Chem. 2000，275 40235-43)。本发明还考虑测定肌肉质量和强度的体内测定法。例如，Whittemore等人(Biochem Biophys Res Commun. 2003, 300 :965-71)公开了在小鼠中测定增加的骨骼肌质量和提高的握力的方法。任选这种方法可用于测定试验化合物(例如ActRIIb多肽)对肌肉疾病或病况例如肌肉质量正在减少的疾病的治疗效果。要理解的是，本发明的筛选测定法不仅仅适用于主题ActRIIb多肽和ActRIIb多肽的变体，而且还适用于包括ActRIIb多肽的激动剂和拮抗剂的任何试验化合物。此外，这些筛选测定法可用于药物靶验证和质量控制目的。6.示例件治疗应用在某些实施方案中，本发明的ActRIIb拮抗剂(例如ActRIIb多肽)可用于刺激合成代谢性骨生长、治疗溶骨性骨肿瘤和/或治疗或预防可获益于肌肉生长的疾病或病况。在某些实施方案中，ActRIIb拮抗剂，特别是ActRIIb-Fc构建体，可用于治疗或预防癌症相关骨丢失。在某些实施方案中，本发明提供通过给予有需要的个体治疗有效量的ActRIIb拮抗剂，特别是ActRIIb多肽，治疗或预防所述个体的骨损伤的方法。在某些实施方案中，本发明提供通过给予有需要的个体治疗有效量的ActRIIb拮抗剂，特别是ActRIIb多肽，促进所述个体的骨生长或矿化的方法。这些方法优选目的在于动物(更优选人)的治疗性和预防性治疗。在某些实施方案中，本公开内容提供ActRIIb拮抗剂(特别是可溶性ActRIIb多肽和靶向ActRIIb的中和抗体)用于治疗与低骨密度或骨强度降低相关的病症的用途。本文所用“预防”病症或病况的治疗药是指以下化合物，其在统计样本中，与未治疗对照样品相比，减少治疗样品中的病症或病况的发生，或者与未治疗对照样品相比，延缓病症或病况的一种或多种症状的发作或者降低病症或病况的一种或多种症状的严重程度。本文所用术语“治疗”包括指定病况的预防或者病况一旦确立便改善或根除病况。在任一情况下，可通过医师给出的诊断和给予治疗药物的预期结果来分辨预防或治疗。
本公开内容提供诱导骨和/或软骨形成、预防骨丢失、增加骨矿化或预防骨去矿化的方法。例如，主题ActRIIb拮抗剂已用于治疗骨质疏松症及人和其它动物的骨折和软骨缺陷的愈合。ActRIIb多肽可用于诊断为亚临床低骨密度的患者，作为针对形成骨质疏松症的预防措施。在一个具体的实施方案中，本发明的方法和组合物可在人和其它动物的骨折和软骨缺陷的愈合中具有医疗用途。主题方法和组合物还可在闭合性和开放性骨折复位术以及改进人工关节固定方面具有预防用途。由成骨剂(osteogenic agent)诱导的从头骨形成有助于先天性、创伤诱发的或肿瘤切除术诱发的颅面缺陷的修复，并且也可用于美容整形手术。在某些情况下，主题ActRIIb拮抗剂可提供吸引成骨细胞、刺激成骨细胞生长或诱导成骨细胞祖细胞分化的环境。本发明的ActRIIb拮抗剂还可用于治疗骨质疏松症。本发明的方法和组合物可用于特征是骨丢失或引起骨丢失的病况，例如骨质疏松症(包括继发性骨质疏松症)、甲状旁腺功能允进、库欣病(Cushing’s disease)、佩吉特病 (Paget’ s disease)、甲状腺毒症、慢性腹泻状态或吸收不良、慢性肾病、肾小管性酸中毒或神经性厌食症。骨质疏松症可由多种因素引起或与多种因素有关。作为女性，特别是绝经后女性，体重轻和过着久坐生活方式均是骨质疏松症因素(导致骨折风险的骨矿物质密度丢失)的风险。具有任一种以下特征的人均可以是用ActRIIb拮抗剂治疗的候选人绝经后女性且未采用雌激素或其它激素替代疗法；有个人或母亲髋骨折史或吸烟史的人；个高(超过5英尺7英寸)或瘦(小于125磅)的绝经后女性；患有骨丢失相关临床病况的男性；使用已知引起骨丢失的药物的人，包括皮质甾类(例如Prednisone )、各种抗癫痫药(例如Dilantin 和某些巴比妥类)或高剂量甲状腺替代药物；患有肝病或骨质疏松症家族史的人；患有高骨更新的人(例如尿样中胶原过量)；患有甲状腺病况(例如甲状腺功能亢进)的人；仅轻微创伤后便遭受骨折的人；具有脊椎骨折X射线证据或骨质疏松症的其它体征的人。如上所述，骨质疏松症还可以是与另一种病症有关的病况的结果或者是因使用某些药物的结果。由药物或另一种医学病况引起的骨质疏松症称为继发性骨质疏松症。在称为库欣病的病况中，由机体产生的过量皮质醇引起骨质疏松症和骨折。与继发性骨质疏松症有关的最普通的药物是皮质留类，一种像由肾上腺天然产生的激素皮质醇一样起作用的药物类别。虽然骨骼发育需要适当水平的甲状腺激素(其由甲状腺产生)，但过量的甲状腺激素可随时间减少骨质量。可引起继发性骨质疏松症的其它药物包括用于预防癫痫发作的苯妥英(Dilantin)和巴比妥类；甲氨蝶呤(Rheumatrex, Immunex, Folex PFS),一种用于某些形式的关节炎、癌症和免疫疾病的药物；环孢菌素(Sandimmune, Neoral), —种用于治疗某些自身免疫病和抑制器官移植患者的免疫系统的药物；促黄体激素释放激素激动剂(Lupron、Zoladex),用于治疗前列腺癌和子宫内膜异位症；肝素(Calciparine、Liquaemin),—种抗凝药；以及消胆胺(Questran)和考来替泊(Colestid),用于治疗高胆固醇。由癌症疗法引起的骨丢失是普遍认可的，称为癌症疗法诱发性骨丢失(CTIBL)。骨转移可在骨中产生空腔，这可通过用ActRIIb拮抗剂治疗来纠正。在一个优选的实施方案中，本文公开的ActRIIb拮抗剂，特别是可溶性ActRIIb，可用于癌症患者。如本文证实的一样，ActRIIb-Fc融合蛋白能够促进人患者的合成代谢性骨生长。已经证实，骨同化激素类药(anabolic bone agent)可用于治疗多发性骨髓瘤(参见例如 Yaccoby 等，Blood, 109 (5) :2106-11 (2007) ;0yajobi 等，Br J Haematol. 139 (3)434-8 (2007) ；Fulciniti 等，Blood, 114(2) :371-9(2009) ； Stewart 等，Journal ofCellular Biochemistry 98:1-13(2006))。因此,本文所述激活素-ActRIIb拮抗剂被认为可用于治疗多发性骨髓瘤和其它骨肿瘤。某些肿瘤(例如前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、多发性骨髓瘤或引起甲状旁腺功能亢进的任何肿瘤)患者处于由肿瘤诱发性骨丢失以及骨转移和治疗药物所致骨丢失的高风险之中。即使在没有骨丢失或骨转移的迹象的情况下，这类患者也可用ActRIIb拮抗剂治疗。还可监测患者的骨丢失或骨转移的迹象，并可在指示物表明风险增加的情况下，用ActRIIb拮抗剂治疗。一般采用DEXA扫描评价骨密度的改变，同时可使用骨重建的指示物评价骨转移的可能性。可监测血清标志物。骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)是一种存在于成骨细胞中的酶。患有骨转移和导致骨重建增加的其它病况的患者中，BSAP的血液水平升高。骨钙蛋白和前胶原肽也与骨形成和骨转移有关。在患有由前列腺癌引起的骨转移的患者中检出BSAP增加，在乳癌所致骨转移中增加的程度较低。在已转移至骨的前列腺癌中，骨形态发生蛋白-7(BMP-7)水平高，但在由膀胱癌、皮肤癌、肝癌或肺癌所致骨转移中，骨形态发生蛋白-7不高。I型羧端端肽(ICTP)是存在于骨吸收期间形 成的胶原中的交联物。因为骨不断破坏和重建，所以ICTP可存在于整个机体中。然而，在骨转移部位，水平可显著高于正常骨的区域。在由前列腺癌、肺癌和乳癌所致骨转移中存在高水平的ICTP。另一种胶原交联物，I型N端端肽(NTx)在骨更新期间随ICTP—起产生。在由许多不同类型的癌症(包括肺癌、前列腺癌和乳癌)引起的骨转移中，NTx的量增加。同样，NTx的水平随骨转移进程提高。因此，这种标志物既可用于检测转移，又可测定疾病的程度。吸收的其它标志物包括批唳诺林(pyridinoline)和脱氧批唳诺林。吸收标志物或骨转移标志物的任何增加都表明患者需要ActRIIb拮抗剂治疗。由于ActRIIb-Fc对成骨细胞活性的标志物(例如BSAP水平)具有明显作用，所以ActRIIb-Fc分子特别可用于与癌症有关的骨丢失背景，其中骨病具有溶骨性质，而不是成骨性质。这通常对多发性骨髓瘤和因各种肿瘤所致骨转移而言是正确的。然而，前列腺癌所致骨转移特别有成骨性的倾向，而在这种背景下，ActRIIb-Fc融合蛋白可能不是有益的。ActRIIb拮抗剂可与其它药剂一同给予。可通过给予单一共制剂、同时给予或在不同时间给予实现共同给药。ActRIIb拮抗剂如果与其它骨活性剂一起给予，则可以是特别有利的。患者可获益于联合接受ActRIIb拮抗剂和服用钙补充剂、维生素D、适当运动和/或在一些情况下的其它药物。其它药物的实例包括二膦酸盐(阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐和利塞膦酸盐)、降钙素、雌激素、甲状旁腺激素和雷洛昔芬。二膦酸盐(阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐和利塞膦酸盐)、降钙素、雌激素和雷洛昔芬影响骨重建周期，被归类为抗吸收药物。骨重建包括两个截然不同的阶段骨吸收和骨形成。抗吸收药物减慢或终止骨重建周期的骨吸收部分，但不减慢该周期的骨形成部分。因此，以比骨吸收大的速度持续新的形成，而且骨密度可随时间增加。特立帕肽，一种甲状旁腺激素形式，在骨重建周期中提高骨形成的速度。阿仑膦酸盐获准用于预防(5mg/天或一周一次35mg)和治疗(IOmg/天或一周一次70mg)绝经后骨质疏松症。阿仑膦酸盐减少骨丢失，增加骨密度和降低脊柱、腕和髋骨折的风险。阿仑膦酸盐还获准用于治疗由于长期使用这些药物(即泼尼松和可的松)所致男性和女性的糖皮质激素诱发性骨质疏松症及用于治疗男性骨质疏松症。阿仑膦酸盐加维生素D获准用于治疗绝经后女性的骨质疏松症(70mg —周一次加维生素D)，以及用于治疗以改善患有骨质疏松症的男性的骨质量。伊班膦酸盐获准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。一月一次以丸剂服用(150mg)，伊班膦酸盐应在每个月的同一天服用。伊班膦酸盐减少骨丢失、增加骨密度和降低脊柱骨折风险。利塞膦酸盐获准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。每日(5mg剂量)或每周(35mg剂量或35mg剂量与钙)服用，利塞膦酸盐减缓骨丢失，增加骨密度并降低脊柱和非脊柱骨折的风险。利塞膦酸盐还获准用于男性和女性以预防和/或治疗由于长期使用这些药物(即泼尼松或可的松)引起的糖皮质激素诱发性骨质疏松症。降钙素是天然存在的参与钙调节和骨代谢的激素。在绝经期后5年以上的女性中，降钙素减缓骨丢失、增加脊柱骨密度，并可缓解骨折相关疼痛。降钙素降低脊柱骨折的风险。可以注射剂(每日50-100IU)或鼻腔喷雾剂(每日200IU)获得降钙素。雌激素疗法(ET)/激素疗法(HT)获准用于预防骨质疏松症。研究表明，ET减少骨丢失，提高脊柱和髋两者的骨密度，并降低绝经后女性的髋和脊柱骨折的风险。最常以递送约每日0.3mg的低剂量或约每日0. 625mg的标准剂量的丸剂或皮肤贴剂形式给予ET，甚至在70岁以后开始给予时也 有效。当只服用雌激素时，可能增加女性发生子宫内膜癌的风险。为了排除这种风险，医疗保健人员将激素孕酮与雌激素(激素替代疗法或HT)联合开给有完整子宫的女性。ET/HT缓解绝经期症状，并显示对骨健康具有有益作用。副作用可包括阴道出血、乳房触痛、情绪障碍和胆囊疾病。雷洛昔芬，一天60mg，获准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。它来自一类针对提供雌激素的有益作用而无其潜在缺点而开发的称为选择性雌激素受体调节剂(SERM)的药物类别。雷洛昔芬提高骨质量，并降低脊柱骨折风险。尚未获得表明雷洛昔芬可降低髋骨折和其它非脊柱骨折的风险的数据。特立帕肽，一种甲状旁腺激素形式，获准用于治疗处于高骨折风险的绝经后女性和男性的骨质疏松症。这种药物刺激新骨形成，并显著增加骨矿物质密度。在绝经后女性中，在脊柱、髋、足、肋和腕中注意到骨折减少。在男性中，在脊柱中注意到骨折减少，但没有足够的数据评价其它部位的骨折减少。特立帕肽以每日注射剂自我给药长达24个月。如本文所示，ActRIIb拮抗剂还可用于促进肌肉生长，因此可用于许多肌肉相关病症。示例性的肌肉相关病况包括神经肌肉病症(例如肌营养不良和肌肉萎缩)、充血性阻塞性肺病(和与CCffD有关的肌肉消耗)、肌肉消耗综合征、肌肉衰减综合征、恶病质、脂肪组织病症(例如肥胖症)、2型糖尿病和骨变性疾病(例如骨质疏松症)。其它示例性病况包括肌肉变性病症和神经肌肉病症、组织修复(例如伤口愈合)、神经变性疾病(例如肌萎缩性侧索硬化)、免疫学病症(例如与淋巴细胞的异常增殖或功能相关的病症)和肥胖症或与脂肪细胞增殖异常相关的病症。在某些实施方案中，ActRIIb拮抗剂用作肌营养不良治疗的组成部分。术语“肌营养不良”是指一类变性性肌肉疾病，其以骨骼肌以及有时为心肌和呼吸肌逐渐弱化和衰退为特征。肌营养不良是遗传病症，其特征是以微观肌肉变化开始的进行性肌肉消耗和衰弱。当肌肉随时间退化时，人肌肉强度下降。可用包括主题ActRIIb多肽的方案治疗的示例性的肌营养不良包括杜兴肌营养不良(DMD)、贝克尔肌营养不良(BMD)、埃-德肌营养不良(EDMD)、肢带肌营养不良(LGMD)、面肩胛肱骨肌营养不良(FSH或FSHD)(亦称为Landouzy-Dejerine)、强直性肌营养不良(MMD)(亦称为斯坦内特病(Steinert' sDisease))、眼咽肌营养不良(OPMD)、远端肌营养不良(DD)、先天性肌营养不良(CMD)。法国神经学家Guillaume Benjamin Amand Duchenne最早在1860年代描述了杜兴肌营养不良(DMD)。贝克尔肌营养不良(BMD)以德国医生Peter Emil Becker命名，他最早在1950年代描述了这种DMD的变体。DMD是男性中最常见的遗传疾病之一，1/3，500个男孩受其之累。当位于X染色体短臂的肌养蛋白基因断裂时，即发生DMD。由于男性只携带一个拷贝的X染色体，因此只有一个拷贝的肌养蛋白基因。在无肌养蛋白的情况下，在收缩和松弛循环期间，肌肉容易受损。虽然在疾病早期肌肉被再生补偿，但以后肌肉祖细胞无法跟上继续进行的损害，而且健康肌肉被无功能的纤维脂肪组织代替。对肌肉和骨的双重作用可用于肌营养不良患者。BMD由肌养蛋白基因的不同突变引起。BMD患者具有一些肌养蛋白，但或是量不足够，或是品质低下。具有一些肌养蛋白保护BMD患者的肌肉不像患有DMD的人的肌肉那些严重地或快速地变性。 例如，最新研究表明，体内阻断或消除⑶F8( —种ActRIIb配体)的功能可有效治疗DMD和BMD患者中的至少某些症状。因此，主题ActRIIb拮抗剂可用作⑶F8抑制剂(拮抗剂)，并在DMD和BMD患者中构成体内阻断GDF8和/或ActRIIb的功能的备选方法。已表明在肌营养不良小鼠模型中，ActRIIb-Fc蛋白增加肌肉质量(参见美国公布号2009/0005308)。类似地，在需要肌肉生长的其它疾病状况中，主题ActRIIb拮抗剂提供增加肌肉质量的有效方法。例如ALS,亦称Lou Gehrig病(运动神经元病)是慢性、无法治愈和无法停止的攻击运动神经元(连接脑与骨骼肌的CNS组分)的CNS病症。在ALS中，运动神经元恶化，最终死亡，尽管人脑正常地保持完整功能和警觉，但运动指令从不达到肌肉。患上ALS的大多数人年龄介于40和70岁。最早弱化的运动神经元是通向臂或腿的运动神经元。ALS患者可能行走困难，他们可能掉东西，摔倒，言语含糊，并且控制不住地笑或哭。最终四肢肌肉因废用而萎缩。这种肌肉衰弱会使人变得虚弱，将需要轮椅或变得不能下床行动。大多数ALS患者从发病起3-5年内死于呼吸衰竭或死于呼吸机辅助型并发症如肺炎。已经表明，ActRIIb-Fc蛋白改善ALS小鼠模型的外观、肌肉质量和寿命(参见美国公布号2009/0005308)。ActRIIb拮抗剂诱导的肌肉质量增加还可有益于患有肌肉消耗疾病的人。已观察至IJ，GDF8表达与人的无脂肪质量反相关，而GDF8基因表达的增加与患有AIDS消耗综合征的男性的体重减轻有关。通过抑制AIDS患者的⑶F8功能，可以缓解AIDS的至少某些症状，如果不是完全消除的话，因此显著改善AIDS患者的生命质量。由于在没有营养摄取减少的情况下，⑶F8(—种ActRIIb配体)功能的丧失也与脂肪丧失有关，因此主题ActRIIb拮抗剂还可用作减慢或预防肥胖症和II型糖尿病发展的治疗药物。该方法得到本文所示数据的证实和支持，由此表明ActRIIb-Fc蛋白改善肥胖小鼠的代谢状态。癌症厌食-恶病质综合征属于癌症最使人虚弱和危及生命的方面。癌症厌食-恶病质综合征中的进行性体重减轻是许多癌症类型常见的特征，不仅仅是造成生命质量差和对化学治疗的反应差的原因，而且还是造成生存时间比患有类似肿瘤却无体重减轻的患者的生存时间短的原因。与厌食、脂肪和肌肉组织消耗、心理苦恼(psychological distress)和生命质量低下有关，恶病质是由癌症和宿主间的复杂相互作用引起的。它是癌症患者死亡最普遍的原因之一，占死亡的80%。它是影响蛋白质、糖和脂肪代谢的代谢紊乱的复杂实例。肿瘤产生直接和间接异常情况两者，导致厌食和体重减轻。目前，没有控制或逆转该进程的治疗方法。癌症厌食-恶病质综合征影响细胞因子产生、脂质动员和蛋白酶解诱导因子的释放以及中间代谢的改变。虽然厌食普遍存在，但仅食物摄取降低不能解释见于癌症患者中的机体组成的改变，而且营养摄取增加不能逆转消耗综合征。如果在6个月时间内发生的非有意的体重减轻超过发病前体重的5%，则应怀疑癌症患者有恶病质。由于已表明成年小鼠中⑶F8的全身性过量表达诱导类似于见于人恶病质综合征中的严重肌肉和脂肪丧失，主题ActRIIb拮抗剂作为药物组合物可有益地用于预防、治疗或减轻其中需要肌肉生长的恶病质综合征的症状。在其它实施方案中，本发明提供用于调节动物的体脂肪含量和用于治疗或预防其相关病况、特别是其损害健康的相关病况的组合物和方法。按照本发明，调节(控制)体重可指减轻或增加体重、降低或提高体重增加的速度或者提高或降低体重减轻的速度，并且 还包括主动保持或不显著改变体重(例如针对可能以其它方式增加或降低体重的外部或内部影响)。本发明的一个实施方案涉及通过将ActRIIb拮抗剂给予有需要的动物(例如人)来调节体重。在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于在动物中减轻体重和/或降低体重增力口，更特别是用于治疗或改善有肥胖症风险或患有肥胖症的患者的肥胖症的方法和化合物。在另一个具体实施方案中，本发明涉及用于治疗不能增加体重或保持体重的动物(例如患有消耗综合征的动物)的方法和化合物。这类方法有效增加体重和/或身体质量，或减少体重和/或质量丧失，或改善与/由不良性的低(例如不健康)体重和/或身体质量有关/引起的病况。7.给药在某些实施方案中，本公开内容提供用ActRIIb多肽给药患者的方法。本公开内容的方法包括按照给药方案，将ActRIIb蛋白给予患者，所述给药方案提供在所需时间内保持的最佳ActRIIb蛋白血清浓度。可按照方案给予患者，所述方案包括给予患者的ActRIIb多肽的量以及给予患者ActRIIb多肽的频率的所需组合。用于这类给药方案的ActRIIb多肽可以是本文公开的任何ActRIIb多肽，例如以下多肽，其包含选自SEQ IDNOs :2、3、13、17或20的氨基酸序列或包含与选自SEQ ID NOs :2、3、13、17或20的氨基酸序列有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。ActRIIb多肽可包括天然ActRIIb多肽的功能片段，例如包含选自SEQ ID NOs :1_3的序列或者缺乏C端10-15个氨基酸(“尾”)的SEQ ID NO 2序列的至少10、20或30个氨基酸的功能片段。在某些实施方案中，ActRIIb多肽包含与ActRIIb的一部分有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其中ActRIIb多肽的N端相当于选自SEQ ID NO:I的氨基酸19-25的氨基酸残基，ActRIIb多肽的C端相当于选自SEQ ID NO :1的氨基酸109-134的氨基酸残基。在优选的实施方案中，ActRIIb多肽是本文公开的ActRIIb-Fc融合蛋白。可以给予患者以达到ActRIIb多肽的最佳血清浓度。最佳血清浓度可以是例如体内足以促进所需生物作用的血清浓度。这类生物作用包括本文公开的任何治疗效果，包括促进骨生长、增加骨密度、治疗或预防与低骨密度相关的病症、治疗神经肌肉病症、脂肪组织病症、代谢紊乱、神经变性病症、肌肉消耗病症或癌症。正如本文公开的一样，当患者达到和保持至少IOii g/mL的ActRIIb多肽血清浓度时，本公开内容的ActRIIb多肽显示一致的生物功效。因此，在某些实施方案中，可按照给药方案将ActRIIb多肽给予患者，所述给药方案保持ActRIIb血清浓度为至少8 ii g/mL、10u g/mL、12. 5u g/mL、15 u g/mL、20 u g/mL>25u g/mL、30 u g/mL、35 u g/mL>40u g/mL、50 ii g/mL或至少70 ii g/mL。在某些实施方案中，可能需要将ActRIIb多肽的血清浓度保持在最佳范围内，例如保持在以下范围内约g/mL-约IOOii g/mL (例如8-100 y g/mL、8-70u g/mL、8_50 u g/mL、8_40 u g/mL、8_35 u g/mL、8_30 u g/mL、8_25 u g/mL、8_20 u g/mL>8-15 u g/mL、8-12. 5 u g/mL>8-10 u g/mL>10-100 u g/mL>10-70 u g/mL>10-50 u g/mL、10-40 u g/mL、10-35 u g/mL、10-30 u g/mL、10-25 u g/mL、10-20 u g/mL、10-15 u g/mL、10-12.5u g/mL、12-100 u g/mL、12-70 u g/mL、12-50 u g/mL、12-40 u g/mL、12-35 u g/mL、12-30u g/mL、12-25 u g/mL、12-20u g/mL、12-15 u g/mL、15-100 u g/mL、15-70 u g/mL、15-50u g/mL、15-40y g/mL、15-35y g/mL、15-30y g/mL、15-25y g/mL>15-20y g/mL、 20-70 u g/mL、20_50 u g/mL、20_35 u g/mL 或 20-30 u g/mL)。在某些实施方案中，本公开内容的给药方案包括以足以保持所需ActRIIb蛋白血清浓度持续所需时间的量和间隔给予ActRIIb多肽。在患者中保持所需ActRIIb血清浓度的所需持续时间可取决于所需生物作用(例如治疗骨病)。例如，可以足以在约一周至一年或更长的过程内保持所需血清浓度的量和间隔，将ActRIIb蛋白给予患者(例如在5天、7天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、20天、25天、30天、1_2周、I周至I月、2个月、4个月、6个月、I年或2年以上内保持所需血清浓度)。优选以足以在治疗性治疗的过程中保持所需血清浓度的量，将ActRIIb蛋白给予患者。在某些实施方案中，给药方案足以在给药间隔之间(例如在ActRIIb给药之间)保持所需的ActRIIb血清浓度。正如本文公开的一样，可以0. 3mg/kg或更大的剂量达到ActRII多肽的生物作用。因此，在某些实施方案中，可用约0. 3mg/kg至约15mg/kg(例如0. 3,0. 5、I. O、I. 5,2. 0,3. O、4. 0、5. 0、7. 0、10. 0、12. 0或15. Omg/kg)的ActRIIb多肽给药患者。在优选的实施方案中，给予患者至少I. Omg/kg。此外,下文所示实验表明，ActRIIb-Fc融合蛋白的血清半寿期介于约10和16天之间。因此，在某些方面，可至少一月一次用本公开内容的ActRIIb蛋白给药患者(例如每5-30天、10-16天、5天、7天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天一次；或以每月一次或两月一次的基础给药)。8.药物组合物在某些实施方案中，将本发明的ActRIIb拮抗剂(例如ActRIIb多肽)与药学上可接受的载体一起配制。例如，ActRIIb多肽可单独给予或作为药物制剂(治疗组合物)的组分给予。可以用于人或兽药的任何适宜的方式配制主题化合物用于给药。在某些实施方案中，本发明的治疗方法包括全身或者以植入物或装置局部给予组合物。当给药时，用于本发明的治疗组合物呈无致热原的生理学上可接受的形式。还可任选包含在上述组合物中的ActRIIb拮抗剂以外的治疗上有用的物质，在本发明方法中可与主题化合物(例如ActRIIb多肽)同时或序贯给予。
通常可胃肠外、特别是静脉内或皮下给予ActRIIb拮抗剂。适于胃肠外给予的药物组合物可包含一种或多种ActRIIb多肽以及一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水性溶液、分散体、混悬液或乳液或者无菌粉剂(所述粉剂可在临用前重构成无菌注射用溶液或分散体)，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。可用于本发明药物组合物的合适水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和注射用有机酯(例如油酸乙酯)。可通过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过保持所需要的粒径，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。另外，组合物可以递送至靶组织部位(例如骨或肌肉)的形式装入胶囊或注射。在某些实施方案中，本发明的组合物可包含基质，其能够将一种或多种治疗化合物(例如ActRIIb多肽)递送到靶组织部位(例如骨或肌肉)，为发育组织提供结构，并且最好能够被吸收进体内。例如，基质可提供ActRIIb多肽的慢释。这类基质可由目前用于其它植入 医学应用的材料形成。基质材料的选择取决于生物相容性、生物降解能力、机械性能、美容外观和界面性质。主题组合物的具体应用将界定适当的制剂。组合物可能的基质可以是生物可降解的和化学上确定的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它可能的材料是生物可降解的和生物学上明确限定的，例如骨或真皮胶原。其它基质由纯的蛋白质或胞外基质组分组成。其它可能的基质是非生物可降解的和化学上确定的，例如烧结羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。基质可由任何上述类型的材料的组合组成，例如聚乳酸和羟磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷可在组成方面改变，例如呈钙-铝酸盐-磷酸盐，并进行加工以改变孔径、颗粒大小、颗粒形状和生物降解能力。在某些实施方案中，本发明的方法可以例如以下形式口服给予胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基料，一般为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、散剂、颗粒剂，或者作为水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂、或作为水包油或油包水液体乳剂、或作为酏剂或糖浆剂、或作为软锭剂(使用惰性基料，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，各自含有预定量的物质作为活性成分。药齐U还可作为大丸剂、药糖剂或糊剂给予。在口服给药的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，可将一种或多种本发明的治疗化合物与一种或多种药学上可接受的载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下的任一种混合(I)填充剂或增充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿齐U，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土； (9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。在使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软充填和硬充填明胶胶囊剂中，相似类型的固体组合物也可用作填无剂。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分以外，液体剂型可含有常用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(具体地说为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可包含辅料，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。除活性化合物以外，混悬剂可含有助悬剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化招(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和西黄蓍胶及其混合物。本发明的组合物还可含有辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过加入多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，来确保防止微生物的作用。组合物中还可能需要包含等渗剂(例如糖、氯化钠等)。另外，可通过加入延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)，使可注射药物形式的吸收延长。 要理解的是，主治医师在考虑修正本发明的主题化合物(例如ActRIIb拮抗剂)的作用的各种因素后，可确定剂量方案。各种因素包括但不限于需要形成的骨重的量、骨密度丢失的程度、骨损伤的部位、受损骨的状况、患者的年龄、性别和饮食、可能造成骨丢失的任何疾病的严重程度、给药时间和其它临床因素。任选剂量可随用于重构的基质类型和组合物中化合物的类型而改变。向最终组合物中加入其它已知的生长因子也可影响剂量。可通过定期评价骨生长和/或修复，例如X射线(包括DEXA)、组织形态学测定和四环素标记，来监测进程。下文所示实验表明，可用lmg/kg或更高的单剂量达到ActRIIb-Fc对骨的作用。所观察到的分子的血清半寿期介于约10天和16天之间。因此可按例如一周一次或两周一次的基础给予约0. 5-5mg/kg来实现持续有效的血清水平。例如,可按每7天一次、每10天一次、每15天一次或一月一次或两月一次的基础使用0. 3,0. 5、1、2、3或5mg/kg的剂量或者介于其中的值。上文提供了其它示例性的给药方案。在某些实施方案中，本发明还提供用于体内产生ActRIIb多肽的基因疗法。这类疗法可通过将ActRIIb多核苷酸序列引入受累于上文所列病症的细胞或组织，来达到其治疗效果。可使用重组表达载体(例如嵌合病毒或胶体分散系统)实现ActRIIb多核苷酸序列的递送。优选的ActRIIb多核苷酸序列的治疗递送是使用靶向脂质体。可用于本文教导的基因疗法的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或优选RNA病毒(例如反转录病毒)。优选反转录病毒载体是鼠或禽反转录病毒的衍生物。可插入单一外源基因的反转录病毒载体的实例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus, RSV)。许多其它的反转录病毒载体可掺入多个基因。所有的这些载体可转移或整合选择标记的基因，使得可鉴定和产生转导细胞。可通过连接例如糖、糖脂或蛋白质，使反转录病毒载体具有靶标特异性。通过使用抗体来完成优选的打靶。本领域的技术人员应认识的是，可将特异性多核苷酸序列插入反转录病毒基因组或与病毒包膜连接，以供含有ActRIIb多核苷酸的反转录病毒载体的靶标特异性递送。在一个优选的实施方案中，载体靶定骨或软骨。或者，可通过常规磷酸钙转染，将组织培养细胞用编码反转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒直接转染。然后将这些细胞用含有目标基因的载体质粒转染。所得细胞释放反转录病毒载体到培养基中。ActRIIb多核苷酸的另一种靶定递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合体、纳米囊、微球、珠粒和包括水包油乳液、微团、混合微团和脂质体在内的脂质型系统。优选的本发明的胶体系统是脂质体。脂质体是可体外和体内用作递送载体的人工膜囊泡。RNA、DNA和完整病毒体可包封在水性内部，并以生物活性形式递送至细胞(参见例如Fraley等,Trends Biochem. Sci. ,6 :77,1981)。使用脂质体载体的有效基因转移方法是本领域已知的，参见例如Mannino等,Biotechniques, 6 :682,1988。脂质体的组成一般是磷脂的组合，一般与类固醇(尤其是胆固醇)组合。也可以使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在情况。可用于产生脂质体的脂质的实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆 碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。说明性的磷脂包括蛋黄磷脂酰胆碱(egg phosphatidylcholine)、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。根据例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性靶定脂质体也是可行的，并且是本领域已知的。实例现对本发明进行了大致描述，通过参照下列实施例可更容易地理解本发明，包括该实施例仅用于说明本发明的某些实施方案和实施方案的目的，并无意限制本发明。实施例I :ActRI Ib-Fc融合蛋白。申请人:构建了可溶性ActRIIb融合蛋白，其具有与人或小鼠Fe结构域融合的人ActRIIb的胞外域(之间具有最小接头(3个甘氨酸氨基酸))。构建体分别称为ActRIIb-hFc 和 ActRIIb-mFc。下面表示作为从CHO细胞系中纯化的ActRIIb-hFc (SEQ ID NO :13)GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNFRFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK使ActRIIb-hFc和ActRIIb-mFc蛋白在CHO细胞系中表达。考虑了 3种不同的前导序列(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML) MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO :14)(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO 15)(iii)天然MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(SEQ ID NO :16)。所选形式利用TPA前导序列，并具有下列未加工的氨基酸序列MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANVELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASffRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVYSYLTYLHQDffLNGKEYKCKYSNKALPYPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO 17)该多肽由下列核酸序列(SEQ ID NO :18)编码A TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT GTGTGGAGCA GTCTTCGTTTCGCCCGGCGC CTCTGGGCGT GGGGAGGCTG AGACACGGGA GTGCATCTAC TACAACGCCAACTGGGAGCT GGAGCGCACC AACCAGAGCG GCCTGGAGCG CTGCGAAGGC GAGCAGGACAAGCGGCTGCA CTGCTACGCC TCCTGGCGCA ACAGCTCTGG CACCATCGAG CTCGTGAAGAAGGGCTGCTG GCTAGATGAC TTCAACTGCT ACGATAGGCA GGAGTGTGTG GCCACTGAGG
AGAACCCCCA GGTGTACTTC TGCTGCTGTG AAGGCAACTT CTGCAACGAG CGCTTCACTCATTTGCCAGA GGCTGGGGGC CCGGAAGTCA CGTACGAGCC ACCCCCGACA GCCCCCACCGGTGGTGGAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG TCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGACHO细胞产生的物质的N端测序揭示-GRGEAE (SEQ ID NO :19)为主要序列。值得注意的是，文献中报道的其它构建体始于-SGR...序列。纯化可通过一系列柱层析步骤实现，包括例如任何顺序的下列的3种或更多种A蛋白层析法、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、大小排阻层析法和阳离子交换层析法。纯化可用病毒过滤和缓冲液更换完成。另使ActRIIb-Fc融合蛋白在HEK293细胞和COS细胞中表达。虽然来自所有细胞系和合理培养条件的物质提供具有体内肌肉构建活性的蛋白质，但是观察到功效的变化可能与细胞系选择和/或培养条件有关。纯化按上面说明书中的描述实现。实施例2 :ActRIIb-Fc突变型的产生。申请人:在ActRIIb的胞外域中产生一系列突变，并产生了这些突变型蛋白作为胞外ActRIIb和Fe结构域之间的可溶性融合蛋白。背景ActRIIb-Fc融合物具有以下序列(Fe部分用下划线表示)(SEQ ID NO 20)SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK将各种突变(包括N端截短和C端截短)引入背景ActRIIb-Fc蛋白中。根据实施例I提供的数据，预期这些构建体，如果与TPA前导序列一起表达，将缺乏N端丝氨酸。在ActRIIb胞外域中通过PCR诱变产生突变。在PCR后，片段通过Qiagen柱纯化，用SfoI和AgeI消化，并进行凝胶纯化。将这些片段连接至表达载体PAID4 (参见W02006/012627)，使得在连接后产生与人IgGl的融合嵌合体。在转化至大肠杆菌DH5ci后，挑选菌落，并分离DNA。对于鼠构建体(mFc)，用鼠IgG2a替换人IgGl。对所有突变型进行序列核实。
在HEK293T细胞中通过瞬时转染产生所有突变型。总之，在500ml旋转瓶(spinner)中，在体积为 250ml 的 Freestyle(Invitrogen)培养基中，HEK293T 细胞以6X IO5个细胞/ml供给，并生长过夜。次日，这类细胞用DNA终浓度为0. 5ug/ml的DNA PEKl I)络合物处理。在4小时后，加入250ml培养基，使细胞生长7天。条件培养基通过离心细胞收获，并浓缩。突变型采用各种技术纯化，包括例如A蛋白柱，并用低pH(3.0)甘氨酸缓冲液洗脱。在中和后，将其针对PBS透析。还通过类似方法在CHO细胞中产生突变型。在下文描述的结合测定法和/或生物测定法中测试了突变型。在某些情况下，测定法用条件培养基而不是纯化的蛋白质进行。实施例3.⑶F-Il和激活素介导的信号转导的生物测定法。采用A-204报道基因测定法评价ActRIIb-Fc蛋白通过⑶F-Il和激活素A对信号转导的作用。细胞系人横纹肌肉瘤(来源于肌肉)。报道载体PGL3 (CAGA) 12 (披露于Dennler 等，1998，EMBO 17:3091-3100)。参见图 I。CAGA12 基序存在于 TGF-P 反应性基因(PAI-1基因)中，因此该载体对于通过Smad2和3的因子信号转导具有一般用途。第I天将A-204细胞分传入48孔板。第2 天A-204 细胞用 IOug pGL3 (CAGA) 12 或 pGL3 (CAGA) 12 (IOug) +pRLCMV(lug)和Fugene转染。第3天加入因子(稀释于培养基+0. I % BSA)。在加入细胞前，抑制剂必需与各因子预温育I小时。6小时后，细胞用PBS漂洗，并裂解细胞。接下来是萤光素酶测定。在缺乏任何抑制剂时，激活素A显示报道基因表达的10倍刺激，且 ED50 约为 2ng/ml。GDF-Il :16 倍刺激，ED50 :约 I. 5ng/ml。在本测定中，ActRIIb (R64, 20-134)是激活素、⑶F-8和OTF-Il活性的有效抑制齐U。在该测定中还测试了变体。实施例4 :人临床试验，单递增剂量。在随机双盲安慰剂对照研究中，将实施例I中描述的ActRIIb (20-134)-hFc蛋白给予人患者，进行所述研究以主要评价蛋白质在健康绝经后女性中的安全性。将48名受试者随机分配入每组各8名受试者的6组中以接受单剂量的ActRIIb-hFc或安慰剂(6名活性剂2名安慰剂)。皮下(SC)给予范围为0. 02-3. Omg/kg的剂量水平。对所有受试者进行随访57天。如果在研究登记的6个月内受试者服用影响骨代谢的药，则排除在研究参与以夕卜。根据每组进行安全性评价以确定剂量递增。除药代动力学(PK)分析外，还通过测定骨形成和骨吸收的生化标志物和FSH水平来评价ActRIIb-hFc的生物活性。
在本项研究中无严重不良事件的报道。ActRIIb-hFc的PK分析显示与剂量的线性分布，平均半寿期约10_16天(参见图2)。ActRIIb-hFc的曲线下面积(AUC)与剂量线性相关，SC给药后吸收基本完成。在较高剂量下，ActRIIb-hFc引起瘦体重(LBM)增加，正如用双能X线吸收测定法(DXA)扫描所表明的一样(参见图3)。在3mg/kg剂量后2个月，与基线相比LBM的平均增加为2. 6%(0.92kg)。安慰剂治疗组降低0.2%。在与安慰剂和较低剂量相比时，早在用ActRIIb-hFc给药后15天,较高剂量(lmg/kg和3mg/kg)下更多受试者LBM增加至少0. 5kg,这持续直至第57天(参见图4)。在给予lmg/kg和3mg/kg ActRIIb-hFc的受试者中，在脂肪代谢的血清生物标志物中测得明显的剂量依赖性变化(脂连蛋白增加，瘦蛋白减少)(参见图5和图6)。ActRIIb-hFc引起骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)(其为合成代谢性骨生长的标志物)血清水平的快速持续的剂量依赖性增加，以及C端I型胶原端肽(CTX)(其是骨吸收的标志物)的剂量依赖性降低(参见图7和图8)。BSAP水平显示在最高药物剂量下接近饱和的作用，表明了在lmg/kg或更低剂量下可达到对这种合成代谢骨生物标志物的半最大效应。这些骨生物标志物变化在所测的最高剂量水平下持续约57天。血清FSH水平也有剂量依 赖性降低，与激活素的抑制一致(参见图9)。在lmg/kg和3mg/kg单剂量的ActRIIb-hFc后29天，通过磁共振成像(MRI)观察到大腿肌肉体积增加，与安慰剂相比，在最高剂量(3mg/kg)下显著增加(参见图10)。具体地讲，在给予单剂量的3mg/kgActRIIb-hFc后29天观察到,肌肉面积增加16. 4%,肌肉体积增加11. 5%，皮下脂肪降低2. 2%。与安慰剂相比，lmg/kg和3mg/kg剂量水平第29天时大腿肌肉体积自基线的平均变化百分比见图11。对于所测剂量水平范围，给予健康绝经后女性单剂量的ActRIIb-hFc是安全的且耐受良好。该临床试验表明，在人中，ActRIIb-hFc是骨同化激素类药，在骨形成增加和骨吸收降低两方面具有生物学证据。ActRIIb-hFc还增加肌肉大小和功能。实施例5 :人临床试验，多递增剂量。在健康绝经后女性中进行了随机双盲安慰剂对照的多剂量的剂量递增研究，以主要评价ActRIIb-hFc的安全性、耐受性、PK和作用。研究包括6组，每组10名受试者。每组中受试者随机接受ActRIIb-hFc或安慰剂(每组8名活性剂和2名安慰剂受试者)。如下给药各组第I组(0. lmg/kg)、第2组(0. 3mg/kg)和第3组(lmg/kg)在第I、15和29天每隔14天皮下(SC)接受ActRIIb-hFc共3个剂量。第4组(lmg/kg)、第5组(2mg/kg)和第6组(3mg/kg)在第I和29天每28天SC接受ActRIIb-hFc共2个剂量。对下列数据进行评价不良事件、临床实验室试验(血液学、化学、尿分析、内分泌功能试验、肾上腺功能试验、ACTH刺激试验)、生命体征包括仰卧(至少5分钟后)和站立(2分钟±30秒后)血压、ECG、超声心动图(ECHO)、身体检查和抗药物抗体。药代动力学血清ActRIIb-hFc浓度曲线下面积(AUC)、峰值浓度(Cmax)、至峰值浓度时间(Tmax)、清除半衰期(tl/2)、清除率(C1/F)和分布容积(Vz/F)。药效学FSH、通过全身DXA扫描测定的瘦体重、通过腰脊柱、髋部和全身DXA扫描测定的骨矿物质密度(BMD)、第3-6组中通过MRI扫描测定的肌肉大小和药效作用的其它标志物。如图14所示，ActRIIb-hFc的血清浓度与剂量和频率有关。值得注意的是，每隔28天给予2mg/kg和3mg/kg剂量达到有明显峰谷的高峰浓度。每隔14天给予lmg/kg剂量达到有较小峰谷的上升浓度。第2个剂量后，每隔14天给予lmg/kg保持患者的平均血清浓度高于约12微克/mL，而每隔28天给予2mg/kg和3mg/kg剂量分别具有平均值约8和10微克/mL的峰谷。如图15所示，血清浓度的峰谷反映在对FSH的作用中。FSH产生被认为是由激活素刺激的，因此预期激活素拮抗剂(例如ActRIIb-hFc)的使用抑制FSH产生。实际上，所有剂量的ActRIIb-hF都显示对FSH有一定抑制。通过图15中X轴下方的迹线下降来显示这一点。有趣的是，在给药期间，每隔14天给予lmg/kg剂量未显示FSH抑制的平均减弱，而每隔28天给予2mg/kg和3mg/kg剂量的确显示与血清浓度峰谷(大体在研究第15和36天之间)相应的FSH产生方面的显著增加(因此FSH阻抑降低)。我们得出以下结论，以允许血清浓度下降低至8或10微克/mL的方式给予ActRIIb-hFc蛋白引起由药物所致的激活素信号转导阻抑的短暂释放，以及可能的其它配体(例如肌肉生长抑制素或GDF-11)的阻抑的短暂释放。值得注意的是，与较不频繁的2mg/kg和3mg/kg剂量相比，每隔14天给予lmg/kg剂量似乎引起肌肉质量较大增加，正如通过全身瘦质量测定的一样(参见图16)。虽然每隔28天给予2mg/kg和3mg/kg剂量的患者在研究期间接受总共4mg/kg或6mg/kg的药物,但是每隔14天给予lmg/kg剂量的患者在研究期间接受总共仅3mg/kg的药物。尽管如此，较低的、更频繁的剂量对肌肉质量提供明显的较大作用(在本研究中 显示为未达到统计显著性的趋势)。预期在较低剂量下的这种良好的功效由随更频繁给药方案发生的更持续的配体阻抑所致，正如由对FSH的作用所显示的一样。因此，预期保持血清浓度在约8、10或12微克/mL以上的给药方案可根据ActRIIb-hFc作用方式提供药物的最优功效。这个结论应适于不论血清半寿期如何的多种ActRIIb-hFc蛋白，前提条件是这类蛋白质对激活素和肌肉生长抑制素/GDF-Il具有与野生型ActRIIb-hFc的亲和力处于同一范围的亲和力。通过引用结合本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其整体结合到本文中，就像每个独立出版物或专利具体而单独指明通过引用结合一样。虽然论述了主题的具体实施方案，但上述说明书是说明性的而非限制性的。当回顾本说明书和随附权利要求书时，许多变动对本领域技术人员而言将变得显而易见。应参照权利要求书及其等同内容的整个范围和说明书及这类变化来确定本发明的整个范围。
权利要求
1.一种用ActRIIb-Fc融合蛋白给药患者的方法，所述方法包括按保持ActRIIb-Fc融合蛋白的血清浓度为至少8 u g/mL的给药方案将ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
2.权利要求I的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白的血清浓度保持在至少IOiig/mL的浓度下。
3.权利要求2的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白的血清浓度保持在至少12iig/mL的浓度下。
4.权利要求3的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白的血清浓度保持在至少20u g/mL的浓度下。
5.权利要求I的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白的血清浓度保持在介于8-70 u g/mL的浓度下。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述给药方案包括将至少0.3-5mg/kg的ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
7.权利要求6的方法，其中所述给药方案包括将至少l_3mg/kg的ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
8.权利要求7的方法，其中所述给药方案包括将lmg/kg的ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述给药方案包括每隔5-30天一次将ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
10.权利要求9的方法，其中所述给药方案包括每隔10-16天一次将ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
11.权利要求10的方法，其中所述给药方案包括每隔14天一次将ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
12.权利要求I的方法，其中所述给药方案包括每隔14天一次将lmg/kg的ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述患者需要骨生长、骨密度增加或骨强度增加。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述患者患有骨相关病症。
15.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述患者患有癌症。
16.权利要求15的方法，其中所述患者患有乳癌。
17.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述患者患有与肌肉生长不足的肌肉损失有关的病症。
18.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白选自 a)包含与SEQID NO :2、3或13有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； b)包含与SEQID NO :2、3或13有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽； c)包含SEQID NO :2、3或13的氨基酸序列的多肽； d)包含SEQID NO 2的至少50个连续氨基酸的多肽；和 e)包含与ActRIIb的一部分有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，其中N端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸19-25的氨基酸残基，C端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸109-134的氨基酸残基；f)包含与ActRIIb的一部分有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽，其中N端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸19-25的氨基酸残基，C端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸109-134的氨基酸残基；和 g)包含ActRIIb的一部分的多肽，其中N端相当于选自SEQID NO :1的氨基酸19-25的氨基酸残基，C端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸109-134的氨基酸残基。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白具有一种或多种下列特性性 以至少KT7M的Kd与ActRIIb配体结合；和 抑制细胞的ActRIIb信号转导。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含与SEQID NO:3的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。
22.权利要求21的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含与SEQID NO 3的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列。
23.权利要求22的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含SEQID NO :3的氨基酸序列。
24.权利要求23的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含SEQID NO :2的氨基酸序列。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白在正常健康人中的血清半寿期介于10和16天之间。
26.一种用ActRIIb-Fc融合蛋白给药患者的方法，所述方法包括每隔5-30天一次用0.3_5mg/kg 的 ActRIIb-Fc 给药患者。
27.权利要求26的方法，其中用l_3mg/kgActRIIb给药所述患者。
28.权利要求26-27的方法，其中每隔10-16天用ActRIIb给药所述患者。
29.权利要求26-28的方法，其中所述患者需要骨生长、骨密度增加或骨强度增加。
30.权利要求26-29中任一项的方法，其中所述患者患有骨相关病症。
31.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述患者患有癌症。
32.权利要求31的方法，其中所述患者患有乳癌。
33.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述患者患有与肌肉损失或肌肉生长不足有关的病症。
34.一种用于(i)促进合成代谢性骨生长，或(ii)治疗骨肿瘤的方法，所述方法包括将有效量的ActRIIb-Fc融合蛋白给予受试者。
35.权利要求34的方法，其中所述患者患有多发性骨髓瘤。
36.权利要求34的方法，其中所述患者患有已转移至骨的癌症。
37.权利要求26-36中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白选自 包含与SEQ ID NO :2、3或13有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； 包含与SEQ ID NO :2、3或13有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；包含SEQ ID NO :2、3或13的氨基酸序列的多肽； 包含SEQ ID NO 2的至少50个连续氨基酸的多肽； 包含与ActRIIb的一部分有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，其中N端相当于选自SEQ ID NO :I的氨基酸19-25的氨基酸残基，C端相当于选自SEQ ID NO :I的氨基酸109-134的氨基酸残基； 包含与ActRIIb的一部分有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽，其中N端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸19-25的氨基酸残基，C端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸109-134的氨基酸残基；和 包含ActRIIb的一部分的多肽，其中N端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸19-25的氨基酸残基，C端相当于选自SEQ ID NO 1的氨基酸109-134的氨基酸残基。
38.权利要求26-37中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白具有一种或多种下列特性 以至少KT7M的Kd与ActRIIb配体结合；和 抑制细胞的ActRIIb信号转导。
39.权利要求26-38中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
40.权利要求26-39中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含与SEQIDNO 3的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。
41.权利要求40的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含与SEQID NO :3的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列。
42.权利要求41的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含SEQID NO 3的氨基酸序列。
43.权利要求42的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白包含SEQID NO 2的氨基酸序列。
44.权利要求34-43中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白在正常健康人中的血清半寿期介于10和16天之间。
45.权利要求34-44中任一项的方法，其中以不超过每周一次的频率将所述ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
46.权利要求34-45中任一项的方法，其中以不超过每两周一次的频率将所述ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
47.权利要求34-46中任一项的方法，其中每隔10-16天将所述ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
48.权利要求34-47中任一项的方法，其中每隔10天将所述ActRIIb-Fc融合蛋白给予患者。
49.权利要求1-48中任一项的方法，其中所述ActRIIb-Fc融合蛋白抑制骨吸收。
50.权利要求1-49中任一项的方法，其中所述患者还接受抗吸收剂。
51.权利要求50的方法，其中所述抗吸收剂是二膦酸盐物质。
52.权利要求50的方法，其中所述抗吸收剂是RANK配体拮抗剂或护骨蛋白拮抗剂。
全文摘要
在某些方面，本发明提供用于促进骨生长和增加骨密度以及用于治疗多发性骨髓瘤的组合物和方法。本发明还提供用ActRIIb拮抗剂给药患者的方法。
文档编号A61K38/18GK102781518SQ201080051617
公开日2012年11月14日 申请日期2010年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者J·克诺普夫, J·西拉, K·阿蒂 申请人:阿塞勒隆制药公司