专利名称：抗大肠杆菌TolC二十三肽的抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗大肠杆菌TolC片段的抗体。
背景技术：
近年来细菌耐药日趋严峻，成为医药界倍受关注的问题。由于抗生素滥用造成细菌耐药性问题尤为突出。我国临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位。除耐青霉素的肺炎链球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、肠球菌、真菌等多种耐药菌外，进入我国仅20多年的喹诺酮类抗生素的耐药率已经达60% - 70%。据报道，包括广州在内的国内一些大城市人群感染的金黄色葡萄球菌中，80%已经产生了对青霉素G的耐药性。凯福隆、头孢三嗪等第三代的头孢类菌抗生素的应用已日趋普遍，抗生素品种的选用明显超前。抗生素的滥用主要是由于抗生素生产和销售管理薄弱、临床的误用和滥用、以及将抗生素作为生长促进剂在动物养殖中广泛使用所导致。由于在抗生素使用与病原菌耐药水平之间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平以及耐药菌感染率的变化。由此，人和动物的肠道正常菌群暴露于抗生素而普遍产生耐药性，并通过粪便直接污染环境、水、食品，导致耐药菌不断增加，也使人体接触耐药菌的机会不断增加。因此耐药菌的种类非常广泛。这样一来，人体如果再获得耐药菌的感染治疗起来就比较困难。因此，控制目前已经广泛存在的耐药菌已成为一个重要的社会和科学问题。耐药菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的发现和发明，因为抗生素的生产与发展伴随着细菌耐药性的不断发展，一种新的抗生素投入使用后，很快就发现有相应的抗性菌株出现。在细菌中普遍存在的抗药性是对抗菌药物的生产开发及对细菌性疾病防治的一个巨大挑战，直接危害食品安全和人类健康。对细菌耐药机理的深入研究，发现其作用靶点是解决这一难题的关键。业已报道，大肠杆菌外膜蛋白TolC是耐药关键蛋白，是AcrAB-TolC药物外排系统中重要组成组分。我们先前证明，采用抗TolC可以负调TolC的耐药作用，起到靶向抑制耐药菌生长的目的，但其作用的靶序列不清楚。我们先前采用的抗TolC的抗体，是针对整个 TolC蛋白。根据生物信息分析，整个TolC蛋白具有线性B细胞表位27个，此外还有非线性B细胞表位。由于每个表位均能够刺激机体产生免疫应答，故针对整个TolC蛋白至少可以产生27个各自表位特异性的抗体。由于各表位氨基酸序列不同，其生物学功能亦具有差异，抗体作用后产生的效应亦存在差异。此外，抗体也存在一定的交叉反应，可以跨物种进行反应，即所谓的抗体异嗜性现象。因此，采用针对整个蛋白的特异性抗体，具有靶序列特异性不明确、副反应不清楚的不足，不利于其有关成药特性的研究。
发明内容
本发明的目的是在于针对现有技术的不足，提供一种针对TolC耐药关键结构域的抗体，以克服目前的抗体具有靶序列特异性不明确、副反应不清楚的的缺陷，提高抗体的有效性和安全性。
本发明通过以下技术方案实现上述目的
发明提供了一种大肠杆菌(五coh·) TolC抗原，包括如SEQ ID N0:1 (SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM)所示的序列。本发明也提供了一种抗原，由上述大肠杆菌ToIC抗原与血蓝蛋白偶连。同时发明保护了编码如权利要求1所述大肠杆菌TolC抗原的基因片段，具有SEQ ID N0:2 所示的序列。SEQ ID NO:2 5'-TCT GAC ACC TCT TAT AGC GGT TCG AAA ACC CGT GGT GCC GCT GGT ACC CAG TAT GAC GAT AGC AAT ATG -3，。上述两种抗原可用于制备抗体，所产生的抗体可以与大肠杆菌外膜蛋白TolC特异结合，从而抑制细菌的耐药性。该抗体具有针对SEQ ID NO: 1氨基酸序列的多肽，由以下方法获得根据NCBI公布的五coli K-12 TolC氨基酸序列，合成SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪片段(命名为TolC-二十三肽)，合成多肽产物与血蓝蛋白偶连以提高免疫原性。将人工合成SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段和血蓝蛋白的偶连物与福氏完全佐剂混合均勻形成油包水乳剂，注射免疫动物，注射量100微克-1 毫克/只；其后采用福氏不完全佐剂；每次间隔10-20周，第3-5次免疫后的第7-10天取血，于低温下静置，使血清自然析出。可以优选以下方法制备将人工合成SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段即TolC-二十三肽和血蓝蛋白的偶连物500μβ用水溶解成终体积500μ 作用，与福氏完全佐剂按照1:1 (ν/ν)混合均勻形成油包水，采用背部多点注射免疫动物家兔，注射量每千克动物体注射为500μβ/只(以偶连物的重量计算)；其后采用福氏不完全佐剂，每次间隔2周，第3次免疫后的第10天，心脏取血，摆成最大斜面后在 4°C冰箱中静置过夜，使血清自然析出。以未与血蓝蛋白偶连的合成多肽产物为抗原，采用 Dot-ELISA技术测定效价为1:10000。本发明提供的抗体，可用于制备抑制细菌耐药性药物；所述的细菌为大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、克氏柠檬酸杆菌、戴阿利斯特杆菌属、肺炎克雷伯菌或链霉菌。通过大量的试验证明，本发明的针对SEQ ID NO: 1氨基酸序列的多肽特异性抗体 (即抗TolC- 二十三肽)，可以与大肠杆菌TolC基因编码蛋白TolC的关键耐药结构域结合， 具有非常特异、稳定的靶向性作用，从而抑制耐药菌的耐药性。为了进一步验证发明的有效性和抗耐药机理，本发明采用基因突变技术，构建了大肠杆菌1TolC片段SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM的突变体I^olC〗。通过抑菌试验，证明该突变体的耐药功能较野生型明显下降。这些结果表明，TolC片段SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM对iTolC的耐药功能至关重要。接着制备了iTolC 片段 SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM 的抗体(抗 TolC-二十三肽)，采用体外抗体靶向疗法，证明抗TolC-二十三肽能够在含四环素的培养基中明显抑制包括耐药大肠杆菌在内的该种细菌的生长。经抗TolC-二十三肽处理后的细菌，其生长被抑制的程度与同条件培养下抗TolC处理的生长情况一致。此结果说明TolC片段 SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM 是抗 iTolC 负调 iTolC 耐药功能的作用靶点。进一步建立了大肠埃希菌外阴感染小鼠模型，通过抗TolC-二十三肽配合低浓度庆大霉素可以明显抑制小鼠外阴细菌感染的试验，进一步证明TolC片段SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪是抗TolC负调TolC作用的靶点。研究结果表明，抗TolC-二十三肽靶向疗法能够明显抑制耐药菌的生长，为耐药菌抗体靶向疗法提供了一个有效的作用靶点。本发明通过构建TolC片段的突变体TolC2，以及制备针对此片段即SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪的抗血清，寻找到最为关键的TolC抗体靶向抑制耐药菌生长的作用靶点——SEQ ID NO:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM，从而建立针对性强、目标明确的抗体靶向作用提高耐药菌对抗生素敏感性的技术方法。同时针对该结果，提供了抗 TolC- 二十三肽，作为抗大肠杆菌TolC的抗体，该抗体所针对的氨基酸序列仅为23个氨基酸，经预测不含有B细胞表位。我们制备的针对该序列的特异性抗体可灵敏而特异地结合到靶向位点上，从而克服了现有技术中的多个B细胞表位容易产生抗体异嗜性、靶序列特异性不明确、副反应不清楚等缺陷，使用更安全。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(1)本发明经过大量实验的摸索和筛选，发现抗TolC片段SEQ ID N0:1 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM的抗体对抑制细菌耐药性有重要的作用，其特异性非常强，效价高，在抑菌应用中可以大大降低抗生素的使用量；
(2)明确了所作用的靶序列位点，消除了原有针对整个蛋白质所有位点抗体可能存在的副作用，可以特异而有效地抑制细菌的耐药性蛋白的耐药功能，从而克服细菌耐药性问题；
(3)本发明所提供的抗体，比现有的抗体在作为药物的应用上，具有更高的安全性和操作性。
图1为大肠杆菌K12的 ο亿基因PCR扩增(Α)、重组子双酶切(B)及其诱导表达
(C)。图2为大肠杆菌Κ12 ο/β 基因PCR扩增(Α、Β)、重组子双酶切(C)及其诱导表达
(D)。图3为TolC2基因在基因补救菌株(Δ tolC-pET-28a~tolC2)中的表达研究，A为聚丙烯凝胶电泳分析，B为Western blotting分析。图4为最低抑菌浓度分析，其中五coli K-12为大肠杆菌k-12菌株，Δ ο亿为 io/C 基因缺失菌株，Δ io/C-pETJSa-tolC 为 Δ io/C 的补救菌株，Δ ο7^-ρΕΤ-28Β 为 Δ iWC的空载菌株，Δ io/C-pETISa-to^^为Δ iWC的长片段突变补救菌株。图5为生存率分析，其中五cWi K-12为大肠杆菌k-12菌株，Δ ο亿为 ο亿基因缺失菌株，Δ io7C,-pET-28a-tolC 为Δ tolC 的补救菌株，Δ ο7^-ρΕΤ-28Β 为Δ tolC 的空载菌株，Δ to/C-pETISa-to^^为Δ iWC的长片段突变补救菌株。图6为免疫前血清、抗TolC和抗TolC- 二十三肽对不同菌株生长的影响。图7为免疫前血清、抗TolC和抗TolC- 二十三肽对不同菌株生长的抑制率。图8为抗TolC- 二十三肽对小鼠外阴感染的治疗作用。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1
TolC基因的克隆、原核表达、蛋白纯化及兔抗血清的制备
在该实施例中，将全长的大肠杆菌TolC编码序列或片段构建入大肠杆菌蛋白质原核表达载体之中，以达到表达和提纯目的蛋白。基因编码序列如SEQ ID N0:3所示。SEQ ID NO:3
1 atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc 61 caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt 121 aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta 181 ctgccacagc taggtttagg tgcagattac acctatagca acggctaccg cgacgcgaac 241 ggcatcaact ctaacgcgac cagtgcgtcc ttgcagttaa ctcaatccat ttttgatatg 301 tcgaaatggc gtgcgttaac gctgcaggaa aaagcagcag ggattcagga cgtcacgtat 361 cagaccgatc agcaaacctt gatcctcaac accgcgaccg cttatttcaa cgtgttgaat 421 gctattgacg ttctttccta tacacaggca caaaaagaag cgatctaccg tcaattagat 481 caaaccaccc aacgttttaa cgtgggcctg gtagcgatca ccgacgtgca gaacgcccgc 541 gcacagtacg ataccgtgct ggcgaacgaa gtgaccgcac gtaataacct tgataacgcg 601 gtagagcagc tgcgccagat caccggtaac tactatccgg aactggctgc gctgaatgtc 661 gaaaacttta aaaccgacaa accacagccg gttaacgcgc tgctgaaaga agccgaaaaa 721 cgcaacctgt cgctgttaca ggcacgcttg agccaggacc tggcgcgcga gcaaattcgc 781 caggcgcagg atggtcactt accgactctg gatttaacgg cttctaccgg gatttctgac 841 acctcttata gcggttcgaa aacccgtggt gccgctggta cccagtatga cgatagcaat 901 atgggccaga acaaagttgg cctgagcttc tcgctgccga tttatcaggg cggaatggtt 961 aactcgcagg tgaaacaggc acagtacaac tttgtcggtg ccagcgagca actggaaagt 1021 gcccatcgta gcgtcgtgca gaccgtgcgt tcctccttca acaacattaa tgcatctatc 1081 agtagcatta acgcctacaa acaagccgta gtttccgctc aaagctcatt agacgcgatg 1141 gaagcgggct actcggtcgg tacgcgtacc attgttgatg tgttggatgc gaccaccacg 1201 ttgtacaacg ccaagcaaga gctggcgaat gcgcgttata actacctgat taatcagctg 1261 aatattaagt cagctctggg tacgttgaac gagcaggatc tgctggcact gaacaatgcg 1321 ctgagcaaac cggtttccac taatccggaa aacgttgcac cgcaaacgcc ggaacagaat 1381 gctattgctg atggttatgc gcctgatagc ccggcaccag tcgttcagca aacatccgca 1441 cgcactacca ccagtaacgg tcataaccct ttccgtaact ga0TolC氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。SEQ ID N0:4
1 mkkllpilig lslsgfssls qaenlmqvyq qarlsnpelr ksaadrdaaf ekinearspl 61 lpqlglgady tysngyrdan ginsnatsas lqltqsifdm skwraltlqe kaagiqdvty 121 qtdqqtliln tatayfnvln aidvlsytqa qkeaiyrqld qttqrfnvgl vaitdvqnar 181 aqydtvlane vtarnnldna veqlrqitgn yypelaalnv enfktdkpqp vnallkeaek241 rnlsllqarl sqdlareqir qaqdghlptl dltastgisd tsysgsktrg aagtqyddsn 301 mgqnkvglsf slpiyqggmv nsqvkqaqyn fvgaseqles ahrsvvqtvr ssfnninasi 361 ssinaykqav vsaqssldam eagysvgtrt ivdvldattt lynakqelan arynylinql 421 niksalgtln eqdllalnna lskpvstnpe nvapqtpeqn aiadgyapds papvvqqtsa 481 rtttsnghnp frn。. TolC基因的克隆
根据NCBI公布的大肠杆菌K12的基因序列，设计一对引物。引物序列如下正义引物 (SEQ ID N0:5) 5，-CGA GM TTC ATG CAA ATG AAG AAA-3，，反义引物(SEQ ID N0:6) 5'-GGT AAG CTT TCA GTT ACG GAA AGG G-3，。为便于克隆和表达载体的构建，在引物上分别引入限制性内酶位点^I和历‘/^111。引物由大连宝生物工程公司合成。以热变性法获得的大肠杆菌K12全基因组为模板，通过PCR反应获得目的条带(图1A，泳道1为DNA分子量标准，泳道2为目的条带)。用限制性内酶I和Λ /^ΙΙΙ分别酶切回收的DNA片断和pET-His (Novagen)表达载体，参照Takara公司的使用说明书进行连接反应，连接产物转化五coli DH5 α感受态，通过双酶切(图1Β，泳道1为DNA分子量标准，泳道2为目的条带)和序列测定重组子的正确性，结果证明与数据库公布序列完全一致。. TolC基因的表达
将正确的重组质粒以热激法转化大肠杆菌BL21表达菌，37°C培养12-16小时。接种单菌落于含氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，同时接种含有pET-HIS质粒的BL21作为对照，于301培养至00(600歷)值0.6，加入1 16 100 μ g/ mL 35°C诱导2个小时，离心收集菌体，用SDS - PAGE检测插入片段是否表达蛋白，以及表达蛋白的分子量大小。接着， 进行蛋白表达产物为可溶组分抑或是不溶组分(包涵体)的鉴定。具体过程如下将离心后沉淀重悬于1/10体积的PBS或50mmol/L Tris缓冲液(pH8. 0)中；加入溶菌酶至100 μ g/ mL，保温30分钟；反复冻融数次以破坏细胞壁，用超声波处理剪切DNA (超声波的强度以不能产生气泡为适宜；裂解的时间根据实际情况掌握，一般将云雾状的细菌悬浮物裂解至比较清朗即可);离心(12，000rpm)15分钟后将培养物分为可溶部分和不溶部分；将15 μ L上清与4 μ L 4X SDS样品缓冲液混合，将沉淀物重悬于1 X SDS样品缓冲液；将表达样品(上清及沉淀)和非表达对照物进行SDS - PAGE电泳并以考马斯亮蓝染色以便在预计分子量范围内观察表达蛋白带。经鉴定表达产物为可溶蛋白。表达后的图谱如图IC (泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2和3分别为pET_28a 和目的基因诱导表达)所示。由图可见，万.cWi K-12 iWC基因确实已经连接到pET-28a 载体上，并能在五coli BL21中成功表达，其重组蛋白大小约为53. 9kDa，与其实际分子量相符。. TolC基因产物的纯化
大量培育菌体，离心后超声处理，离心收集上清用Ni-NTA His亲和柱纯化。采用 pH5. 9 (buffer F)和pH4. 5 (buffer G)两个不同pH值的缓冲液纯化蛋白。用冲洗缓冲液 buffer E(8mol/L 尿素，0. lmol/L NaH2PO4, IOmmo 1/LTris-He 1，pH 6.3)洗涤 5 次，每次 ImL;用洗脱缓冲液 buffer F (8 mol/L 尿素，0. lmol/L NaH2PO4, 10mmol/LTris-HCl, pH 5.9)洗脱目的蛋白4次，每次lmL，收集洗脱液；用洗脱缓冲液buffer G(8M尿素，0. lmol/ L NaH2PO4,10mmol/LTris-HCl,pH 4. 5)洗脱蛋白4次，每次lmL，收集洗脱液。取收集液 进行SDS-PAGE分析。纯化蛋白进行紫外检测，测定蛋白含量。.兔抗血清的制备
将纯化蛋白溶液与福氏完全佐剂1:1 (ν/ν)混合均勻形成油包水，采用背部多点注射免疫家兔，注射量为500μβ/只；其后采用福氏不完全佐剂，每次间隔2周，第3次免疫后的第10天，心脏取血，将得到的血摆成最大斜面后在4°C冰箱中静置过夜，使血清自然析出。 通过Dot-ELISA测定效价为1:8000。分装，_80°C保存。实施例2
TolC 片段 SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪突变基因 QtolCi)的克隆
1. TolC片段突变基因tolC2引物的设计以疏水氨基酸替换为其它疏水氨基酸、亲水氨基酸替换为其它亲水氨基酸为原则， 对TolC氨基酸序列中片段SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪进行氨基酸替换，替换结果为 KRHQLRCTDE SCffVCSRPKT DQF。在基因的核苷酸序列中，找到该氨基酸序列相应的核苷酸序列(SEQ ID N0:2) :5，-TCT GAC ACC TCT TAT AGC GGT TCG AAA ACC CGT GGT GCC GCT GGT ACC CAG TAT GAC GAT AGC AAT ATG _3，，根据氨基酸的密码子，该核苷酸序列相应地被替换为(SEQ ID N0:7) :5，-AAG CGT CAT CAG CTT CGC TGC ACG CAT GAA AGC TGT TGG GTT TGT AGT CGT CCT AAG ACC CAT CAG TTT-3，。因此，根据 io/C基因的核苷酸序列进行此片段突变to/C基因(命名为tolCi) 5’端和3’端两对引物的设计(表1)，同时分别在5’正向引物及3’端反向引物中引入和Z/i/^III酶切位点(横线所示)，以进行融合PCR。tolCH端反向引物的3’端从815位核苷酸处开始，iWC2-3’端正向引物5’端从859位核苷酸处开始，因此iWC2_5’端和iWC2-3’端两条引物共有25个核苷酸的重叠， 以利于融合PCR的进行。表引物序列
权利要求
1.大肠杆菌TolC抗原，其特征在于包括如SEQID NO: 1所示的序列。
2.一种抗原，其特征在于由权利要求1所述的抗原与血蓝蛋白偶连。
3.编码如权利要求1所述大肠杆菌TolC抗原的基因片段。
4.如权利要求3所述的基因片段，其特征在于具有SEQID N0:2所示的序列。
5.如权利要求1或2所述的抗原在制备抗体方面的应用，所述抗体用于抑制细菌耐药性。
6.与权利要求1所述的大肠杆菌TolC抗原特异结合的抗体。
7.如权利要求6所述的抗体，其特征在于由以下方法获得根据NCBI公布的五coli K-12 TolC氨基酸序列，合成SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD S匪片段，合成多肽产物与血蓝蛋白偶连以提高免疫原性；将人工合成SDTSYSGSKT RGAAGTQYDD SNM片段和血蓝蛋白的偶连物与福氏完全佐剂混合均勻形成油包水乳剂，注射免疫动物，注射量100微克-1毫克/只；其后采用福氏不完全佐剂；每次间隔10-20周，第3-5次免疫后的第7-10天取血，于低温下静置，使血清自然析出。
8.如权利要求6所述的抗体在制备抑制细菌耐药性药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的细菌为大肠杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌、克氏柠檬酸杆菌、戴阿利斯特杆菌属、肺炎克雷伯菌或链霉菌。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌TolC二十三肽抗原及抗体，该抗体具有特异性针对SEQIDNO:1所示的序列。发明同时提供了编码该大肠杆菌TolC二十三抗原的基因序列；以及该抗体在制备抑制细菌耐药性药物中的应用。本发明所提供的抗TolC片段SDTSYSGSKTRGAAGTQYDDSNM的抗体，提高了细菌对抗生素的敏感度，可以特异而有效地抑制大肠杆菌的耐药外膜蛋白TolC的功能，从而克服细菌耐药性问题。本发明所提供的抗体，比现有的抗体在作为抗细菌耐药性药物的应用上，具有更高的安全性和操作性。
文档编号A61K39/40GK102153632SQ20111000226
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者吴丽娜, 张丹凤, 张炳文, 彭宣宪, 李惠 申请人:中山大学